一種檢測中華絨螯蟹胚胎冷凍后細胞骨架結構損傷的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種檢測中華絨螯蟹胚胎冷凍后細胞骨架結構損傷的方法，包括：(1)分別選取新鮮胚胎和經(jīng)過超低溫冷凍的胚胎，用B-PBS漂洗，固定，漂洗；(2)將冷凍前后胚胎的胚盤從卵中剝離；采用Triton-100在室溫下與胚胎作用，漂洗，室溫下封閉，用actin抗體在室溫下與胚胎作用，漂洗，再用標有異硫氰熒光素的羊抗兔IgG在室溫下與胚胎作用，漂洗，將胚胎吸出滴在載玻片上，載玻片上加防熒光淬滅劑，再用甘油與PBS混合液封片，觀察冷凍前后胚胎樣品熒光著色情況。本發(fā)明能準確檢測中華絨螯蟹胚胎細胞骨架結構損傷，對損傷程度進行量化，結果更直觀，更可靠，檢測準確率達到99％以上。
【專利說明】
一種檢測中華絨螯蟹胚胎冷凍后細胞骨架結構損傷的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于水產(chǎn)養(yǎng)殖種質保存領域，涉及到一種檢測中華絨螯蟹胚胎冷凍后細胞骨架結構損傷的方法。
【背景技術】
[0002]我國是一個水生生物種質資源較為豐富的國家，豐富多樣的水生生物種質資源和遺傳多樣性對于我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展起到了非常重要的作用。隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展，水生生物生存環(huán)境的嚴重惡化，過度捕撈、有害漁具漁法的運用以及水利工程建設等諸多原因，導致漁業(yè)生物資源衰退，傳統(tǒng)漁獲產(chǎn)量下降，大量水生生物處于滅絕或瀕危狀態(tài)。利用低溫生物學的原理，建立優(yōu)良養(yǎng)殖魚類或瀕臨滅絕魚類的冷凍配子庫和胚胎庫，可以實現(xiàn)對優(yōu)良魚類原良種的長期保存，避免過度捕撈、生態(tài)破壞或環(huán)境污染造成的魚類物種滅絕或因近親交配而形成的種質退化和遺傳變異現(xiàn)象。
[0003]低溫技術是一把雙刃劍，應用得當時，低溫可以長期保存生命；應用不得當，低溫又會產(chǎn)生嚴重損傷、殺死生物。近50年來，超低溫冷凍保存技術被廣泛應用于人類和很多哺乳動物的生殖繁育上，盡管超低溫冷凍保存已經(jīng)獲得了很大的成功，但這種冷凍保存技術仍然會對細胞造成致死和亞致死損傷。甲殼動物一中華絨螯蟹胚胎已冷凍保存成功，但胚胎解凍后成活率不高，結果難以重復，超低溫冷凍對其胚胎損傷機理不祥。細胞骨架是細胞的一種超微結構，是遍布于整個細胞的一種復雜的蛋白質纖維網(wǎng)絡，起支持、轉運、運動的作用，在胚胎發(fā)育中具有十分重要的作用，因此細胞骨架結構的完整性是評判胚胎冷凍損傷的重要依據(jù)。
【發(fā)明內容】
[0004]本發(fā)明提供了一種檢測中華絨螯蟹胚胎冷凍后細胞骨架結構損傷的方法，該方法能準確檢測中華絨螯蟹胚胎細胞骨架結構損傷，對損傷程度進行量化，結果更直觀，更可靠，檢測準確率達到99%以上。
[0005]本發(fā)明的一種檢測中華絨螯蟹胚胎冷凍后細胞骨架結構損傷的方法，包括:
[0006](I)分別選取中華絨螯蟹新鮮胚胎和經(jīng)過超低溫冷凍的胚胎，用B-PBS漂洗，漂洗后將2組胚胎樣品分別放入多聚甲醛中固定，再用B-PBS漂洗；
