一種afp、gp73聯(lián)合檢測(cè)試劑盒的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及生物檢測(cè)領(lǐng)域，特別是涉及一種定量檢測(cè)甲胎蛋白AFP、高爾基體糖蛋白-73GP73的檢測(cè)試劑盒及其制備方法和用途。本發(fā)明所述檢測(cè)試劑盒，包括互相獨(dú)立的甲胎蛋白AFP檢測(cè)試紙卡、高爾基體糖蛋白-73GP73檢測(cè)試紙卡，所述檢測(cè)試紙卡均各自包括底板、及位于底板表面的從加樣端開(kāi)始依次排列的樣品墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜和吸水墊。本發(fā)明所提供試劑盒首次將AFP、GP73通過(guò)熒光微球免疫層析技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，兼具靈敏性和特異性，具有操作快速簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)適用等優(yōu)點(diǎn)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】-種AFP、GP73聯(lián)合檢測(cè)試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物檢測(cè)領(lǐng)域，特別是涉及一種AFP、GP73聯(lián)合檢測(cè)試劑盒及其制備 方法和用途。

【背景技術(shù)】
[0002] 甲胎蛋白（alpha fetoprotein, AFP)是胎兒發(fā)育早期由肝臟和卵黃囊合成的一種 糖蛋白，隨著胎兒發(fā)育和出生后年齡的增長(zhǎng)，血液中AFP水平逐漸下降，成人血清AFP濃度 的參考區(qū)間為1_20 iig/L。AFP是肝細(xì)胞肝癌（hepatocellular carcinoma, HCC)的敏感特 異的標(biāo)志物，血清AFP濃度超過(guò)400 ii g/L持續(xù)4周或者200-400 ii g/L持續(xù)5周以上，高度 懷疑肝細(xì)胞肝癌；同時(shí)血清AFP水平還有可用肝癌的大小判斷、肝癌的療效評(píng)估和預(yù)后判 斷。但據(jù)統(tǒng)計(jì)，大約20% -30%的肝細(xì)胞肝癌患者血清AFP水平不高；部分良性肝病，包括 急性肝炎、慢性肝炎和大面積的肝壞死，也會(huì)有血清AFP的升高。因此，用血清AFP作為肝 細(xì)胞肝癌的標(biāo)志物存在一定程度的假陽(yáng)性和假陰性。
[0003] 高爾基體糖蛋白-73 (GolgiProtein 73, GP73)又稱(chēng)II型高爾基體膜蛋白（Golgi phosphoprotein2, GOLPH 2)，其在慢性肝炎、肝硬化等病人血清中濃度升高，而在肝細(xì)胞肝 癌病人血清中升高更加明顯，和正常人或良性肝病病人之間呈顯著差異。有研究表明，血清 GP73用于肝癌的診斷，優(yōu)于血清AFP檢測(cè)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，GP73檢測(cè)肝癌的靈敏度為69%， 特異性為75%。對(duì)于早期肝癌的診斷，GP73的敏感性為62%，而AFP敏感性?xún)H為25%。 AFP水平低于20iig/L的肝癌患者中，有57%的人群6?73水平顯著升高。這表明，6?73的 應(yīng)用能夠大大提高對(duì)AFP陰性的肝癌患者的檢出率。
[0004] 綜上，AFP是經(jīng)典的肝細(xì)胞肝癌的生化標(biāo)志物，GP73新型肝癌標(biāo)志物的典型代表。 相對(duì)而言，GP73的敏感性更高，兩種指標(biāo)單獨(dú)應(yīng)用時(shí)都存在一定程度的假陰性和假陽(yáng)性，如 果通過(guò)恰當(dāng)?shù)姆绞胶褪侄?，同時(shí)聯(lián)合檢測(cè)兩項(xiàng)指標(biāo)，互為補(bǔ)充，將有助于進(jìn)一步降低肝細(xì)胞 肝癌臨床診斷的假陰性和假陽(yáng)性，提高這些標(biāo)志物對(duì)肝細(xì)胞肝癌的診斷性能，更好地為臨 床和患者服務(wù)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 鑒于以上所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的在于提供一種定量檢測(cè)甲胎蛋白 AFP、高爾基體糖蛋白-73GP73的檢測(cè)試劑盒及其制備方法和用途，用于解決現(xiàn)有技術(shù)中的 問(wèn)題。