中的應用及其測定方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種利用槲皮素作為熒光探針測定Cu2+的應用及一種利用槲皮素作為熒光探針對Cu2+的測定方法，屬光分析檢測【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明主要是利用槲皮素熒光探針與待測物Cu2+發(fā)生作用后熒光強度發(fā)生變化，通過熒光光譜分析對銅離子進行靈敏的定量分析測定。本發(fā)明的步驟是其步驟如下：(1)制作標準曲線：將槲皮素加入到含有不同濃度Cu2+的甲醇-磷酸緩沖鹽溶液中，確定熒光強度與Cu2+的濃度的定量關(guān)系；(2)將槲皮素加入到含有Cu2+的待測甲醇-磷酸緩沖鹽溶液中，配置成與步驟(1)槲皮素濃度相同的溶液，記錄溶液的熒光強度；(3)根據(jù)定量關(guān)系確定待測溶液Cu2+的濃度。本發(fā)明的測定過程具有簡單、靈敏、準確等特點。
【專利說明】利用槲皮素作為熒光探針在測定Cu2+中的應用及其測定方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及的是利用槲皮素作為熒光探針在測定Cu2+中的應用及其一種利用槲皮素作為熒光探針對Cu2+的測定方法，屬光分析檢測【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]槲皮素廣泛存在于植物中，其來源廣泛，制備工藝簡單，市場價格便宜。目前對槲皮素及其配合物的抗氧化、抗菌等生物活性研究較多，對其熒光探針的性質(zhì)研究甚少。槲皮素具有完整的大η鍵共軛體系、強的配位氧原子及合適的空間構(gòu)型，能與金屬發(fā)生配位。這些相互作用會引起槲皮素光譜性質(zhì)的變化，因此可以利用檢測光譜性質(zhì)的變化來實現(xiàn)對金屬離子的識別。
[0003]Cu2+是人體中不可缺少的元素，對人體的生長發(fā)育有重要作用，但是人體內(nèi)銅含量過高也會引起中毒，例如可引起壞死性肝炎、溶血性貧血等疾病。隨著工業(yè)化的發(fā)展，環(huán)境污染日益嚴重，尤其是重金屬污染給人類帶來許多疾病和災難，因此，監(jiān)測環(huán)境中Cu2+的含量是一項具有重大意義的工作。目前，檢測Cu2+的方法有很多種，例如:火焰原子吸收法、離子色譜法、電化學法等都是較為常見的Cu2+檢測方法，但是這些方法中都要用到許多精密儀器，且對樣品前處理要求嚴格，因此檢測成本高、效率較低。為克服以上缺點，本發(fā)明采用廣泛存在于植物體內(nèi)的槲皮素作為熒光探針來檢測環(huán)境中的Cu2+離子，具有靈敏度高、識別能力強、簡單等特點。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明目的是提供一種利用槲皮素作為熒光探針在測定Cu2+中的應用。
[0005]本發(fā)明還提供了一種利用槲皮素作為熒光探針對Cu2+的測定方法。該測定方法具有靈敏度聞、識別能力強、簡單等特點。
[0006]一種利用槲皮素作為熒光探針在測定Cu2+中的應用。
[0007]—種利用槲皮素作為熒光探針對Cu2+的測定方法，其步驟如下:
[0008](I)制作標準曲線:將槲皮素加入到含有不同濃度Cu2+的緩沖溶液中，配成槲皮素濃度相同的溶液，記錄各溶液的熒光強度，確定熒光強度與Cu2+的濃度的定量關(guān)系；
[0009](2)將槲皮素加入到含有Cu2+的待測緩沖溶液中，配置成與步驟(I)槲皮素濃度相同的溶液，記錄溶液的熒光強度；
[0010](3)根據(jù)定量關(guān)系確定待測溶液Cu2+的濃度。
[0011 ] 所述的緩沖溶液為pH為7.40的甲醇-磷酸緩沖鹽溶液(CH3OH-PBS)，甲醇與磷酸緩沖鹽溶液的體積比為1:99。
[0012]所述的熒光強度測定條件是激發(fā)狹縫為5nm，發(fā)射狹縫為15nm，掃描范圍為450-700nm，在激發(fā)波長為390nm，發(fā)射波長為540nm處，預先測定槲皮素熒光探針的熒光強度隨Cu2+的濃度變化的定量關(guān)系。
