抗鏈球菌溶血素o抗體的檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種抗鏈球菌溶血素O抗體的檢測試劑盒，包括試劑1和試劑2，所述試劑1為促進(jìn)抗體抗原特異性結(jié)合的反應(yīng)液；所述試劑2由緩沖液和蛋白膠乳顆粒復(fù)合物組成；所述蛋白膠乳顆粒復(fù)合物為組合蛋白標(biāo)記在聚苯乙烯膠乳顆粒上形成的復(fù)合物；所述組合蛋白由鏈球菌溶血素O和惰性蛋白通過化學(xué)交聯(lián)而成；本發(fā)明抗鏈球菌溶血素O抗體的檢測試劑盒具有靈敏度高、特異性好、準(zhǔn)確性高、穩(wěn)定性好及生產(chǎn)成本低的優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】抗鏈球菌溶血素O抗體的檢測試劑盒
[0001]

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及一種醫(yī)學(xué)檢測試劑盒，具體講是一種抗鏈球菌溶血素O抗體(ASO)的檢測試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0003]鏈球菌溶血素O (SLO)是鏈球菌產(chǎn)生的一種外毒素，它能夠溶解人體血液中的紅細(xì)胞，并且對(duì)多種細(xì)胞有毒性作用，當(dāng)鏈球菌感染人體后，人體免疫系統(tǒng)會(huì)產(chǎn)生抗鏈球菌溶血素O的抗體，并且釋放到血液中，使血液中抗鏈球菌溶血素O的抗體濃度升高。因此，臨床上通過對(duì)人體血液中抗鏈球菌溶血素O抗體的濃度檢測，輔助診斷由鏈球菌感染后引起的變態(tài)性疾病(如風(fēng)濕熱和腎小球腎炎)。
[0004]目前市場上，通過膠乳增強(qiáng)免疫比濁試劑來檢測人體血清中的抗鏈球菌溶血素O抗體。在銷售的膠乳增強(qiáng)免疫比濁試劑中，膠乳與抗原或抗體的交聯(lián)，通常有物理吸附法和化學(xué)交聯(lián)法。物理吸附法通常是靠蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團(tuán)與膠乳表面的疏水基團(tuán)間的相互作用，將抗原或抗體吸附到膠乳表面?；瘜W(xué)交聯(lián)法是通過抗原或抗體與膠乳表面的化學(xué)基團(tuán)反應(yīng)，將抗原或抗體交聯(lián)在膠乳上。此兩種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，物理吸附法有易于結(jié)合，不會(huì)影響抗原或抗體的活性，但特異性比較差，結(jié)合不夠牢固?；瘜W(xué)交聯(lián)法有特異好，易保存，分散性良好等優(yōu)點(diǎn)，但對(duì)抗體或抗原活性影響大。
[0005]化學(xué)交聯(lián)法現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于體外診斷試劑制備中，但是化學(xué)交聯(lián)法會(huì)由于化學(xué)反應(yīng)造成抗原或抗體在交聯(lián)過程中活性喪失，影響試劑的靈敏度和準(zhǔn)確度，而且經(jīng)多步交聯(lián)，試劑的穩(wěn)定性受到大的影響，而且制備的時(shí)間時(shí)間很長。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，克服以上現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn):提供一種檢測靈敏度，準(zhǔn)確度高；精密度好，檢測線性寬，穩(wěn)定性好；生產(chǎn)成本低的抗鏈球菌溶血素O抗體的檢測試劑盒。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)解決方案如下:一種抗鏈球菌溶血素O抗體的檢測試劑盒，包括試劑I和試劑2，所述試劑I為促進(jìn)抗體抗原特異性結(jié)合的反應(yīng)液；所述試劑2由緩沖液和蛋白膠乳顆粒復(fù)合物組成；所述蛋白膠乳顆粒復(fù)合物為組合蛋白標(biāo)記在聚苯乙烯膠乳顆粒上形成的復(fù)合物；所述組合蛋白由鏈球菌溶血素O和惰性蛋白通過化學(xué)交聯(lián)而成。
[0008]所述試劑I由以下組分組成:100-400 mM Tris-HCl ;5_10 mM聚乙二醇6000;1mg/mL Proclin-300 ；l-20mM 乙二胺四乙酸鈉(EDTA) ;1_10 mg/mL BSA 和 150mM 氯化鈉。
[0009]作為優(yōu)選，所述惰性蛋白為小牛血清白蛋白(BSA)或酪蛋白中的一種。
[0010]作為進(jìn)一步優(yōu)選，所述惰性蛋白為BSA。
[0011]作為優(yōu)選，所述試劑2中的鏈球菌溶血素O為天然抗原或重組抗原。
[0012]作用優(yōu)選，所述聚苯乙烯膠乳顆粒的粒徑為60-500 nm。
[0013]作為進(jìn)一步優(yōu)選，所述聚苯乙烯膠乳顆粒的粒徑為100-200 nm。
[0014]作為優(yōu)選，所述試劑2中蛋白膠乳顆粒復(fù)合物含量為1-10 mg/mL。
