一種家蠶核型多角體病毒免疫膠體金試紙條及檢測(cè)方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種家蠶核型多角體病毒免疫膠體金檢測(cè)試紙條及檢測(cè)方法，具體涉及一種免疫層析技術(shù)檢測(cè)家蠶核型多角體病毒的免疫膠體金診斷試紙條及其制備方法，屬于病毒疫病診斷【技術(shù)領(lǐng)域】；本發(fā)明所述的免疫膠體金試紙條包括：標(biāo)記抗原BmNPV-Lef4抗體的膠體金墊和包被的硝酸纖維膜，其中硝酸纖維膜上部檢測(cè)線包被兔抗BmNPV-Lef4，硝酸纖維膜下部的質(zhì)控線包被羊抗鼠IgG；該膠體金試紙條用于檢測(cè)家蠶核型多角體病毒，與傳統(tǒng)的膠體金檢測(cè)方法相比，在膠體金檢測(cè)試紙條制備時(shí)采用了雙抗體夾心法，并對(duì)兩種病毒抗體的濃度配比進(jìn)行了調(diào)試，能夠有效地保證檢測(cè)結(jié)果的特異性、靈敏度和穩(wěn)定性，其檢測(cè)靈敏度高，檢測(cè)方法簡(jiǎn)便，也是首次應(yīng)用于家蠶核型多角體病毒檢測(cè)中。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種家蠶核型多角體病毒免疫膠體金試紙條及檢測(cè)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種家蠶核型多角體病毒免疫膠體金檢測(cè)試紙條及檢測(cè)方法，具體涉及一種免疫層析技術(shù)檢測(cè)家蠶核型多角體病毒的免疫膠體金診斷試紙條及其制備方法，屬于病毒疫病診斷【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]家蠶是重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng)，所產(chǎn)蠶絲是絲綢原料的主要來(lái)源，在人類(lèi)經(jīng)濟(jì)生活與歷史文化中均具有重要的地位。然而高發(fā)的蠶病直接影響蠶繭的產(chǎn)量及質(zhì)量，制約了養(yǎng)蠶業(yè)的健康和持續(xù)發(fā)展。蠶病分傳染性蠶病和非傳染性蠶病，以傳染性蠶病危害為重。常見(jiàn)的傳染性蠶病主要是僵病、膿病、軟化病等三種。這些病的共同特點(diǎn)是潛伏期長(zhǎng)、發(fā)病快、來(lái)勢(shì)猛、范圍廣、危害性大，一般會(huì)導(dǎo)致減產(chǎn)10?20%，嚴(yán)重時(shí)高達(dá)80?90%，甚至顆粒無(wú)收，給蠶農(nóng)帶來(lái)極大的損失。而家蠶核型多角體病毒(Bombyx mori NuclearPolyhedrosisVirus,BmNPV)病是養(yǎng)蠶生產(chǎn)上最常見(jiàn)的、危害最嚴(yán)重的一類(lèi)蠶病，家蠶患此病的后期常流出膿汁，內(nèi)含大量的多角體病毒，俗稱(chēng)膿病。
[0003]目前在實(shí)際工作中用于檢測(cè)該病毒的檢測(cè)試劑盒幾乎未見(jiàn)，而實(shí)驗(yàn)室常采用的檢測(cè)技術(shù)也多為常規(guī)PCR檢測(cè)，而PCR檢測(cè)方法存在用時(shí)太長(zhǎng)、成本高、操作復(fù)雜以及不易臨場(chǎng)即時(shí)檢測(cè)等多種問(wèn)題。與之相比，免疫膠體金技術(shù)(Immune colloidal gold technique,ICG)作為一種以膠體金作為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原抗體反應(yīng)的一種新型的免疫標(biāo)記技術(shù)，是繼三大標(biāo)記技術(shù)(熒光素、放射性同位素和酶)后發(fā)展起來(lái)的固相標(biāo)記免疫測(cè)定技術(shù)，具有多項(xiàng)優(yōu)點(diǎn)，如操作簡(jiǎn)便，不需要花費(fèi)時(shí)間做培訓(xùn)；整個(gè)檢測(cè)過(guò)程耗時(shí)短，生產(chǎn)和使用成本低；免疫膠體金試紙條穩(wěn)定性好，無(wú)需冷藏；檢測(cè)對(duì)象種類(lèi)豐富，不僅用于查血、尿等，還用于查細(xì)菌、病毒等；適用于基層單位和養(yǎng)殖戶(hù)在現(xiàn)場(chǎng)做檢測(cè)和診斷。