[0013]所述的Cu2+的濃度在I?7μ M范圍，槲皮素的濃度為lX10_5mol.L'
[0014]有益效果:
[0015]本發(fā)明利用廉價易得的槲皮素作為熒光探針來檢測水溶液中的Cu2+，利用槲皮素與Cu2+配位后熒光強度的變化規(guī)律，繪制熒光強度F對Cu2+濃度c (Cu2+)的標準曲線，根據(jù)標準曲線求出未知樣品中Cu2+的濃度。操作簡單，分析，對Cu2+識別能力強，受其它離子干擾小，靈敏度高，且在PH = 7.40的甲醇-磷酸緩沖鹽溶液中對Cu2+進行檢測，有望應用在細胞中，通過細胞成像等技術(shù)檢測細胞中Cu2+含量。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1 為在 CH3OH-PBS (1:99, V/V，PH = 7.40)緩沖溶液中，濃度為 IX l(T5mol.Γ1的槲皮素與Cu2+(O?10 μ M)熒光滴定譜圖；
[0017]圖2為槲皮素與Cu2+的熒光滴定曲線；
[0018]圖3為其它金屬離子對槲皮素-Cu配合物體系熒光光譜的影響。

【具體實施方式】
[0019]實施例1
[0020]1、標準曲線的繪制
[0021](I)準確稱取0.0151g槲皮素(中國藥品生物制品鑒定所，100081-200907)，用甲醇定容至50mL容量瓶中，從中取1mL用PBS緩沖溶液(pH = 7.40)定容到10mL容量瓶中，配成IX ΙΟΛιοΙ.L—1待用；準確稱取0.0200g Cu(AC)2 -H2O用水定容至1mL容量瓶中，從中取ImL用PBS緩沖溶液(pH = 7.40)定容到1mL容量瓶中，配成IX 10_3mol.Γ1待用。(2)準備11只1mL干燥潔凈的容量瓶，分別加入ImLlX 10_4mol.Γ1的槲皮素溶液，和不同體積的lX10_3mol.T1Cu(AC)2.H2O溶液，并用PBS緩沖溶液(pH = 7.40)定容到10mL，配成槲皮素濃度均為 I X ΙΟ、。I.?Λ Cu2+濃度分別為 0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10 μ M的溶液。
[0022](3)設(shè)置熒光光譜儀激發(fā)波長為390nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度分別為5nm和15nm，掃描范圍設(shè)置為450nm至700nm ;并對上述溶液進行測試，分別記錄上述溶液在發(fā)射波長為540nm處的突光強度，如圖1所不。
[0023](4)繪制熒光強度F對Cu2+濃度c (Cu2+)的標準曲線，F(xiàn) = -19.999x+209.49，線性相關(guān)系數(shù)為R2 = 0.9941，線性范圍為1-7 μ M，可以完成對Cu2+的微量檢測，如圖2所示。
[0024]2、樣品的測定
[0025](I)準備I只1mL干燥潔凈的容量瓶，加入ImLl X 1θΛιο1.I/1的槲皮素溶液，和25 μ L 的 I X 10_3mol.L^1Cu (AC) 2.H2O 溶液，并用 PBS 緩沖溶液(pH = 7.40)定容至Ij 1mL,配成槲皮素濃度為I X 10_5mol.ΙΛ Cu2+濃度為2.5 μ M的溶液。
[0026](2)設(shè)置熒光光譜儀激發(fā)波長為390nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度分別為5nm和15nm，掃描范圍設(shè)置為450nm至700nm;并對上述溶液進行測試，記錄上述溶液在發(fā)射波長為540nm處的熒光強度，重復測三次，分別為:159.7127,159.6323和159.5725。
[0027](3)根據(jù)熒光強度F對Cu2+濃度c (Cu2+)的標準曲線:F = -19.999x+209.49，計算得到Cu2+的濃度為:2.489，2.493和2.496 μ M，均值為:2.493 μ M，相對誤差為:-0.28%。
