基于rs2032582的檢測(cè)氯氮平用藥效果的試劑盒及其使用方法
【專利摘要】基于rs2032582的檢測(cè)氯氮平用藥效果的試劑盒及其使用方法，本發(fā)明涉及一種基因技術(shù)領(lǐng)域的ABCB1基因第八號(hào)外顯子的單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)方法。本發(fā)明涉及一種分離的含單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的核苷酸，所述核苷酸的序列如SEQ ID NO:1所示，所述單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)位于第3169位，rs2032582為C→T。本發(fā)明涉及一種檢測(cè)前述核苷酸的方法，包括如下步驟：步驟一，檢測(cè)如SEQ ID NO：1所示序列的第3169位的核苷酸；步驟二，采用Taqman?MGB分型方法，檢測(cè)第3169位否存在單核苷酸多態(tài)性。本發(fā)明為研究ABCB1基因多態(tài)性與臨床用藥安全的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)，為臨床用藥個(gè)體化提供理論基礎(chǔ)，同時(shí)也為基于藥物基因組學(xué)理念的新藥研發(fā)提供指導(dǎo)依據(jù)。
【專利說(shuō)明】
基于rs2032582的檢測(cè)氯氮平用藥效果的試劑盒及其使用 方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及基因技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種ABCBl基因第八號(hào)外顯子的單核巧酸多 態(tài)性的檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 氯氮平（Clozapine)化學(xué)名為8-氯-11-(4-甲基-1-贓嗦基）-甜-二苯并[b，e] [1， 4]二氮雜卓，分子式Cl細(xì)19C1N4。氯氮平是國(guó)內(nèi)最普遍的治療精神疾病的藥物，不僅對(duì)精神 病陽(yáng)性癥狀有效，對(duì)陰性癥狀也有一定效果。適用于急性與慢性精神分裂癥的各個(gè)亞型，對(duì) 幻覺(jué)妄想型、青春型效果好。也可W減輕與精神分裂癥有關(guān)的情感癥狀(如抑郁、負(fù)罪感、焦 慮等癥狀）。然而，氯氮平在臨床中的藥效和藥物副作用都有明顯的個(gè)體差異，原因是其代 謝受到遺傳因素及環(huán)境因素的影響，但遺傳因素是最主要的原因。因此開(kāi)發(fā)更多的與氯氮 平代謝相關(guān)的分子標(biāo)記物從而對(duì)患者實(shí)現(xiàn)個(gè)體化治療是非常有必要的。
[0003] ABCBl(ATP binding cassette subfamily B member 1)基因又稱為多藥耐藥基 因（MDRl) dABCBI基因位于人類第7號(hào)染色體q21.1上，其CDNA全長(zhǎng)4669bp，包含29個(gè)外顯子， 轉(zhuǎn)錄可得到4.化b的mRNA，編碼一個(gè)長(zhǎng)度為170kDa的跨膜糖蛋白（P-gp) dP-糖蛋白是由1280 個(gè)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)成，是遺傳上高度保守的ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體超家族的一個(gè)重要成員，也 是ATP依賴的外向轉(zhuǎn)運(yùn)體。P-糖蛋白表達(dá)于腸上皮細(xì)胞膜，官腔膜，肝內(nèi)膽管細(xì)胞膜，腎臟近 曲小管細(xì)胞膜，并與毛細(xì)血管上皮共同構(gòu)成的血腦屏障，其主要功能是阻止藥物及外來(lái)物 質(zhì)進(jìn)入機(jī)體組織內(nèi)部，如抗抑郁藥物、抗腫瘤藥、糖皮質(zhì)激素和淀粉樣蛋白等。由于P-gp對(duì) 外源性物質(zhì)和藥物等的外排作用，ABCBl基因多態(tài)性和P-甜表達(dá)的不同，可導(dǎo)致不同群體或 個(gè)體對(duì)某些疾病存在不同的易感性。由于ABCBl基因在抗精神疾病藥物代謝中的作用及活 性存在個(gè)體差異，因此尋找氯氮平代謝與ABCBl基因多態(tài)性的關(guān)系是現(xiàn)有技術(shù)急需解決的 難題。對(duì)現(xiàn)有文獻(xiàn)的檢索，