近年來(lái)，該技術(shù)在醫(yī)學(xué)、動(dòng)植物檢疫、食品安全監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。而到目前為止，該技術(shù)在家蠶核型多角體病毒(BmNPV)的檢測(cè)中尚未見(jiàn)報(bào)道，而且由于家蠶的血淋巴和組織采集方便，特別血淋巴不易凝固，可以直接采集家蠶血淋巴用于膠體金檢測(cè)中，可極大地減少操作步驟和使用成本，更便于蠶農(nóng)和一線技術(shù)人員的掌握和使用，因而該診斷膠體金試紙條具有較好的應(yīng)用前景。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)不足，提供一種快速檢測(cè)家蠶核型多角體病毒(BmNPV)的免疫膠體金檢測(cè)方法，并提供一種用于快速檢測(cè)BmNPV的免疫膠體金試紙條。采用本發(fā)明的檢測(cè)試紙條檢測(cè)BmNPV，檢測(cè)時(shí)間短，成本低，檢測(cè)結(jié)果特異，結(jié)果易判斷，實(shí)用性更強(qiáng)，非常適合基層使用。
[0005]本發(fā)明采取以下技術(shù)方案:
一種檢測(cè)家蠶核型多角體病毒的免疫膠體金試紙條，其特征在于，所述免疫膠體金試紙條包括:標(biāo)記抗原BmNPV-Lef4抗體的膠體金墊和包被的硝酸纖維膜，其中硝酸纖維膜上部檢測(cè)線包被兔抗BmNPV-Lef4，硝酸纖維膜下部的質(zhì)控線包被羊抗鼠IgG。
[0006]其中兔抗BmNPV_Lef4的濃度為I?2mg/mL,羊抗鼠IgG濃度為0.5?lmg/mL。
[0007]本發(fā)明還提供一種家蠶核型多角體病毒的快速檢測(cè)方法，其特征在于，所述的檢測(cè)方法采用檢測(cè)家蠶核型多角體病毒的免疫膠體金試紙條，具體操作如下:
(I)檢測(cè)樣品的采集:稱(chēng)取20?50mg家蠶組織置于150?250 μ L PBS緩沖液中，進(jìn)行研磨勻漿；然后，3000?5000rpm/min離心2min，用吸管吸取上清液；或直接吸取家蠶血淋巴置于離心管中待用。
[0008](2)滴2?3滴步驟(I)中的上清液或血淋巴,滴到樣品孔(S孔)中，等待2?5min后即可觀察結(jié)果。
[0009]如分別在C (質(zhì)控線)和T (檢測(cè)線)處出現(xiàn)沉淀線，表明樣品為BmNPV陽(yáng)性；如果僅有C線出現(xiàn)，表明樣品為BmNPV陰性；如果沒(méi)有條帶出現(xiàn)，表明該膠體金檢測(cè)試紙條為不合格品。
[0010]所述檢測(cè)家蠶核型多角體病毒的免疫膠體金試紙條的制備方法，其特征在于，按照以下步驟進(jìn)行:
1.首先選擇家蠶核型多角體病毒高度保守的早期核心基因Lef4 (GenBank:AY033655.1)進(jìn)行克隆、表達(dá)和純化，獲得外源蛋白BmNPV_Lef4。
[0011]2.制備BmNPV_Lef4抗原的多克隆抗體:
以純化的蛋白BmNPV-Lef4為抗原，弗氏佐劑為乳化劑，按照常規(guī)方法免疫新西蘭大白兔，制備BmNPV-Lef4的抗血清；再利用Protein A抗體純化試劑盒進(jìn)行純化，獲得BmNPV-Lef4的多克隆抗體，置于_80°C保存待用。
[0012]3.制備小鼠腹水抗體(單克隆抗體):
(O小鼠免疫:以純化的蛋白BmNPV-Lef4與等體積的弗氏完全佐劑充分乳化后，在腹腔、皮下多點(diǎn)注射免疫BALB/c小鼠，劑量為每只40 μ g ;以后每隔2周以弗氏不完全佐劑乳化相同劑量的抗原BmNPV-Lef4注射小鼠，連續(xù)2次；最后一次免疫采用不加佐劑的抗原進(jìn)行小鼠腹腔注射，抗原劑量80 μ g，3天后取脾細(xì)胞融合。