[0015]作為進(jìn)一步優(yōu)選，所述試劑2中蛋白膠乳顆粒復(fù)合物含量為1-5 mg/mL。
[0016]作為優(yōu)選，通過化學(xué)交聯(lián)制備所述組合蛋白的交聯(lián)劑為1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)、N-羥基丁二酰亞胺(NHS)或戊二醛中的一種。
[0017]蛋白膠乳顆粒復(fù)合物是先由組合蛋白上的氨基通過EDC和聚苯乙烯膠乳顆粒表面羧基反應(yīng)形成化學(xué)交聯(lián)，然后加入還原性物質(zhì)進(jìn)行反應(yīng)制得。
[0018]所述還原性物質(zhì)為亞硫酸鈉、硫辛酸、硼氫化鉀或硼氫化鈉中的一種。
[0019]所述試劑I中Tris-HCl緩沖液的pH值為5.5-8.5，進(jìn)一步優(yōu)選為6.5-7.5。
[0020]本發(fā)明試劑盒中試劑I與試劑2的容積比為4: I。
[0021]由于BSA穩(wěn)定性好，SLO通過化學(xué)交聯(lián)與BSA先結(jié)合，制得穩(wěn)定性好的組合蛋白，再通過第二次化學(xué)交聯(lián)把BSA標(biāo)記到膠乳顆粒表面上。由于BSA蛋白分子量比SLO大，穩(wěn)定性好。通過多個(gè)SLO蛋白分子和一個(gè)BSA通過化學(xué)交聯(lián)組合，導(dǎo)致交聯(lián)在BSA上的SLO的穩(wěn)定性大大提高，再通過組合蛋白和膠乳顆粒的化學(xué)交聯(lián)，形成SLO-BSA-膠乳顆粒復(fù)合物。
[0022]本發(fā)明以上所述SLO序列中含有多個(gè)半胱氨酸，半胱氨酸中的巰基易被氧化，導(dǎo)致SLO結(jié)構(gòu)變化，降低試劑2穩(wěn)定性。因此，在試劑2中加入還原劑可提高試劑2的穩(wěn)定性。
[0023]本發(fā)明上述試劑盒除包括試劑I和試劑2外，還包括抗鏈球菌溶血素O檢測試劑盒的校準(zhǔn)品。所述校準(zhǔn)品為添加抗鏈球菌溶血素O抗體的人血清或者類似血清基質(zhì)的液體，并且過濾除菌。類似血清基質(zhì)的液體即類似人血清基質(zhì)的溶液，如50mg/mL BSA, 150 mMNaCl和15 mM磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)。所述抗鏈球菌溶血素O檢測試劑盒的校準(zhǔn)品有5個(gè)濃度，分別為 25 IU/mL, 50 IU/mL, 100 IU/mL,200 IU/mL 和 400 IU/mL。
[0024]本發(fā)明中的抗鏈球菌溶血素0抗體檢測試劑盒采用膠乳增強(qiáng)免疫比濁法(PETIA)測定血清中抗鏈球菌溶血素O抗體含量，其原理是包被了抗原或抗體的膠乳微粒，與樣本中相應(yīng)的抗原或抗體發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成聚集顆粒，在一定波長下，通過測定聚集物形成所產(chǎn)生的濁度，即可測出標(biāo)本中被檢物的含量。進(jìn)一步的，所述本發(fā)明中，樣本中的抗鏈球菌溶血素O抗體與結(jié)合在膠乳顆粒表面的鏈球菌溶血素O抗原結(jié)合，產(chǎn)生抗原抗體反應(yīng)，使膠乳顆粒形成聚集，在570nm波長處測定反應(yīng)吸光度，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線可求出血清樣本中抗鏈球菌溶血素O抗體的含量。
[0025]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明抗鏈球菌溶血素O抗體的檢測試劑盒具有靈敏度高、特異性好、準(zhǔn)確性高、穩(wěn)定性好及生產(chǎn)成本低的優(yōu)點(diǎn)。
[0026]本發(fā)明試劑盒中的試劑2制備過程中先通過化學(xué)交聯(lián)把SLO固定在惰性蛋白BSA上，再通過化學(xué)交聯(lián)把BSA-SLO組合蛋白標(biāo)記在膠乳顆粒表面，這一技術(shù)提高了 SLO的穩(wěn)定性，從而提高了試劑2的穩(wěn)定性，試劑2制備過程中加入了適量的還原劑，使SLO在試劑中保持還原狀態(tài)，保護(hù)了 SLO的結(jié)構(gòu)和抗原性，進(jìn)一步提高了試劑的穩(wěn)定性。
[0027]本發(fā)明可以縮短試劑盒制備的時(shí)間，提高靈敏度的同時(shí)，還能提高試劑盒的開口穩(wěn)定性。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]圖1為本發(fā)明抗鏈球菌溶血素O抗體的檢測試劑盒實(shí)施例中校準(zhǔn)曲線圖。
[0029]圖2為本發(fā)明抗鏈球菌溶血素O抗體的檢測試劑盒實(shí)施例中相關(guān)性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)圖。
[0030]圖3為本發(fā)明抗鏈球菌溶血素O抗體的檢測試劑盒實(shí)施例中開口穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)圖。