【申請(qǐng)人】未發(fā)現(xiàn)有本發(fā)明的ABCBl基因第八號(hào)外顯子SNP rs2032582為氯氮平分子標(biāo)記物的相關(guān)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種ABCBl基因第八號(hào)外顯子的單 核巧酸多態(tài)性的檢測(cè)方法。本發(fā)明為研究ABCBl基因多態(tài)性與臨床用藥安全的關(guān)系奠定了 基礎(chǔ)，為臨床用藥個(gè)體化提供理論基礎(chǔ)，同時(shí)也為基于藥物基因組學(xué)理念的新藥研發(fā)提供 指導(dǎo)依據(jù)。
[0005] 本發(fā)明是通過(guò)W下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，
[0006] 第一方面，本發(fā)明提供一種分離的含單核巧酸多態(tài)性位點(diǎn)的核巧酸，所述核巧酸 的序列如SEQ ID NO: 1所示，所述單核巧酸多態(tài)性位點(diǎn)位于第3169位，rs2032582為C一T。
[0007] 第二方面，本發(fā)明提供一種所述的核巧酸在制備檢測(cè)氯氮平用藥效果的試劑盒中 的用途。
[000引第S方面，本發(fā)明提供一種分離的核巧酸，所述核巧酸的序列如SEQ ID NO: I所 示，且第3169位為C。
[0009]第四方面，本發(fā)明提供一種檢測(cè)氯氮平用藥效果的試劑盒，所述試劑盒包括:根據(jù) 如SEQ ID NO: 1所示序列的單核巧酸多態(tài)性位點(diǎn)rs2032582設(shè)計(jì)的引物對(duì)，探針。
[0010]優(yōu)選地，所述引物對(duì)為：
[0011] 正向引物5 ' -CTGGACAAGCACTGAAAGATAA-3 '
[0012] 反向引物5' -AGAGCATAGTAAGCAGTAGGGAGTA-3'。
[0013] 優(yōu)選地，所述探針為：
[0014] 正向 5 ' -FAM-TAGAAGGTCCTGGGAAGGTG-NFQ-MGB-3 '
[0015] 反向5 ' -VIC-TAGAAGGTTCTGGGAAGGTG-NFQ-MGB-3 '。
[0016] 第五方面，本發(fā)明提供一種所述的試劑盒的非診斷目的使用方法，包括如下步驟： [0017] 步驟一，提取樣品DNA;
[0018]步驟二，利用所述引物進(jìn)行擴(kuò)增，得擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0019] 步驟立，采用I^qman-MGB分型方法，結(jié)合探針，檢測(cè)樣品中是否存在如沈Q ID NO: 1所示的單核巧酸多態(tài)性位點(diǎn)rs2032582。
[0020] 優(yōu)選地，步驟S包括如下步驟:采用AB 口 700巧光定量PCR儀，對(duì)所取樣品的位點(diǎn) rs2032582進(jìn)行分型，檢測(cè)第3169位否存在單核巧酸多態(tài)性。
[0021] 優(yōu)選地，所述擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為50-150bp。
[0022] 優(yōu)選地，所述引物的長(zhǎng)度為15-2化P。
[0023] 優(yōu)選地，步驟二中，所述擴(kuò)增的具體條件如下：
[0024] 反應(yīng)體系總體積為化1，其中， 2XMaster Mix 2, 5叫， 40 XT訝巧m理n徑每DOtyp巧訝忍沒(méi)珠 y 1*乏目1^1， DNA 模板 5-lOng,
[0025] 化pM雄Q ID恥.3 化鄒U IOpM沈Q巧N化4 觀那1， 雙蒸水 補(bǔ)足奎加1;
[0026] PCR 反應(yīng)條件：94°C2mins;40X(94°C30s;58°C30s，72°C30s)72°C10mins。
[0027] 第六方面，本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)所述核巧酸的SNP位點(diǎn)的引物對(duì)，所述引物對(duì) 為：
[002引 正向引物5 ' -CTGGACAAGCACTGAAAGATAA-3 '
[00巧]反向引物5 ' -AGAGCATAGTAAGCAGTAGGGAGTA-3 '。
[0030] 第屯方面，本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)如權(quán)利要求1所述核巧酸的SNP位點(diǎn)的探針， 所述探針為：
[0031] 正向 5 ' -FM-TAGAAGGTCCTGGGAAGGTG-NFQ-MGB-3 '
[0032] 反向5'-￥1014644661'1'口'666446616-肥9-168-3'。
