一種afp、pivka-ⅱ聯(lián)合檢測(cè)試劑盒的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及生物檢測(cè)領(lǐng)域，特別是涉及一種定量檢測(cè)甲胎蛋白AFP、維生素K缺乏或拮抗劑-II誘導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白PIVKA-Ⅱ的檢測(cè)試劑盒及其制備方法和用途。本發(fā)明所述檢測(cè)試劑盒，包括互相獨(dú)立的甲胎蛋白AFP檢測(cè)試紙卡和維生素K缺乏或拮抗劑-II誘導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白PIVKA-Ⅱ檢測(cè)試紙卡，所述檢測(cè)試紙卡均各自包括底板、及位于底板表面的從加樣端開(kāi)始依次排列的樣品墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜和吸水墊。本發(fā)明所提供試劑盒首次將AFP和PIVKA-Ⅱ通過(guò)熒光微球免疫層析技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，兼具靈敏性和特異性，具有操作快速簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)適用等優(yōu)點(diǎn)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】-種AFP、PIVKA- II聯(lián)合檢測(cè)試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物檢測(cè)領(lǐng)域，特別是涉及一種AFP、PIVKA- II聯(lián)合檢測(cè)試劑盒及其 制備方法和用途。

【背景技術(shù)】
[0002] 甲胎蛋白（alpha fetoprotein, AFP)是胎兒發(fā)育早期由肝臟和卵黃囊合成的一種 糖蛋白，隨著胎兒發(fā)育和出生后年齡的增長(zhǎng)，血液中AFP水平逐漸下降，成人血清AFP濃度 的參考區(qū)間為1_20 iig/L。AFP是肝細(xì)胞肝癌（hepatocellular carcinoma, HCC)的敏感特 異的標(biāo)志物，血清AFP濃度超過(guò)400 ii g/L持續(xù)4周或者200-400 ii g/L持續(xù)5周以上，高度 懷疑肝細(xì)胞肝癌；同時(shí)血清AFP水平還有可用肝癌的大小判斷、肝癌的療效評(píng)估和預(yù)后判 斷。但據(jù)統(tǒng)計(jì)，大約20% -30%的肝細(xì)胞肝癌患者血清AFP水平不高；部分良性肝病，包括 急性肝炎、慢性肝炎和大面積的肝壞死，也會(huì)有血清AFP的升高。因此，用血清AFP作為肝 細(xì)胞肝癌的標(biāo)志物存在一定程度的假陽(yáng)性和假陰性。
[0003] 維生素 K缺乏或拮抗劑-II誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)（Protein Induced by Vitamin K Absence or Antagonist_II，PIVKA- II )，又叫脫 羧基凝血酶原（Des-gamma-carboxy prothrombin, DCP)或異常凝血酶原，1984年首次被認(rèn)定為原發(fā)性肝癌的標(biāo)志物。肝細(xì)胞肝 癌患者血清中PIVKA- II濃度水平遠(yuǎn)高于肝硬化和轉(zhuǎn)移性肝癌患者，而且其血清濃度變化 和患者肝細(xì)胞癌的動(dòng)態(tài)變化（手術(shù)、治療和復(fù)發(fā)等）相關(guān)。后來(lái)的研究證實(shí)，PIVKA- II和 AFP檢測(cè)可以互為補(bǔ)充，二者的聯(lián)合檢測(cè)可以將肝細(xì)胞肝癌的診斷率提高到84%，僅大約 16%的肝細(xì)胞肝癌患者兩者都呈陰性結(jié)果。目前PIVKA- II檢測(cè)已被列入《日本肝癌學(xué)會(huì)肝 癌診療規(guī)范2009年版》中，用于肝細(xì)胞癌高危人群的篩查及原發(fā)性肝癌的輔助診斷；我國(guó) 衛(wèi)生部發(fā)布的《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范（2011年版）》中用于肝細(xì)胞癌輔助診斷的標(biāo)志物也包 括PIVKA-II。
[0004] 綜上，AFP是經(jīng)典的肝細(xì)胞肝癌的生化標(biāo)志物，PIVKA- II是新型肝癌標(biāo)志物的典 型代表。相對(duì)而言，而PIVKA- II的特異性更好，兩種指標(biāo)單獨(dú)應(yīng)用時(shí)都存在一定程度的假 陰性和假陽(yáng)性，如果通過(guò)恰當(dāng)?shù)姆绞胶褪侄危瑫r(shí)聯(lián)合檢測(cè)兩項(xiàng)指標(biāo)，互為補(bǔ)充，將有助于 進(jìn)一步降低肝細(xì)胞肝癌臨床診斷的假陰性和假陽(yáng)性，提高這些標(biāo)志物對(duì)肝細(xì)胞肝癌的診斷 性能，更好地為臨床和患者服務(wù)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 鑒于以上所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的在于提供一種定量檢測(cè)甲胎蛋白 AFP、維生素 K缺乏或拮抗劑-II誘導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白PIVKA- II的檢測(cè)試劑盒及其制備方法和 用途，用于解決現(xiàn)有技術(shù)中的問(wèn)題。