[0007](2)將冷凍前后胚胎的胚盤從卵中剝離；采用Triton-100在室溫下與胚胎作用10?20min，B-PBS漂洗，再用PBS液室溫下封閉I?2小時，用actin抗體在室溫下與胚胎作用70?80min，B-PBS漂洗，再用標有異硫氰熒光素的羊抗兔IgG在室溫下與胚胎作用35?40min，PBS漂洗，將胚胎吸出滴在載玻片上，載玻片上加防熒光淬滅劑，再用甘油與PBS混合液封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察冷凍前后胚胎樣品熒光著色情況。
[0008]所述步驟(I)和⑵中的B-PBS為含0.3%牛血清蛋白的PBS ;漂洗3次，每次1min0
[0009]所述步驟(I)中的多聚甲醛濃度為4%。
[0010]所述步驟(2)中的Triton-100的濃度為0.1%。
[0011]所述步驟⑵中的PBS液含I %牛血清蛋白和0.05% Tween20。
[0012]所述步驟(2)中actin抗體按1:80稀釋。
[0013]所述步驟(2)中異硫氰熒光素的羊抗兔IgG按1:60稀釋。
[0014]所述步驟(2)中的防熒光淬滅劑為DABC0。
[0015]所述步驟⑵中的甘油與PBS混合液中甘油與PBS的體積比為9:1。
[0016]本發(fā)明通過對中華絨螯蟹冷凍前后胚胎采用改進后的方法進行熒光染色，激光共聚焦顯微鏡觀察冷凍前后胚胎熒光信號強度和熒光量，分析冷凍前后胚胎細胞骨架結構的變化，建立檢測胚胎冷凍后細胞骨架結構損傷的方法。
_7] 有益.效果
[0018]本發(fā)明能準確檢測中華絨螯蟹胚胎細胞骨架結構損傷，對損傷程度進行量化，結果更直觀，更可靠，檢測準確率達到99%以上。
【具體實施方式】
[0019]下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
[0020]實施例1
[0021]在中華絨螯蟹繁殖季節(jié)，采集中華絨螯蟹胚胎，部分胚胎采用30% 1，2丙二醇+20%二甲基甲酰胺作為抗凍保護液，胚胎在抗凍液中按照分步平衡法平衡40min，在-196°C冷凍40min，快速解凍后用0.25mol/L的蔗糖洗脫lOmin，獲得了凍后胚胎樣品。分別選取冷凍前后胚胎各30粒，用含0.3%牛血清蛋白的PBS(B-PBS)漂洗3次，每次lOmin，漂洗后將這2組胚胎樣品分別放入4%的多聚甲醛中于4°C培養(yǎng)箱中固定3小時，再用0.3% B-PBS漂洗3次，每次lOmin。用解剖針將冷凍前后胚胎的胚盤從卵中剝離，0.1%的Triton-1OO在室溫下與胚胎作用1min進行打孔處理，處理完成后用0.3% B-PBS漂洗3次，每次1min0用含I %牛血清蛋白(BSA)和0.05% Tween20 ( —種表面活性劑)的PBS液室溫下封閉胚胎I小時，用兔抗鼠的抗體actin抗體(按1:80稀釋)在室溫下與胚胎作用70min，稀釋液為含5%山羊血清和5%二甲亞砜的Tris鹽酸緩沖液，0.3% B-PBS漂洗3次，每次lOmin，再用標有異硫氰熒光素的羊抗兔IgG(IgG-FITC)(按1:60稀釋)在室溫下與胚胎作用35min，0.3% B-PBS漂洗3次，每次lOmin。在潔凈的載玻片上加一滴防熒光淬滅劑DABCO，將處理后的胚胎轉入其中，再用甘油與PBS(體積比9:1)的混合液封片。