[0033] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果:本發(fā)明為研究ABCBl基因多態(tài)性與 臨床用藥安全的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)，為臨床用藥個(gè)體化提供理論基礎(chǔ)，同時(shí)也為基于藥物基 因組學(xué)理念的新藥研發(fā)提供指導(dǎo)依據(jù)。
【具體實(shí)施方式】
[0034]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，運(yùn)些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常照常規(guī)條件， 例如Sambrook等人的分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)（New York = Cold Spring化rbor LaboratoiT Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[003引實(shí)施例
[0036] 本發(fā)明設(shè)及ABCBl基因第八號(hào)外顯子SNP rs2032582的單核巧酸多態(tài)性的檢測(cè)方 法，同時(shí)設(shè)及相關(guān)的分離核酸W及引物。本發(fā)明通過(guò)關(guān)聯(lián)分析意外發(fā)現(xiàn)了 ABCBl基因第八號(hào) 外顯子上的SNP rs2032582能夠作為氯氮平的分子標(biāo)記物，該ABCBl基因的具體信息為 ABCB1基因 LOCUS NC_000007，全長(zhǎng)20946化P，本發(fā)明采用I'aqman-MGB探針技術(shù)對(duì)ABCB1基因 的第八號(hào)外顯子SNP位點(diǎn)及其頻率分布情況進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)ABCBl基因的第八號(hào)外顯子 第27439位C一 T多態(tài)性，即其所編碼的蛋白質(zhì)序列中第893位氨基酸Arg(R) 一化S化)多態(tài)， 即SNP rs2032582eABCBl基因在染色體位置：Homo sapiens 地'〇111〇3〇11167,61?畑38.口2 (87503863. .87713323)，SNP rs2032582在染色體位置Chromosome:7:87531302。本發(fā)明中 設(shè)及ABCBl基因的具體核巧酸片段序列如SEQ ID NO. 1所示，其中單核巧酸多態(tài)性位點(diǎn)位于 序列的第3169位。
[0037] 本發(fā)明針對(duì)該SNP rs2032582設(shè)及了相關(guān)的引物對(duì)和探針。
[003引具體而言，本發(fā)明在ABCBl基因第八號(hào)外顯子上的SNP rs2032582上下游設(shè)計(jì) I^qman-MGB引物，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度50-150bp;在上下游引物之間設(shè)計(jì)I'aqman-MGB探針，探針長(zhǎng) 15-2加 P。之后用AB 口 700巧光定量PCR儀對(duì)所取樣品ABCBl基因 SNP位點(diǎn)rs2032582進(jìn)行分 型，發(fā)現(xiàn)ABCBl基因第八號(hào)外顯子SNP(即第27439位C一T多態(tài)性），頻率為0.255。經(jīng)分析發(fā) 現(xiàn)，該SNP導(dǎo)致第893位氨基酸由S [Ser] A [Ala]。由于運(yùn)是不同性質(zhì)氨基酸的置換，因 此會(huì)導(dǎo)致ABCBl基因所編碼的蛋白活性發(fā)生改變。
[0039] 本發(fā)明有大量的分析技術(shù)可用于檢測(cè)ABCBl基因第八號(hào)外顯子中所述位點(diǎn)是否存 在單核巧酸多態(tài)性。運(yùn)些技術(shù)包括(但并不限于）：DNA測(cè)序、雜交測(cè)序;酶促錯(cuò)配切割、異源 雙鏈分析、點(diǎn)雜交、寡核巧酸陣列(DNA忍片）、Mini-sequencing、分子信標(biāo)等，變性高效液相 色譜法(畑PLC)。另一方面，本發(fā)明的檢測(cè)方法被用于評(píng)估個(gè)體ABCBl基因第八號(hào)外顯子SNP rs2032582多態(tài)性與氯氮平代謝的關(guān)系。用于本發(fā)明的測(cè)試樣品沒(méi)有特別限制，對(duì)于檢測(cè) SNP而言，可W是從血液、組織等分離樣品中抽提出的DNA或mRNA。對(duì)于ABCBl基因第八號(hào)外 顯子活性而言，可W任何含有ABCBl基因第八號(hào)外顯子的樣品，如血液等。