[0013](2)細(xì)胞融合與單抗篩選:取小鼠脾臟，制備細(xì)胞懸液，與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0以4:1?10:1的比例混合，在體積分?jǐn)?shù)為50%的聚乙二醇(PEG)作用下融合，用含HAT、20%FCS的培養(yǎng)液在37°C，5% 二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)；14天后，換以HT培養(yǎng)液培養(yǎng)。當(dāng)雜交瘤細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)孔底面積1/10時(shí)，用間接ELISA檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞上清液，篩選抗體陽(yáng)性孔，以有限稀釋法對(duì)陽(yáng)性孔雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行單克隆化培養(yǎng)，篩選出檢測(cè)為陽(yáng)性的細(xì)胞株即為分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；給BALB/c小鼠腹腔注射0.15mL降植烷，一周后腹腔接種5X105個(gè)雜交瘤細(xì)胞，9?12天有明顯腹水產(chǎn)生，用針頭穿刺收集腹水，離心，取上清液即為腹水抗體，分裝、_80°C下凍存；用間接ELISA測(cè)定腹水單抗效價(jià)。
[0014]4.制備BmNPV免疫膠體金檢測(cè)試紙條:
(I)標(biāo)記抗原BmNPV-Lef4抗體的膠體金墊制備:采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金，制備完成后以最適蛋白用量將步驟3中制備的鼠抗家蠶核型多角體病毒單克隆抗體加入膠體金邊加邊攪拌1min,室溫放置20min ;在溶液中加入BSA,混勻，1200rpm/min離心20min ;去上清，用制備的膠體金標(biāo)記抗體鋪在玻璃纖維膜上，真空干燥，制成膠體金墊。
[0015](2)檢測(cè)線和質(zhì)控線抗體的包被:噴膜儀在硝酸纖維膜NC膜上部劃線，以兔抗BmNPV-Lef4包被檢測(cè)線；以羊抗鼠IgG包被硝酸纖維膜NC膜下部的質(zhì)控線。
[0016](3)試紙組裝:硝酸纖維素膜(已包被IgG)、金標(biāo)墊、玻璃纖維膜(樣品墊)及吸水墊按先后順序粘于背板上。
[0017]其中步驟(I)中制備的膠體金粒徑為20?50nm的膠體金；其中每ImL膠體金溶液加入的鼠抗家蠶核型多角體病毒單克隆抗體為15-25μ? ;加入的BSA的濃度為10%，BSA在溶液中的終濃度為1% ;膠體金標(biāo)記抗體按ImL鋪20cm2的比例鋪在玻璃纖維膜上。
[0018]其中步驟(2)中所述的兔抗BmNPV-Lef4濃度為I?2mg/mL，羊抗鼠IgG濃度為0.5 ?lmg/mL0
[0019]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的優(yōu)點(diǎn):
一是與常規(guī)的PCR檢測(cè)方法相比，采用本發(fā)明的檢測(cè)方法檢測(cè)家蠶核型多角體病毒所需時(shí)間短，操作簡(jiǎn)便；
二是本發(fā)明避免了采用傳統(tǒng)PCR檢測(cè)方法、電鏡鑒定方法等所涉及的儀器設(shè)備、試劑等較為昂貴的問(wèn)題；
三是檢測(cè)試紙條易保存，可4°C冰箱中放置2年左右，有利于基層實(shí)驗(yàn)室和養(yǎng)殖戶(hù)可隨時(shí)開(kāi)展檢測(cè)工作，實(shí)用性更強(qiáng)，選擇了特異性基因、制備了特異性抗體、首次制備了應(yīng)用于家蠶病毒檢測(cè)的膠體金試劑盒。
[0020]四是選擇的病毒基因組為保守序列，因而制備的多克隆抗體和單克隆抗體針對(duì)性強(qiáng)，檢測(cè)結(jié)果特異，不易造成假陽(yáng)性