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的及其他相關(guān)目的，本發(fā)明提供一種定量檢測(cè)甲胎蛋白AFP、高爾基 體糖蛋白-73GP73的檢測(cè)試劑盒，包括互相獨(dú)立的甲胎蛋白AFP檢測(cè)試紙卡、高爾基體糖蛋 白-73GP73檢測(cè)試紙卡，所述檢測(cè)試紙卡均各自包括底板、及位于底板表面的從加樣端開(kāi) 始依次排列的樣品墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，所述甲胎蛋白AFP檢測(cè)試紙卡的金 標(biāo)墊上包含甲胎蛋白AFP抗體，所述高爾基體糖蛋白-73GP73檢測(cè)試紙卡的金標(biāo)墊上包含 高爾基體糖蛋白-73GP73抗體，所述各硝酸纖維素膜上包被有檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)，所述金標(biāo) 墊上的甲胎蛋白AFP抗體、高爾基體糖蛋白-73GP73抗體采用熒光微球標(biāo)記。
[0007] 優(yōu)選的，各個(gè)金標(biāo)墊上的抗體采用180nm突光微球標(biāo)記，EX(nm) = 650/Em(nm)= 670,具有信號(hào)受背景干擾小，檢測(cè)靈敏度高，結(jié)果重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)。
[0008] 優(yōu)選的，所述底板為PVC底板。
[0009] 優(yōu)選的，所述各硝酸纖維素膜上，檢測(cè)線(xiàn)位于離加樣端較近一側(cè)，質(zhì)控線(xiàn)位于離加 樣端較遠(yuǎn)一側(cè)。
[0010] 優(yōu)選的，所述甲胎蛋白AFP檢測(cè)試紙卡的檢測(cè)線(xiàn)上包被有甲胎蛋白AFP抗體；所述 高爾基體糖蛋白-73GP73檢測(cè)試紙卡的檢測(cè)線(xiàn)上包被有高爾基體糖蛋白-73GP73抗體。
[0011] 每個(gè)檢測(cè)卡中金標(biāo)墊上的抗體與檢測(cè)線(xiàn)上的抗體可以是相同的抗體，也可以是不 同的抗體。
[0012] 優(yōu)選的，各質(zhì)控線(xiàn)上包被羊抗鼠抗體。
[0013] 優(yōu)選的，所述各樣品墊采用緩沖液處理，所述緩沖液選自PBS緩沖液、TriS-HCl緩 沖液、甘氨酸緩沖液、硼酸鹽緩沖液和檸檬酸-磷酸鹽緩沖液中的一種或多種的組合，緩沖 液的濃度為20-200mM。
[0014] 優(yōu)選的，本發(fā)明所述的各金標(biāo)墊還經(jīng)過(guò)預(yù)處理，預(yù)處理時(shí)所使用的預(yù)處理緩沖液 選自甘氨酸緩沖液、TriS-HCl緩沖液、硼酸鹽緩沖液的一種或多種的組合，緩沖液的濃度為 5_50mM〇
[0015] 優(yōu)選的，所述緩沖液還包括反應(yīng)增強(qiáng)劑，所述反應(yīng)增強(qiáng)劑選自PEG4000、PEG6000、 PEG8000和PEG20000中的任意一種，所述反應(yīng)增強(qiáng)劑的濃度為10?50g/L。
[0016] 優(yōu)選的，所述緩沖溶液還包括表面活性劑，所述表面活性劑選自S-19TWEEN 20、 S-20TWEEN 80、S-13TRIT0N X-45、S-14TRIT0N X-100、S-15TRIT0N X305 中的任意一種或多 種的組合，所述表面活性劑的濃度為10?50g/L。
[0017] 優(yōu)選的，為了使得試劑盒具有更佳的靈敏度和顯色效果，本發(fā)明所述的各金標(biāo)墊 在預(yù)處理時(shí)所使用的預(yù)處理緩沖液包括下列組分：水蘇糖、明礬、果糖二磷酸鈉、六偏磷酸 鈉和甘氨酸，且水蘇糖、明礬、果糖二磷酸鈉、六偏磷酸鈉、甘氨酸的總濃度為3. 5 - 7. 5g/ L，緩沖液的pH值為7. 2 -7.6。
[0018] 優(yōu)選的，各組分在緩沖液中的濃度為：
[0019]

【權(quán)利要求】
1. 一種定量檢測(cè)甲胎蛋白AFP、高爾基體糖蛋白-73GP73的檢測(cè)試劑盒，包括互相獨(dú)立 的甲胎蛋白AFP檢測(cè)試紙卡、高爾基體糖蛋白-73GP73檢測(cè)試紙卡測(cè)試紙卡，所述檢測(cè)試紙 卡均各自包括底板、及位于底板表面的從加樣端開(kāi)始依次排列的樣品墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維 素膜和吸水墊，所述甲胎蛋白AFP檢測(cè)試紙卡的金標(biāo)墊上包含甲胎蛋白AFP抗體，所述高爾 基體糖蛋白-73GP73檢測(cè)試紙卡的金標(biāo)墊上包含高爾基體糖蛋白-73GP73抗體，所述各硝 酸纖維素膜上包被有檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)，所述金標(biāo)墊上的甲胎蛋白AFP抗體、高爾基體糖蛋 白-73GP73抗體采用熒光微球標(biāo)記。