[0040] 所述的"分離出的或純化的"是指在基因組DNA水平上，利用引物對(duì)來(lái)擴(kuò)增每個(gè)多 態(tài)性位點(diǎn)的基因序列和利用純化試劑盒對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行提純。
[0041] W下是對(duì)本發(fā)明方案的具體實(shí)施過(guò)程：
[0042] 本實(shí)施例采用的樣品來(lái)自上海市精神衛(wèi)生中屯、的995個(gè)精神分裂癥患者血液樣 品，年齡18-60歲，全體參與者均由家屬在正式的知情同意書(shū)上同意簽字。本實(shí)施例設(shè)及的 ABCBl基因第八號(hào)外顯子的CDNA序列列于SEQ ID NO: 1，其所編碼的氨基酸序列列于SEQ ID NO: 2 ;ABCB1基因第八號(hào)外顯子的基因組序列可W從GenBank中獲得。
[0043] 引物設(shè)計(jì):采用Primer 5.0軟件，WGenBank數(shù)據(jù)庫(kù)ABCBl基因（ID:5243)第八號(hào)外 顯子W及外顯子與內(nèi)含子接合部位序列為模板設(shè)計(jì)一對(duì)引物，由Invitrogen公司合成。
[0044] 引物信息：
[0045] 擴(kuò)增ABCBl基因第八號(hào)外顯子SNP位點(diǎn)的DNA序列引物信息：
[0046] 正向引物5'-CTGGACAAGCACTGAAAGATAA-3'（沈Q ID N0:3)
[0047] 反向引物5'-AGAGCATAGTAAGCAGTAGGGAGTA-3'（沈Q ID N0:4)。
[004 引 I'aqman-MGB 探針：
[0049]正向5'-FM-TAGAAGGTCCTGGGAAGGTG(沈Q ID N0:5)-NFQ-MGB-3'
[0化0]反向5'-VIC-TAGAAGGTTCTGGGAAGGTG(SEQ ID N0:6)-NFQ-MGB-3'。
[0051] PCR擴(kuò)增條件：（體系各項(xiàng)試劑由ABI公司提供，易可W從公開(kāi)的渠道獲得），
[0化2] 反應(yīng)體系總體積為化1，其中； 2 X Master .Mix 2. 5l4.,， 40 X Taqma打鞋en'位typ貸 a呂say 1，251^1， DNA 撥板 5-IOng,
[0化3] IOpM S啟妨腑.S 0. 2)4， IDpM SEQ ID No. 4 0. 2W, 雙蒸水 補(bǔ)足至日拍；
[0054] PCR 反應(yīng)條件：94°C2mins;40X(94°C30s;58°C30s，72°C30s)72°C10mins。
[0055] 上述PCR反應(yīng)在96孔板中進(jìn)行，置于AB口700巧光定量PCR儀中，讀出各個(gè)樣品中 ABCBl基因第八號(hào)外顯子SNP rs2032582多態(tài)性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。
[0化6]比較發(fā)現(xiàn)ABCBl基因第八號(hào)外顯子SNP有多態(tài)性（即第27439位C一 T)，頻率為 0.255。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，該SNP導(dǎo)致第893位氨基酸由S[Ser]與A [Ala];關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)ABCBl 基因第八號(hào)外顯子SNP rs2032582的C基因型與T基因型患者用氯氮平治療前后有顯著的個(gè) 體差異，P值為0.028。
[0057] 綜上所述，本發(fā)明為研究ABCBl基因多態(tài)性與臨床用藥安全的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)，為 臨床用藥個(gè)體化提供理論基礎(chǔ)，同時(shí)也為基于藥物基因組學(xué)理念的新藥研發(fā)提供指導(dǎo)依 據(jù)。
[0058] W上對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了描述。需要理解的是，本發(fā)明并不局限于上述 特定實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可W在權(quán)利要求的范圍內(nèi)做出各種變形或修改，運(yùn)并不影 響本發(fā)明的實(shí)質(zhì)內(nèi)容。