[0028]實施例2
[0029]1、標準曲線的繪制
[0030](I)準確稱取0.0151g槲皮素(中國藥品生物制品鑒定所，100081-200907)，用甲醇定容至50mL容量瓶中，從中取1mL用PBS緩沖溶液(pH = 7.40)定容到10mL容量瓶中，配成IX ΙΟΛιοΙ.L—1待用；準確稱取0.0200g Cu(AC)2 -H2O用水定容至1mL容量瓶中，從中取ImL用PBS緩沖溶液(pH = 7.40)定容到1mL容量瓶中，配成IX 10_3mol.Γ1待用。
[0031](2)準備11只1mL干燥潔凈的容量瓶，分別加入ImLl X 10_4mol.Γ1的槲皮素溶液，和不同體積的I X 10_3mol -L^1Cu (AC) 2 -H2O溶液，并用PBS緩沖溶液(pH = 7.40)定容到10mL，配成槲皮素濃度均為 I X ΙΟ、。I.?Λ Cu2+濃度分別為 0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10 μ M
的溶液。
[0032](3)設(shè)置熒光光譜儀激發(fā)波長為390nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度分別為5nm和15nm，掃描范圍設(shè)置為450nm至700nm ;并對上述溶液進行測試，分別記錄上述溶液在發(fā)射波長為540nm處的突光強度，如圖1所不。
[0033](4)繪制熒光強度F對Cu2+濃度c (Cu2+)的標準曲線，F(xiàn) = -19.999x+209.49，線性相關(guān)系數(shù)為R2 = 0.9941，線性范圍為1-7 μ M，可以完成對Cu2+的微量檢測，如圖2所示。
[0034]2、樣品的測定
[0035](I)準備I只1mL干燥潔凈的容量瓶，加入ImLl X 1θΛιο1.I/1的槲皮素溶液，和45 μ L 的 I X I(T3H1I.L-1Cu (AC) 2.H2O 溶液，并用 PBS 緩沖溶液(pH = 7.40)定容到 1mL,配成槲皮素濃度為I X 10_5mol.ΙΛ Cu2+濃度為4.5 μ M的溶液。
[0036](2)設(shè)置熒光光譜儀激發(fā)波長為390nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度分別為5nm和15nm，掃描范圍設(shè)置為450nm至700nm;并對上述溶液進行測試，記錄上述溶液在發(fā)射波長為540nm處的熒光強度，重復測三次，分別為:119.9342,119.7946和119.7544。
[0037](3)根據(jù)熒光強度F對Cu2+濃度c (Cu2+)的標準曲線:F = -19.999x+209.49，計算得到Cu2+的濃度為:4.478，4.485和4.487 μ Μ，均值為:4.483 μ Μ，相對誤差為:-0.38 %。
[0038]實施例3
[0039]1、標準曲線的繪制
[0040](I)準確稱取0.0151g槲皮素(中國藥品生物制品鑒定所，100081-200907)，用甲醇定容至50mL容量瓶中，從中取1mL用PBS緩沖溶液(pH = 7.40)定容到10mL容量瓶中，配成IX ΙΟΛιοΙ.L—1待用；準確稱取0.0200g Cu(AC)2 -H2O用水定容至1mL容量瓶中，從中取ImL用PBS緩沖溶液(pH = 7.40)定容到1mL容量瓶中，配成IX 10_3mol.Γ1待用。
[0041](2)準備11只1mL干燥潔凈的容量瓶，分別加入ImLl X 1θΛιο1.Γ1的槲皮素溶液，和不同體積的I X 10_3mol -L^1Cu (AC) 2 -H2O溶液，并用PBS緩沖溶液(pH = 7.40)定容到10mL，配成槲皮素濃度均為 I X ΙΟ、。I.?Λ Cu2+濃度分別為 0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10 μ M