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的及其他相關(guān)目的，本發(fā)明提供一種定量檢測(cè)甲胎蛋白AFP、維生素 K缺乏或拮抗劑-II誘導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白PIVKA- II的檢測(cè)試劑盒，包括互相獨(dú)立的甲胎蛋白 AFP檢測(cè)試紙卡和維生素 K缺乏或拮抗劑-II誘導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白PIVKA- II檢測(cè)試紙卡，所述 檢測(cè)試紙卡均各自包括底板、及位于底板表面的從加樣端開(kāi)始依次排列的樣品墊、金標(biāo)墊、 硝酸纖維素膜和吸水墊，所述甲胎蛋白AFP檢測(cè)試紙卡的金標(biāo)墊上包含甲胎蛋白AFP抗體， 所述維生素 K缺乏或拮抗劑-II誘導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白PIVKA- II檢測(cè)試紙卡的金標(biāo)墊上包含維 生素 K缺乏或拮抗劑-II誘導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白PIVKA- II抗體，所述各硝酸纖維素膜上包被有檢 測(cè)線和質(zhì)控線，所述金標(biāo)墊上的甲胎蛋白AFP抗體和維生素 K缺乏或拮抗劑-II誘導(dǎo)產(chǎn)生 的蛋白PIVKA- II抗體采用熒光微球標(biāo)記。
[0007] 優(yōu)選的，各個(gè)金標(biāo)墊上的抗體采用180nm突光微球標(biāo)記，EX(nm) = 650/Em(nm)= 670,具有信號(hào)受背景干擾小，檢測(cè)靈敏度高，結(jié)果重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)。
[0008] 優(yōu)選的，所述底板為PVC底板。
[0009] 優(yōu)選的，所述各硝酸纖維素膜上，檢測(cè)線位于離加樣端較近一側(cè)，質(zhì)控線位于離加 樣端較遠(yuǎn)一側(cè)。
[0010] 優(yōu)選的，所述甲胎蛋白AFP檢測(cè)試紙卡的檢測(cè)線上包被有甲胎蛋白AFP抗體；所述 維生素 K缺乏或拮抗劑-II誘導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白PIVKA- II檢測(cè)試紙卡的檢測(cè)線上包被有維生 素 K缺乏或拮抗劑-II誘導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白PIVKA- II抗體。
[0011] 每個(gè)檢測(cè)卡中金標(biāo)墊上的抗體與檢測(cè)線上的抗體可以是相同的抗體，也可以是不 同的抗體。
[0012] 優(yōu)選的，各質(zhì)控線上包被羊抗鼠抗體。
[0013] 優(yōu)選的，所述各樣品墊采用緩沖液處理，所述緩沖液選自PBS緩沖液、TriS-HCl緩 沖液、甘氨酸緩沖液、硼酸鹽緩沖液和檸檬酸-磷酸鹽緩沖液中的一種或多種的組合，緩沖 液的濃度為20-200mM。
[0014] 優(yōu)選的，本發(fā)明所述的各金標(biāo)墊還經(jīng)過(guò)預(yù)處理，預(yù)處理時(shí)所使用的預(yù)處理緩沖液 選自甘氨酸緩沖液、TriS-HCl緩沖液、硼酸鹽緩沖液的一種或多種的組合，緩沖液的濃度為 5_50mM〇
[0015] 優(yōu)選的，所述緩沖液還包括反應(yīng)增強(qiáng)劑，所述反應(yīng)增強(qiáng)劑選自PEG4000、PEG6000、 PEG8000和PEG20000中的任意一種，所述反應(yīng)增強(qiáng)劑的濃度為10?50g/L。
[0016] 優(yōu)選的，所述緩沖溶液還包括表面活性劑，所述表面活性劑選自S-19TWEEN 20、 S-20TWEEN 80、S-13TRIT0N X-45、S-14TRIT0N X-100、S-15TRIT0N X305 中的任意一種或多 種的組合，所述表面活性劑的濃度為10?50g/L。
[0017] 優(yōu)選的，為了使得試劑盒具有更佳的靈敏度和顯色效果，本發(fā)明所述的各金標(biāo)墊 在預(yù)處理時(shí)所使用的預(yù)處理緩沖液包括下列組分：水蘇糖、明礬、果糖二磷酸鈉、六偏磷酸 鈉和甘氨酸，且水蘇糖、明礬、果糖二磷酸鈉、六偏磷酸鈉、甘氨酸的總濃度為3. 5 - 7. 5g/ L，緩沖液的pH值為7. 2 -7.6。
[0018] 優(yōu)選的，各組分在緩沖液中的濃度為：
[0019]

【權(quán)利要求】