五是與傳統(tǒng)的膠體金檢測(cè)方法相比，在膠體金檢測(cè)試紙條制備時(shí)采用了雙抗體夾心法，并對(duì)兩種病毒抗體的濃度配比進(jìn)行了調(diào)試，能夠有效地保證檢測(cè)結(jié)果的特異性、靈敏度和穩(wěn)定性，其檢測(cè)靈敏度能夠與常規(guī)PCR方法相媲美。病原不同、基因特異，抗原、抗體均是首次制備，也是首次應(yīng)用于家蠶核型多角體病毒檢測(cè)中。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0021]圖1為家蠶核型多角體病毒的免疫膠體金檢測(cè)試紙條結(jié)構(gòu)圖；
圖2為實(shí)施例中家蠶核型多角體病毒的免疫膠體金檢測(cè)試紙條
圖3為實(shí)施例中家蠶核型多角體病毒免疫膠體金檢測(cè)試紙條的靈敏度和特異性評(píng)價(jià)結(jié)果圖。

【具體實(shí)施方式】
[0022]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件例如Samb10k等分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0023]實(shí)施例1
1.材料
家蠶核型多角體病毒、鼠抗家蠶核型多角體病毒單克隆抗體(命名為BMlef4)、兔抗家蠶核型多角體病毒多克隆抗體由本實(shí)驗(yàn)室自行制備與保存。檸檬酸三鈉、氯金酸(HAuCl4.4H20)購(gòu)自Sigma公司；BSA購(gòu)自Promega公司；硝酸纖維膜(NC)、玻璃纖維紙購(gòu)自Millipore公司；羊抗鼠IgG購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。
[0024]2.BmNPV免疫膠體金試紙條的制備
(O首先選擇家蠶核型多角體病毒高度保守的早期核心基因Lef4 (GenBank:AY033655.1)進(jìn)行克隆、表達(dá)和純化，獲得外源蛋白BmNPV_Lef4。
[0025](2) BmNPV_Lef4抗原的多克隆抗體的制備:
以純化的蛋白BmNPV-Lef4為抗原，弗氏佐劑為乳化劑，按照常規(guī)方法免疫新西蘭大白兔，制備BmNPV-Lef4的抗血清；再利用Protein A抗體純化試劑盒進(jìn)行純化，獲得BmNPV-Lef4的多克隆抗體，置于_80°C保存待用。
[0026](3)小鼠腹水抗體(單克隆抗體)的制備:
A.小鼠免疫:以純化的蛋白BmNPV-Lef4與等體積的弗氏完全佐劑充分乳化后，在腹腔、皮下多點(diǎn)注射免疫BALB/c小鼠，劑量為每只40 μ g ;以后每隔2周以弗氏不完全佐劑乳化相同劑量的抗原BmNPV-Lef4注射小鼠，連續(xù)2次；最后一次免疫采用不加佐劑的抗原進(jìn)行小鼠腹腔注射，抗原劑量80 μ g，3天后取脾細(xì)胞融合。
[0027]B.細(xì)胞融合與單抗篩選:取小鼠脾臟，制備細(xì)胞懸液，與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0以4:1?10:1的比例混合，在體積分?jǐn)?shù)為50%的聚乙二醇(PEG)作用下融合，用含HAT、20%FCS的培養(yǎng)液在37°C，5% 二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)；14天后，換以HT培養(yǎng)液培養(yǎng)。當(dāng)雜交瘤細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)孔底面積1/10時(shí)，用間接ELISA檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞上清液，篩選抗體陽(yáng)性孔，以有限稀釋法對(duì)陽(yáng)性孔雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行單克隆化培養(yǎng)，篩選出檢測(cè)為陽(yáng)性的細(xì)胞株即為分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；給BALB/c小鼠腹腔注射0.15mL降植烷，一周后腹腔接種5X105個(gè)雜交瘤細(xì)胞，9?12天有明顯腹水產(chǎn)生，用針頭穿刺收集腹水，離心，取上清液即為腹水抗體，分裝、_80°C下凍存；用間接ELISA測(cè)定腹水單抗效價(jià)。