的溶液。
[0042](3)設(shè)置熒光光譜儀激發(fā)波長為390nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度分別為5nm和15nm，掃描范圍設(shè)置為450nm至700nm ;并對上述溶液進行測試，分別記錄上述溶液在發(fā)射波長為540nm處的突光強度，如圖1所不。
[0043](4)繪制熒光強度F對Cu2+濃度c (Cu2+)的標準曲線，F(xiàn) = -19.999x+209.49，線性相關(guān)系數(shù)為R2 = 0.9941，線性范圍為1-7 μ M，可以完成對Cu2+的微量檢測，如圖2所示。
[0044]2、樣品的測定
[0045](I)準備I只1mL干燥潔凈的容量瓶，加入ImLl X ΙΟΛιοΙ.L—1的槲皮素溶液，和65 μ L 的 I X I(T3H1I.L-1Cu (AC) 2.H2O 溶液，并用 PBS 緩沖溶液(pH = 7.40)定容到 1mL,配成槲皮素濃度為I X 10_5mol.ΙΛ Cu2+濃度為6.5 μ M的溶液。
[0046](2)設(shè)置熒光光譜儀激發(fā)波長為390nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度分別為5nm和15nm，掃描范圍設(shè)置為450nm至700nm;并對上述溶液進行測試，記錄上述溶液在發(fā)射波長為540nm處的熒光強度，重復測三次，分別為:80.0568，79.7765和79.6761。
[0047](3)根據(jù)熒光強度F對Cu2+濃度c (Cu2+)的標準曲線:F = -19.999x+209.49，計算得到Cu2+的濃度為:6.472，6.486和6.491 μ Μ，均值為:6.483 μ Μ，相對誤差為:-0.26%.
[0048]實施例4
[0049]1、標準曲線的繪制
[0050](I)準確稱取0.0151g槲皮素(中國藥品生物制品鑒定所，100081-200907)，用甲醇定容至50mL容量瓶中，從中取1mL用PBS緩沖溶液(pH = 7.40)定容到10mL容量瓶中，配成IX ΙΟΛιοΙ.L—1待用；準確稱取0.0200g Cu(AC)2 -H2O用水定容至1mL容量瓶中，從中取ImL用PBS緩沖溶液(pH = 7.40)定容到1mL容量瓶中，配成IX 10_3mol.Γ1待用。
[0051](2)準備11只1mL干燥潔凈的容量瓶，分別加入ImLl X ΙΟΛιοΙ.Γ1的槲皮素溶液，和不同體積的I X 10_3mol -L^1Cu (AC) 2 -H2O溶液，并用PBS緩沖溶液(pH = 7.40)定容到10mL，配成槲皮素濃度均為 I X ΙΟ、。I.?Λ Cu2+濃度分別為 0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10 μ M
的溶液。
[0052](3)設(shè)置熒光光譜儀激發(fā)波長為390nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度分別為5nm和15nm，掃描范圍設(shè)置為450nm至700nm ;并對上述溶液進行測試，分別記錄上述溶液在發(fā)射波長為540nm處的突光強度，如圖1所不。
[0053](4)繪制熒光強度F對Cu2+濃度c (Cu2+)的標準曲線，F(xiàn) = -19.999x+209.49，線性相關(guān)系數(shù)為R2 = 0.9941，線性范圍為1-7 μ M，可以完成對Cu2+的微量檢測，如圖2所示。
[0054]2、未知樣品的測定
[0055](I)取南京林業(yè)大學二村池塘河水，經(jīng)0.22 μ m微孔濾頭過濾，得到澄清未知待測液，并定容至1mL容量瓶中。
[0056](2)準備I只1mL干燥潔凈的容量瓶，加入ImLl X 1θΛιο1.Γ1的槲皮素溶液，和ImL(I)中待測溶液，并用PBS緩沖溶液(pH = 7.40)定容到10mL，配成槲皮素濃度為I X I(T5H1I.L-1，采用 ICP-MS 檢測至Ij Cu2+ 的濃度為 4.002 μ Μ。