1. 一種定量檢測(cè)甲胎蛋白AFP、維生素K缺乏或拮抗劑-II誘導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白PIVKA- II 的檢測(cè)試劑盒，包括互相獨(dú)立的甲胎蛋白AFP檢測(cè)試紙卡和維生素K缺乏或拮抗劑-II誘 導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白PIVKA- II檢測(cè)試紙卡，所述檢測(cè)試紙卡均各自包括底板、及位于底板表面的 從加樣端開(kāi)始依次排列的樣品墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，所述甲胎蛋白AFP檢測(cè) 試紙卡的金標(biāo)墊上包含甲胎蛋白AFP抗體，所述維生素K缺乏或拮抗劑-II誘導(dǎo)產(chǎn)生的 蛋白PIVKA- II檢測(cè)試紙卡的金標(biāo)墊上包含維生素K缺乏或拮抗劑-II誘導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白 PIVKA- II抗體，所述各硝酸纖維素膜上包被有檢測(cè)線和質(zhì)控線，所述金標(biāo)墊上的甲胎蛋白 AFP抗體和維生素K缺乏或拮抗劑-II誘導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白PIVKA- II抗體采用熒光微球標(biāo)記。
2. 如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述各硝酸纖維素膜上，檢測(cè)線位于 離加樣端較近一側(cè)，質(zhì)控線位于離加樣端較遠(yuǎn)一側(cè)。
3. 如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述甲胎蛋白AFP檢測(cè)試紙卡的檢測(cè) 線上包被有甲胎蛋白AFP抗體；所述維生素K缺乏或拮抗劑-II誘導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白PIVKA- II 檢測(cè)試紙卡的檢測(cè)線上包被有維生素K缺乏或拮抗劑-II誘導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白PIVKA- II抗體。
4. 如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，各質(zhì)控線上包被羊抗鼠抗體。
5. 如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述各樣品墊采用緩沖液處理，所述 緩沖液選自PBS緩沖液、Tris-HCl緩沖液、甘氨酸緩沖液、硼酸鹽緩沖液和檸檬酸-磷酸鹽 緩沖液中的一種或多種的組合，緩沖液的濃度為20-200mM。
6. 如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述各金標(biāo)墊采用緩沖液處理，所述 緩沖液選自甘氨酸緩沖液、Tris-HCl緩沖液、硼酸鹽緩沖液的一種或多種的組合，緩沖液的 濃度為5-50mM。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述緩沖液中還包括反應(yīng)增強(qiáng)劑， 所述反應(yīng)增強(qiáng)劑選自PEG4000、PEG6000、PEG8000和PEG20000中的任意一種，所述反應(yīng)增強(qiáng) 劑的濃度為10?50g/L。
8. 如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，還包括卡殼，所述卡殼包括背卡和上 蓋，所述背卡設(shè)有兩個(gè)平行的試紙卡卡槽，所述試紙卡嵌于所述試紙卡卡槽內(nèi)，所述上蓋設(shè) 有兩個(gè)測(cè)試窗和兩個(gè)加樣孔，所述三個(gè)測(cè)試窗的位置分別與兩個(gè)試紙卡的檢測(cè)線和質(zhì)控線 的位置相配合，所述兩個(gè)加樣孔的位置與兩個(gè)試紙卡的樣品墊的位置相配合。
9. 如權(quán)利要求8所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述兩個(gè)加樣孔之間還設(shè)有連接兩 個(gè)加樣孔的橫槽。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1?9任一權(quán)利要求所述的檢測(cè)試劑盒的制備方法，具體包括如下步 驟： 1) 用熒光微球標(biāo)記的甲胎蛋白AFP抗體和維生素K缺乏或拮抗劑-II誘導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白 PIVKA- II抗體溶液分別噴涂各自對(duì)應(yīng)的金標(biāo)墊，制得分別包含甲胎蛋白AFP抗體和維生素 K缺乏或拮抗劑-II誘導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白PIVKA- II抗體的金標(biāo)墊； 2) 在甲胎蛋白AFP檢測(cè)試紙卡的硝酸纖維素膜的檢測(cè)線和質(zhì)控線上分別噴涂甲胎蛋 白AFP抗體及羊抗鼠抗體；在維生素K缺乏或拮抗劑-II誘導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白PIVKA- II檢測(cè)試 紙卡的硝酸纖維素膜的檢測(cè)線和質(zhì)控線上分別噴涂維生素K缺乏或拮抗劑-II誘導(dǎo)產(chǎn)生的 蛋白PIVKA- II抗體及羊抗鼠抗體； 3) 將兩套樣品墊、步驟1)制備的兩套金標(biāo)墊、步驟2)制備的兩套硝酸纖維素膜、兩套 吸水墊依次粘貼在底板上，切裁制得檢測(cè)試紙卡；最后將檢測(cè)試紙卡裝入卡殼制得檢測(cè)試 劑盒。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK104391122SQ201410737893
【公開(kāi)日】2015年3月4日 申請(qǐng)日期:2014年12月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月5日
【發(fā)明者】趙忠灝 申請(qǐng)人:重慶乾德生物技術(shù)有限公司