[0028](4) BmNPV免疫膠體金檢測(cè)試紙條的制備:
A.標(biāo)記抗原BmNPV-Lef4抗體的膠體金墊制備:采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金，制備完成后以最適蛋白用量將步驟3中制備的鼠抗家蠶核型多角體病毒單克隆抗體加入膠體金邊加邊攪拌1min,室溫放置20min ;在溶液中加入BSA,混勻，1200rpm/min離心20min ;去上清，用制備的膠體金標(biāo)記抗體鋪在玻璃纖維膜上，真空干燥，制成膠體金墊。
[0029]B.檢測(cè)線和質(zhì)控線抗體的包被:噴膜儀在硝酸纖維膜NC膜上部劃線，以兔抗BmNPV-Lef4包被檢測(cè)線；以羊抗鼠IgG包被硝酸纖維膜NC膜下部的質(zhì)控線。
[0030]其中步驟A中制備的膠體金粒徑為20?50nm的膠體金；其中每ImL膠體金溶液加入的鼠抗家蠶核型多角體病毒單克隆抗體為15-25μ? ;加入的BSA的濃度為10%，BSA在溶液中的終濃度為1% ;膠體金標(biāo)記抗體按ImL鋪20cm2的比例鋪在玻璃纖維膜上。
[0031 ] 其中步驟B中所述的兔抗BmNPV-Lef4濃度為I?2mg/mL，羊抗鼠IgG濃度為0.5 ?lmg/mL。
[0032]C.試紙條的組裝:在干燥室內(nèi)，按照底板上劃定的樣品墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維膜及吸水紙的尺寸，裁定符合要求的材料和制備相關(guān)的金標(biāo)墊；取已包被的NC膜放置在塑料PVC底板的中部粘貼，在NC膜檢測(cè)線一側(cè)將金標(biāo)墊緊靠硝酸纖維素膜下邊緣粘住，在NC膜C線一側(cè)搭連吸水紙，吸水紙一部分粘在PVC底板上、蓋好塑料PVC蓋，完成免疫膠體金試紙條的組裝，如圖1所示。
[0033]3.BmNPV免疫膠體金檢測(cè)試紙條的使用步驟
(I)檢測(cè)樣品的采集:稱(chēng)取50mg家蠶組織置于200 μ I PBS緩沖液中，進(jìn)行研磨勻漿；然后，3000?5000rpm/min離心2min，用吸管吸取上清液；或直接吸取家蠶血淋巴置于離心管中待用。
[0034](2)滴2?3滴步驟3 (I)中的上清液，滴到圖1所示樣品孔(S孔)中，等待2?5min后即可觀察結(jié)果。如分別在C(質(zhì)控線)和T(檢測(cè)線)處出現(xiàn)沉淀線，表明樣品為BmNPV陽(yáng)性；如果僅有C線出現(xiàn)，表明樣品為BmNPV陰性；如果沒(méi)有條帶出現(xiàn)，表明該膠體金檢測(cè)試紙條為不合格品。
[0035]利用本發(fā)明所述的免疫膠體金檢測(cè)試紙條檢測(cè)家蠶核型多角體病毒，經(jīng)過(guò)檢測(cè)使用，結(jié)果表明家蠶核型多角體病毒免疫膠體金檢測(cè)試紙條具有較好的特異性和靈敏度(圖2)。
【權(quán)利要求】
1.一種檢測(cè)家蠶核型多角體病毒的免疫膠體金試紙條，其特征在于，所述免疫膠體金試紙條 包括:標(biāo)記抗原BmNPV-Lef4抗體的膠體金墊和包被的硝酸纖維膜，其中硝酸纖維膜上部檢測(cè)線包被兔抗BmNPV-Lef4，硝酸纖維膜下部的質(zhì)控線包被羊抗鼠IgG。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)家蠶核型多角體病毒的免疫膠體金試紙條,其特征在于， 其中所述兔抗BmNPV-Lef4的濃度為I?2mg/mL,羊抗鼠IgG濃度為0.5?lmg/mL。