[0022]OLYMPUS FV-1OOO激光共聚焦顯微鏡觀察冷凍前后胚胎樣品熒光著色情況。與鮮胚相比，凍胚細胞的熒光信號減弱，就凍胚而言，熒光信號越強表明冷凍對胚胎細胞骨架結構影響越小，若熒光信號消失則表明凍胚細胞死亡；通過熒光定量分析冷凍前后胚胎熒光強度，冷凍后胚胎熒光強度越大表明胚胎細胞骨架結構越完整，受冷凍損傷越??；熒光強度越小則表明胚胎細胞骨架結構受冷凍影響越大。
[0023]運用這種方法能準確檢測中華絨螯蟹胚胎細胞骨架結構損傷，對損傷程度進行量化，結果更直觀，更可靠，檢測準確率達到99%以上。
【權利要求】
1.一種檢測中華絨螯蟹胚胎冷凍后細胞骨架結構損傷的方法，包括: (1)分別選取中華絨螯蟹新鮮胚胎和經(jīng)過超低溫冷凍的胚胎，用B-PBS漂洗，漂洗后將2組胚胎樣品分別放入多聚甲醛中固定，再用B-PBS漂洗； (2)將冷凍前后胚胎的胚盤從卵中剝離；采用Triton-1OO在室溫下與胚胎作用10?20min, B-PBS漂洗，再用PBS液室溫下封閉I?2小時，用act in抗體在室溫下與胚胎作用70?80min，B-PBS漂洗，再用標有異硫氰熒光素的羊抗兔IgG在室溫下與胚胎作用35?40min, PBS漂洗，將胚胎吸出滴在載玻片上，載玻片上加防熒光淬滅劑，再用甘油與PBS混合液封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察冷凍前后胚胎樣品熒光著色情況。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種檢測中華絨螯蟹胚胎冷凍后細胞骨架結構損傷的方法，其特征在于:所述步驟(I)和(2)中的B-PBS為含0.3%牛血清蛋白的PBS ;漂洗3次，每次1min0
3.根據(jù)權利要求1所述的一種檢測中華絨螯蟹胚胎冷凍后細胞骨架結構損傷的方法，其特征在于:所述步驟(I)中的多聚甲醛濃度為4%。
4.根據(jù)權利要求1所述的一種檢測中華絨螯蟹胚胎冷凍后細胞骨架結構損傷的方法，其特征在于:所述步驟(2)中的Triton-100的濃度為0.1%。
5.根據(jù)權利要求1所述的一種檢測中華絨螯蟹胚胎冷凍后細胞骨架結構損傷的方法，其特征在于:所述步驟(2)中的PBS液含1%牛血清蛋白和0.05% Tween20。
6.根據(jù)權利要求1所述的一種檢測中華絨螯蟹胚胎冷凍后細胞骨架結構損傷的方法，其特征在于:所述步驟(2)中actin抗體按1:80稀釋。
7.根據(jù)權利要求1所述的一種檢測中華絨螯蟹胚胎冷凍后細胞骨架結構損傷的方法，其特征在于:所述步驟(2)中異硫氰熒光素的羊抗兔IgG按1:60稀釋。
8.根據(jù)權利要求1所述的一種檢測中華絨螯蟹胚胎冷凍后細胞骨架結構損傷的方法，其特征在于:所述步驟(2)中的防熒光淬滅劑為DABC0。
9.根據(jù)權利要求1所述的一種檢測中華絨螯蟹胚胎冷凍后細胞骨架結構損傷的方法，其特征在于:所述步驟(2)中的甘油與PBS混合液中甘油與PBS的體積比為9:1。
【文檔編號】G01N21/64GK104390944SQ201410598177
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年10月30日 優(yōu)先權日:2014年10月30日
【發(fā)明者】黃曉榮, 莊平, 章龍珍, 馮廣朋, 趙峰, 劉鑒毅, 張濤, 宋超, 王妤 申請人:中國水產(chǎn)科學研究院東海水產(chǎn)研究所