[0化9] 表1
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種分離的含單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的核苷酸，其特征在于，所述核苷酸的序列如SEQ ID N0:1所示，所述單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)位于第3169位，rs2032582為C-T。2. -種如權(quán)利要求1所述的核苷酸在制備檢測(cè)氯氮平用藥效果的試劑盒中的用途。3. -種分離的核苷酸，其特征在于，所述核苷酸的序列如SEQ ID NO: 1所示，且第3169 位為C。4. 一種檢測(cè)氯氮平用藥效果的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括:根據(jù)如SEQ ID NO: 1所示序列的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs2032582設(shè)計(jì)的引物對(duì)，探針。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征是，所述引物對(duì)為： 正向引物5 ' -CTGGACAAGCACTGAAAGATAA-3 ' 反向引物5 ' -AGAGCATAGTAAGCAGTAGGGAGTA-3 '。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征是，所述探針為： 正向 5 ' -FAM-TAGAAGGTCCTGGGAAGGTG-NFQ-MGB-3 ' 反向5 '-VIC-TAGAAGGTTCTGGGAAGGTG-NFQ-MGB-3 '。7. -種如權(quán)利要求4所述的試劑盒的非診斷目的使用方法，其特征在于，包括如下步 驟： 步驟一，提取樣品DNA; 步驟二，利用所述引物進(jìn)行擴(kuò)增，得擴(kuò)增產(chǎn)物； 步驟三，采用Taqman-MGB分型方法，結(jié)合探針，檢測(cè)樣品中是否存在如SEQ ID N0:1所 示的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs2032582。8. 如權(quán)利要求7所述的使用方法，其特征是，步驟三包括如下步驟:采用ABI7700熒光定 量PCR儀，對(duì)所取樣品的位點(diǎn)rs2032582進(jìn)行分型，檢測(cè)第3169位否存在單核苷酸多態(tài)性。9. 如權(quán)利要求7所述的使用方法，其特征是，所述擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為50-150bp。10. 如權(quán)利要求7所述的使用方法，其特征是，所述引物的長(zhǎng)度為15-25bp。11. 如權(quán)利要求7所述的使用方法，其特征在于，步驟二中，所述擴(kuò)增的具體條件如下： 反應(yīng)體系總體積為5μ1，其中， 2 XMaster Mix 2. 5M-1, 40. Taqman genotype as：say 1. 25^-1? DNA 模板 5-l〇n.g..，. ΙΟρΜ SEQ ID No. 3 0. 2Ml， ΙΟρΜ SEQ ID Να 4 0. 2μΙ, 雙蒸水 補(bǔ)足至:_5u_.l; PCR反應(yīng)條件：94 °C 2mins; 40 X (94 °C 30s; 58 °C 30s，72 °C 30s) 72 °C lOmins。12. -種用于檢測(cè)如權(quán)利要求1所述核苷酸的SNP位點(diǎn)的引物對(duì)，其特征在于，所述引物 對(duì)為： 正向引物5 ' -CTGGACAAGCACTGAAAGATAA-3 ' 反向引物5 ' -AGAGCATAGTAAGCAGTAGGGAGTA-3 '。13. -種用于檢測(cè)如權(quán)利要求1所述核苷酸的SNP位點(diǎn)的探針，其特征在于，所述探針 為： 正向 5 ' -FAM-TAGAAGGTCCTGGGAAGGTG-NFQ-MGB-3 ' 反向5 '-VIC-TAGAAGGTTCTGGGAAGGTG-NFQ-MGB-3 '。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK105861686SQ201610298347
【公開(kāi)日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年5月6日
【發(fā)明人】秦勝營(yíng), 周偉, 徐青青, 沈陸, 賀林
【申請(qǐng)人】上海交通大學(xué)