一種快速檢測(cè)微生物胞外呼吸活性的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種快速檢測(cè)微生物胞外呼吸活性的方法。該方法為將微生物菌懸浮液中加入含有四甲基聯(lián)苯胺和過氧化氫的顯色液，使顯色反應(yīng)充分進(jìn)行；再加入硫酸溶液終止顯色反應(yīng)，將藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色，用酶標(biāo)儀檢測(cè)其OD450nm值，該OD值即為微生物樣品的胞外呼吸活性值。本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)單、迅速，最快3min可得檢測(cè)結(jié)果，可用于微生物樣品的快速檢測(cè)；且具有很好的特異性，檢測(cè)結(jié)果幾乎不受其他常見微生物的影響。
【專利說明】一種快速檢測(cè)微生物胞外呼吸活性的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物檢測(cè)領(lǐng)域，涉及一種快速檢測(cè)微生物胞外呼吸活性的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 微生物胞外呼吸是指在厭氧條件下微生物在胞內(nèi)氧化有機(jī)物釋放電子，并且偶聯(lián) 呼吸鏈將產(chǎn)生的電子傳遞到胞外受體使其還原的過程。能夠接受其電子而被還原的胞外受 體種類繁多，包括水溶性的鈾，金和銀離子，硫酸鹽，鐵錳礦物和腐殖質(zhì)等。此外，人造電極 也能夠接受胞外呼吸過程傳遞到胞外的電子，從而產(chǎn)生電流。因此，微生物胞外呼吸具有重 要的應(yīng)用價(jià)值，在污染物原位修復(fù)、污水處理、微生物冶煉、微生物合成及微生物產(chǎn)電等方 面表現(xiàn)出重要的應(yīng)用前景。鑒于胞外呼吸廣泛的應(yīng)用前景，開發(fā)低成本快速檢測(cè)微生物胞 外呼吸活性的方法具有重要意義。目前，針對(duì)微生物胞外呼吸活性的檢測(cè)方法，有異化鐵還 原法，腐殖質(zhì)還原法和生物電流法。然而，這些方法操作程序復(fù)雜而且耗用時(shí)間長(zhǎng)。
[0003] 微生物自身攜帶的酶催化顯色反應(yīng)是進(jìn)行微生物活性檢測(cè)的有效方法。在胞外呼 吸過程中，微生物氧化有機(jī)物產(chǎn)生的電子必須通過復(fù)雜電子傳遞網(wǎng)絡(luò)傳遞到達(dá)細(xì)胞外膜， 然后通過外膜上的多血紅素細(xì)胞色素c傳遞到胞外。已有研究表明，胞外呼吸菌80%的膜 結(jié)合的c型細(xì)胞色素位于細(xì)胞外膜，而且這些c型細(xì)胞色素與辣根過氧化物酶具有鐵卟啉 結(jié)構(gòu)，因此具有相似的過氧化氫酶活性。對(duì)現(xiàn)有的技術(shù)檢索發(fā)現(xiàn)，目前還沒針對(duì)微生物胞外 酶開發(fā)的檢測(cè)胞外呼吸活性的方法。因此，利用胞外呼吸菌外膜細(xì)胞色素c的過氧化氫酶 活性，結(jié)合微孔板快速檢測(cè)技術(shù)，可以開發(fā)出一種新型微生物胞外呼吸活性快速檢測(cè)方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中所存在的不足，本發(fā)明通過研究將微生物外膜細(xì)胞色素C過氧化 氫酶活性的信號(hào)放大作用與微孔板快速檢測(cè)系統(tǒng)相結(jié)合，構(gòu)建了一種快速檢測(cè)微生物胞外 呼吸活性的方法。該方法具有可靠性高，操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)迅速。
[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種快速檢測(cè)微生物胞外呼吸活性的方法。
[0006] 本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是： 一種快速檢測(cè)微生物胞外呼吸活性的方法，包括以下操作步驟： 1) 將待測(cè)的微生物菌懸液中加入顯色液進(jìn)行顯色反應(yīng)； 所述顯色液含有檸檬酸鈉、磷酸氫二鈉、四甲基聯(lián)苯胺和過氧化氫，pH為4?5 ; 2) 往上一步的反應(yīng)液中加入終止液以終止顯色反應(yīng)，然后檢測(cè)反應(yīng)液在450nm處的0D 值； 3) 結(jié)果分析：〇D45(tam值越大說明待測(cè)微生物胞外呼吸活性越強(qiáng)。
[0007] 進(jìn)一步的，上述微生物菌懸液中微生物濃度不小于2X108cfu/ml。
[0008] 進(jìn)一步的，上述微生物菌懸液中的液體為生理鹽水或HEPES緩沖液。
[0009] 進(jìn)一步的，上述顯色液的體積為微生物菌懸液的0. 8?1. 2倍。
[0010] 進(jìn)一步的，上述顯色液含有80?120mM檸檬酸鈉，180?220mM磷酸氫二鈉，0. 3? 0? 35mM四甲基聯(lián)苯胺和1. 8?2. 2mM過氧化氫，pH為4?5。
[0011] 進(jìn)一步的，上述顯色液含有l(wèi)OOmM檸檬酸鈉，200mM磷酸氫二鈉，0. 32mM四甲基聯(lián) 苯胺和2mM過氧化氫，pH為4. 3。