[0057](3)設(shè)置熒光光譜儀激發(fā)波長為390nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度分別為5nm和15nm，掃描范圍設(shè)置為450nm至700nm;并對上述溶液進行測試，記錄上述溶液在發(fā)射波長為540nm處的熒光強度，重復測三次，取平均值，并根據(jù)熒光強度F對Cu2+濃度c (Cu2+)的標準曲線:F = -19.999x+209.49，計算得到 Cu2+ 的濃度為:3.889 μ Μ。
[0058]槲皮素熒光探針測量結(jié)果與ICP-MS測量結(jié)果比較接近，能滿足一般的分析要求，而且使用更加方便，成本更低。
[0059]此外，本發(fā)明還考查了不同金屬離子對槲皮素-Cu配合物體系熒光光譜的影響。在含槲皮素 I X 10_5mOl.L-1，Cu (AC) 2 為 4 μ M 的溶液中，分別加入含 Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Zn2+、Mn2+、Co2+、Cd2+、Ni2+、La3+、Eu3+、Gd3+、Ce3+、Dy3+ 的醋酸鹽，其中 Na+、K+、Mg2+、Ca2+ 濃度為 Cu2+濃度的 250 倍，Zn2+、Mn2+、Co2+、Cd2+、Ni2+、La3+、Eu3+、Gd3+、Ce3+、Dy3+ 濃度為 Cu2+ 濃度的 25 倍，在相同的條件下測得的熒光強度如圖3所示，由圖可以看出，槲皮素對Cu2+的識別能力較強，Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Zn2+、Mn2+、Co2+、Cd2+、Ni2+、La3+、Eu3+、Gd3+、Ce3+、Dy3+ 對 Cu2+ 的檢測幾乎沒有影響。
【權(quán)利要求】
1.一種利用槲皮素作為熒光探針在測定Cu2+中的應用。
2.一種利用槲皮素作為熒光探針對Cu2+的測定方法，其步驟如下: (1)制作標準曲線:將槲皮素加入到含有不同濃度Cu2+的甲醇-磷酸緩沖鹽溶液中，配成槲皮素濃度相同的溶液，記錄各溶液的熒光強度，確定熒光強度與Cu2+的濃度的定量關(guān)系; (2)將槲皮素加入到含有Cu2+的待測甲醇-磷酸緩沖鹽溶液中，配置成與步驟(I)槲皮素濃度相同的溶液，記錄溶液的熒光強度； (3)根據(jù)定量關(guān)系確定待測溶液Cu2+的濃度。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述一種利用槲皮素作為熒光探針對Cu2+的測定方法，其特征在于:所述的緩沖溶液為PH為7.40的甲醇-磷酸緩沖鹽溶液(CH3OH-PBS)，甲醇與磷酸緩沖鹽溶液的體積比為1:99。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述一種利用槲皮素作為熒光探針對Cu2+的測定方法，其特征在于:所述的熒光強度測定條件是激發(fā)狹縫為5nm，發(fā)射狹縫為15nm，掃描范圍為450_700nm，激發(fā)波長為390nm,發(fā)射波長為540nm。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用槲皮素作為熒光探針對Cu2+的測定方法，其特征在于:所述的Cu2+的濃度在I?7 μ M范圍，槲皮素的濃度為I X 10_5mol.L'
【文檔編號】G01N21/64GK104359885SQ201410674056
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年11月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月21日
【發(fā)明者】徐莉, 楊世龍, 曹福亮, 印彬 申請人:南京林業(yè)大學