3.一種家蠶核型多角體病毒的快速檢測(cè)方法，其特征在于，所述的檢測(cè)方法采用檢測(cè)家蠶核 型多角體病毒的免疫膠體金試紙條，具體操作如下: 檢測(cè)樣品的采集:稱(chēng)取家蠶組織置于PBS緩沖液中， 進(jìn)行研磨勻漿；然后，離心，用吸管吸取上清液；或直接吸取家蠶血淋巴置于離心管中待用； 取2?3滴步驟(I)中的上清液或血淋巴，滴到樣品孔(S孔)中，等待2?5min 后即可觀察結(jié)果；如分別在C (質(zhì)控線)和T (檢測(cè)線)處出現(xiàn)沉淀線，表明樣品為BmNPV陽(yáng)性；如果僅有C線出現(xiàn)，表明樣品為BmNPV陰性；如果沒(méi)有條帶出現(xiàn)，表明該膠體金檢測(cè)試紙條為不合格品。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種家蠶核型多角體病毒的快速檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(I)中家蠶組織與PBS緩沖液的比例為20?50mg:150?250 μ L。
5.如權(quán)利要求1或3所述檢測(cè)家蠶核型多角體病毒的免疫膠體金試紙條的制備方法，其特征在于，按照以下步驟進(jìn)行: (1)首先選擇家蠶核型多角體病毒高度保守的早期核心基因Lef4進(jìn)行克隆、表達(dá)和純化，獲得外源蛋白BmNPV-Lef4 ； (2)制備BmNPV-Lef4抗原的多克隆抗體: 以純化的蛋白BmNPV-Lef4為抗原，弗氏佐劑為乳化劑，按照常規(guī)方法免疫新西蘭大白兔，制備BmNPV-Lef4的抗血清；再利用Protein A抗體純化試劑盒進(jìn)行純化，獲得BmNPV-Lef4的多克隆抗體，置于_80°C保存待用； (3)制備小鼠腹水抗體，即鼠抗家蠶核型多角體病毒單克隆抗體: 以純化的蛋白BmNPV-Lef4為抗原免疫BALB/c小鼠，制備篩選單克隆抗體； (4)制備BmNPV免疫膠體金檢測(cè)試紙條: A.標(biāo)記抗原BmNPV-Lef4抗體的膠體金墊制備:采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金，制備完成后將步驟(3)中制備的鼠抗家蠶核型多角體病毒單克隆抗體加入膠體金，邊加邊攪拌后，室溫放置；在溶液中加入BSA，混勻，離心；去上清，將制備的膠體金標(biāo)記抗體鋪在玻璃纖維膜上，真空干燥，制成膠體金墊； B.檢測(cè)線和質(zhì)控線抗體的包被:噴膜儀在硝酸纖維膜上部劃線，以兔抗BmNPV-Lef4包被檢測(cè)線；以羊抗鼠IgG包被硝酸纖維膜NC膜下部的質(zhì)控線； C.試紙組裝:已包被IgG的硝酸纖維素膜、金標(biāo)墊、玻璃纖維膜即樣品墊和吸水紙按先后順序粘于背板上。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測(cè)家蠶核型多角體病毒的免疫膠體金試紙條的制備方法，其特征在于，其中步驟(4)的A中制備的膠體金粒徑為20?50nm的膠體金；室溫放置20min，加入的BSA的濃度為10%，BSA在溶液中的終濃度為1%。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測(cè)家蠶核型多角體病毒的免疫膠體金試紙條的制備方法，其特征在于，其中步驟(4)的A中膠體金標(biāo)記抗體按ImL鋪20cm2的比例鋪在玻璃纖維膜上。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測(cè)家蠶核型多角體病毒的免疫膠體金試紙條的制備方法，其特征在于，其中步驟(4)的A中每ImL膠體金溶液加入的鼠抗家蠶核型多角體病毒單克隆抗體為15-25μ?。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測(cè)家蠶核型多角體病毒的免疫膠體金試紙條的制備方法，其特征在于，其中步驟(4)的B中所述的兔抗BmNPV-Lef4濃度為I?2mg/mL，羊抗鼠IgG 濃度為 0.5 ?lmg/mL。
【文檔編號(hào)】G01N33/569GK104459120SQ201410646786
【公開(kāi)日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年11月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月14日
【發(fā)明者】周陽(yáng), 施海峰, 高力, 劉海濤, 夏恒傳, 劉曉勇, 姚勤 申請(qǐng)人:江蘇大學(xué)