[0012] 進(jìn)一步的，上述顯色反應(yīng)時(shí)間為15?25min，溫度為18?27°C。
[0013] 進(jìn)一步的，上述終止液的體積為顯色液體積的0. 4?0. 6倍。
[0014] 進(jìn)一步的，上述終止液為硫酸溶液。
[0015] 進(jìn)一步的，上述終止液為1. 8?2. 2M硫酸溶液。
[0016] 本發(fā)明的有益效果是： (1) 細(xì)胞色素c是胞外呼吸菌的關(guān)鍵酶，具有較強(qiáng)的過氧化氫酶活性，能夠快速催化過 氧化氫快速氧化四甲基聯(lián)苯胺產(chǎn)生藍(lán)色產(chǎn)物，最快3分鐘即可獲得檢測(cè)結(jié)果； (2) 本發(fā)明方法可采用微孔板檢測(cè)，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)多個(gè)樣品同時(shí)進(jìn)行微量、批量、快速地 檢測(cè)； (3) 本發(fā)明所述的微生物胞外呼吸活性的檢測(cè)方法可靠性高，其檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)的異 化鐵還原法和生物電流法結(jié)果一致。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017] 圖1為快速檢測(cè)微生物胞外呼吸活性的示意圖； 圖2為各微生物中胞外細(xì)胞色素c的漫反射光譜圖及含量，A為漫反射光譜圖，B為胞 外細(xì)胞色素c的含量； 圖3為異化鐵還原法和生物電流法檢測(cè)各微生物胞外呼吸活性結(jié)果圖；A和B為異化 鐵還原法檢測(cè)各微生物胞外呼吸活性結(jié)果，C為生物電流法檢測(cè)的結(jié)果； 圖4為實(shí)施例2檢測(cè)各微生物胞外呼吸活性的結(jié)果； 圖5為快速檢測(cè)法與傳統(tǒng)方法的相關(guān)分析； 圖6為快速檢測(cè)方法的特異性結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0018] 一種快速檢測(cè)微生物胞外呼吸活性的方法，包括以下操作步驟： 1) 將待測(cè)的微生物菌懸液中加入顯色液進(jìn)行顯色反應(yīng)； 所述顯色液含有檸檬酸鈉、磷酸氫二鈉、四甲基聯(lián)苯胺和過氧化氫，pH為4?5; 2) 往上一步的反應(yīng)液中加入終止液以終止顯色反應(yīng)，然后檢測(cè)反應(yīng)液在450nm處的0D 值； 3)結(jié)果分析：〇D45(tam值越大說明待測(cè)微生物胞外呼吸活性越強(qiáng)。
[0019] 優(yōu)選的，上述微生物菌懸液中微生物濃度不小2X108cfu/ml。
[0020] 優(yōu)選的，上述微生物菌懸液中的液體為生理鹽水或HEPES緩沖液。。
[0021] 優(yōu)選的，上述顯色液的體積為微生物菌懸液的0. 8?1. 2倍。
[0022] 優(yōu)選的，上述顯色液含有80?120mM檸檬酸鈉，180?220mM磷酸氫二鈉，0. 3? 0. 35mM四甲基聯(lián)苯胺和1. 8?2. 2mM過氧化氫，pH為4?5。
[0023] 最優(yōu)選的，上述顯色液含有l(wèi)OOmM檸檬酸鈉，200mM磷酸氫二鈉，0. 32mM四甲基聯(lián) 苯胺和2mM過氧化氫，pH為4. 3。
[0024] 優(yōu)選的，上述顯色反應(yīng)時(shí)間為15?25min，溫度為18?27°C。
[0025] 優(yōu)選的，上述終止液的體積為顯色液體積的0. 4?0. 6倍。
[0026] 優(yōu)選的，上述終止液為硫酸溶液。
[0027] 更優(yōu)選的，上述終止液為1. 8?2. 2M硫酸溶液。
[0028] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但并不局限于此。
[0029] 實(shí)施例1:微生物細(xì)胞色素c漫反射光譜掃描 (1)微生物懸浮液的制備 將微生物保存液以1:50比例接種于含有5ml無菌LB培養(yǎng)基的試管中，在30°C，轉(zhuǎn)速 180rpm振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；將培養(yǎng)菌液以7000g離心5min，倒去上清液收集沉淀，以 HEPES緩沖液洗滌3遍；以HEPES緩沖液將菌液濃度調(diào)至0D600為0. 5左右（約2. 5X108 CFU/mL)，4°C保存待用。
[0030] (2)漫反射光譜掃描 取lcm光徑、lml容積石英比色皿，以lmlHEPES緩沖液為空白，校正積分球紫外的漫 反射吸收光譜；將ffiPES緩沖液換為微生物菌懸液，記錄波長(zhǎng)范圍300-700nm的漫反射吸 收光譜。根據(jù)Kubelka-Munk方程F(R) = (1-R…）V(2R…）=K/S計(jì)算微生物細(xì)胞色素c含 量。