2. 如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述各硝酸纖維素膜上，檢測(cè)線(xiàn)位于 離加樣端較近一側(cè)，質(zhì)控線(xiàn)位于離加樣端較遠(yuǎn)一側(cè)。
3. 如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述甲胎蛋白AFP檢測(cè)試紙卡的檢測(cè) 線(xiàn)上包被有甲胎蛋白AFP抗體；所述高爾基體糖蛋白-73GP73檢測(cè)試紙卡的檢測(cè)線(xiàn)上包被 有高爾基體糖蛋白-73GP73抗體。
4. 如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，各質(zhì)控線(xiàn)上包被羊抗鼠抗體。
5. 如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述各樣品墊采用緩沖液處理，所述 緩沖液選自PBS緩沖液、Tris-HCl緩沖液、甘氨酸緩沖液、硼酸鹽緩沖液和檸檬酸-磷酸鹽 緩沖液中的一種或多種的組合，緩沖液的濃度為20-200mM。
6. 如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述各金標(biāo)墊采用緩沖液處理，所述 緩沖液選自甘氨酸緩沖液、Tris-HCl緩沖液、硼酸鹽緩沖液的一種或多種的組合，緩沖液的 濃度為5-50mM。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述緩沖液中還包括反應(yīng)增強(qiáng)劑， 所述反應(yīng)增強(qiáng)劑選自PEG4000、PEG6000、PEG8000和PEG20000中的任意一種，所述反應(yīng)增強(qiáng) 劑的濃度為10?50g/L。
8. 如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，還包括卡殼，所述卡殼包括背卡和上 蓋，所述背卡設(shè)有兩個(gè)平行的試紙卡卡槽，所述試紙卡嵌于所述試紙卡卡槽內(nèi)，所述上蓋設(shè) 有兩個(gè)測(cè)試窗和兩個(gè)加樣孔，所述兩個(gè)測(cè)試窗的位置分別與兩個(gè)試紙卡的檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn) 的位置相配合，所述兩個(gè)加樣孔的位置與兩個(gè)試紙卡的樣品墊的位置相配合。
9. 如權(quán)利要求8所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述兩個(gè)加樣孔之間還設(shè)有連接兩 個(gè)加樣孔的橫槽。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1?9任一權(quán)利要求所述的檢測(cè)試劑盒的制備方法，具體包括如下步 驟： 1) 用熒光微球標(biāo)記的甲胎蛋白AFP抗體、高爾基體糖蛋白-73GP73抗體溶液分別噴涂 各自對(duì)應(yīng)的金標(biāo)墊，制得分別包含甲胎蛋白AFP抗體、高爾基體糖蛋白-73GP73抗體的金標(biāo) 墊； 2) 在甲胎蛋白AFP檢測(cè)試紙卡的硝酸纖維素膜的檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)上分別噴涂甲胎蛋 白AFP抗體及羊抗鼠抗體；在高爾基體糖蛋白-73GP73檢測(cè)試紙卡的硝酸纖維素膜的檢測(cè) 線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)上分別噴涂高爾基體糖蛋白-73GP73抗體及羊抗鼠抗體； 3) 將兩套樣品墊、步驟1)制備的兩套金標(biāo)墊、步驟2)制備的兩套硝酸纖維素膜、兩套 吸水墊依次粘貼在底板上，切裁制得檢測(cè)試紙卡；最后將檢測(cè)試紙卡裝入卡殼制得檢測(cè)試 劑盒。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK104360082SQ201410736170
【公開(kāi)日】2015年2月18日 申請(qǐng)日期:2014年12月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月5日
【發(fā)明者】潘能科 申請(qǐng)人:重慶乾德生物技術(shù)有限公司