[0031] 實(shí)施例2:快速檢測(cè)微生物胞外呼吸活性的方法 快速檢測(cè)微生物MR-1, SP200, Shewanella decolorationisS12,Pantoea agglomeransMFC-3,Aeromonas hydrophilaHS01,Comamonas guandongensisCY01,Pseudomonas aeruginosaPAH-1,Fontibacter ferrireducensSgZ-2，Thauera humireducensSgZ-1，Escherichia coliK12 矛口 DMS10)胞外呼吸活性方法的示意圖如圖1所示，具體操作步驟為： 1) 在96微孔板中加入100iiL按實(shí)施例1所述方法制備得到上述各微生物的菌懸液； 2) 再在上述96孔板中加入100iiL顯色液（100mM檸檬酸鈉，200mM磷酸氫二鈉，0. 32mM 四甲基聯(lián)苯胺和2mM過氧化氫，pH4. 3)，室溫（18?27°C)顯色反應(yīng)20min; 3) 最后加入50iiL2M硫酸溶液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀檢測(cè)其在450nm處0D值，即可。
[0032] 檢測(cè)結(jié)果如圖4和表1所示，橫坐標(biāo)為上述進(jìn)行檢測(cè)的菌株，縱坐標(biāo)0D45tol值代表 所測(cè)菌株的胞外呼吸活性大小，從圖4和表1中可以看出所測(cè)菌株胞外呼吸活性從大到小 依次為MR-1、SgZ-2、SP200、S12、MFC-3、SgZ-1、CY01、HS01、DMS10、K12、PAH-1。
[0033] 為了研究胞外細(xì)胞色素c是否在本發(fā)明方法中起到主要作用，進(jìn)一步利用漫反射 光譜掃描計(jì)算微生物胞外細(xì)胞色素c的含量，將細(xì)胞色素c的含量與本發(fā)明方法、傳統(tǒng)異化 鐵還原法和生物電流法所測(cè)值做相關(guān)分析。
[0034] 一、微生物胞外細(xì)胞色素c的含量的測(cè)定 將實(shí)施例2中所用到的微生物，按實(shí)施例1所述的方法，進(jìn)行胞外細(xì)胞色素c的含量的 測(cè)定，各微生物在波長(zhǎng)300-700nm范圍內(nèi)的漫反射吸收光譜如圖2A所示，從圖2A中可以看 出具有胞外呼吸功能的菌株在410nm處具有吸收峰，而且不同菌株具有不同吸收峰值；再 根據(jù)Kubelka-Munk方程F(R) = (1-R…）V(2R…）=K/S計(jì)算微生物細(xì)胞色素c含量，結(jié)果 如圖2B所示，從圖2B中可以看出不同菌株的細(xì)胞色素c含量不同。
[0035] 表1所測(cè)菌株的細(xì)胞色素c含量及胞外呼吸活性值

【權(quán)利要求】
1. 一種快速檢測(cè)微生物胞外呼吸活性的方法，其特征在于：包括以下操作步驟： 1) 將待測(cè)的微生物菌懸液中加入顯色液進(jìn)行顯色反應(yīng)； 所述顯色液含有檸檬酸鈉、磷酸氫二鈉、四甲基聯(lián)苯胺和過氧化氫，pH為4?5 ; 2) 往上一步的反應(yīng)液中加入終止液以終止顯色反應(yīng)，然后檢測(cè)反應(yīng)液在450nm處的0D 值； 3) 結(jié)果分析：〇D45(tam值越大說明待測(cè)微生物胞外呼吸活性越強(qiáng)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述的微生物菌懸液中微生物濃度不小 于 2X108 cfu/ml。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述的微生物菌懸液中的液體為生理鹽 水或HEPES緩沖液。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述顯色液的體積為微生物菌懸液的 0? 8 ?1. 2 倍。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的方法，其特征在于：所述顯色液含有80?120mM檸檬酸 鈉，180?220mM磷酸氫二鈉，0. 3?0. 35mM四甲基聯(lián)苯胺和1. 8?2. 2mM過氧化氫，pH為 4?5〇
6. 根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的方法，其特征在于：所述的顯色液含有100mM檸檬酸鈉， 200mM磷酸氫二鈉，0. 32mM四甲基聯(lián)苯胺和2mM過氧化氫，pH為4. 3。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述的顯色反應(yīng)時(shí)間為15?25min，溫度 為 18 ?27°C。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述終止液的體積為顯色液體積的 0? 4 ?0? 6 倍。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1或8所述的方法，其特征在于：所述終止液為硫酸溶液。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1或8所述的方法，其特征在于：所述終止液為1. 8?2. 2M硫酸溶 液。
【文檔編號(hào)】G01N21/31GK104458607SQ201410686040
【公開日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年11月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月24日
【發(fā)明者】溫俊林, 周順桂, 陳俊華, 陸琴 申請(qǐng)人:廣東省生態(tài)環(huán)境與土壤研究所