[0031]圖4為本發(fā)明抗鏈球菌溶血素O抗體的檢測試劑盒實(shí)施例中熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)圖。

【具體實(shí)施方式】
[0032]下面用具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明不僅局限于以下具體實(shí)施例。
[0033]實(shí)施例1
1、試劑2的配制:
用15mM PB，pH=7.4緩沖液，將SLO溶液稀釋至2 mg/mL，加入到燒杯中，再等體積加入濃度為2 mg/mL的BSA溶液，再加入100 mg/mL戊二醛水溶液，在閉口的燒杯中開始反應(yīng)，戊二醒的終濃度為0.05 mg/mL,反應(yīng)溫度為15°C,時(shí)間為3小時(shí),反應(yīng)結(jié)束后，敞開蓋子，4°C放置I小時(shí)，制得組合蛋白溶液，通過超濾，濾掉反應(yīng)中多余的戊二醛?？梢灾苯佑糜谙乱徊椒磻?yīng)或4°C儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br> [0034]用10 mM MES, pH 6.0緩沖液稀釋粒徑為100-200 nm聚苯乙烯膠乳顆粒至4 mg/mL，再加入2 mg/mL的EDC溶液，使EDC在體系中的達(dá)200 μ g/mL, 25°C反應(yīng)lh，反應(yīng)結(jié)束后離心，去上清后，再入15 mM PB緩沖液，然后加入0.5 mL上述制備組合蛋白溶液，25°C反應(yīng)3 h,反應(yīng)結(jié)束后,再加入IM硼氫化鈉溶液,使硼氫化鈉終濃度為10 mM,25°C反應(yīng)0.5h，離心去上清，再加入20 mM Hepes, pH7.4溶液，再次離心去上清，使聚苯乙烯膠乳顆粒分散于含3 mg/mL BSA的H印es (20 mM, pH 7.4)溶液中，4°C保存。
[0035]2、試劑I的配制:
試劑I為200 mM Tris-HCl，向該緩沖液中分別加入NaCl，EDTA, BSA，PEG6000和Proclin-300。各組分的終濃度分別為 150 mM NaCl, 15 mM EDTA, 3 mg/mL BSA,8 mMPEG6000和I mg/mL PC-300。向緩沖液里添加完各組分后，用HCl調(diào)節(jié)pH值到7.5。
[0036]3、抗鏈球菌溶血素O試劑盒校準(zhǔn)品制備:
含高濃度抗鏈球菌溶血素O抗體(ASO)血清，用相應(yīng)的類似人血清基質(zhì)的溶液(I mg/mL BSA, 9 mg/mL NaCl, 15 mM磷酸鹽緩沖液pH 7.5)進(jìn)行稀釋和過濾除菌，所述的ASO校準(zhǔn)品中抗體含量分別控制在25 IU/mL, 50 IU/mL, 100 IU/mL, 200 IU/mL和400 IU/mL，這些校準(zhǔn)品均為微黃色液體。以進(jìn)口的電化生研公司的ASO試劑盒對(duì)照，分別對(duì)制備的校準(zhǔn)品進(jìn)行測定和調(diào)整，調(diào)整合適后分別檢測20次，求出平均值達(dá)到校準(zhǔn)品所要求的五個(gè)梯度的濃度，分別為 25 IU/mL, 50 IU/mL, 100 IU/mL, 200 IU/mL 和 400 IU/mL。
[0037]4、抗鏈球菌溶血素O抗體的檢測方法:
ASO試劑測定方法是兩點(diǎn)終點(diǎn)法，檢測波長分別為主波長570 nm，副波長700 nm。試劑I和試劑2的用量分別為240 μ I和60 μ I。樣本用量為3 μ I ;反應(yīng)方向向上，測定溫度為37°C。樣本與試劑I混勻后，置37°C孵育5分鐘，之后加入試劑2，即開始讀點(diǎn)，反應(yīng)5min后讀取另一點(diǎn)。使用日立7060自動(dòng)生化分析儀測得5種不同含量的ASO校準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖1所示)，其中X軸為ASO校準(zhǔn)品濃度IU/mL，Y軸為反應(yīng)吸光度。
[0038]實(shí)施例2:
1、相關(guān)性實(shí)驗(yàn)
從市場上購買ASO檢測試劑盒和本發(fā)明試劑盒在日立7060全自動(dòng)生化分析儀上按照各自設(shè)定的上機(jī)參數(shù)，對(duì)50份新鮮人血清(血清取自醫(yī)院)進(jìn)行檢測，對(duì)測定值進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如圖2所示，回歸方程為:y=0.9576x+4.0652，相關(guān)系數(shù)R2=0.996，結(jié)果表明本試劑與目前市場銷售的試劑相關(guān)性好。
[0039]2、開口穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)
從市場上購買ASO質(zhì)控品(干粉)，依說明書的要求，復(fù)溶分管后儲(chǔ)存于-20°C條件下，長期保存。對(duì)本發(fā)明試劑上機(jī)開口保存。進(jìn)行30天開口穩(wěn)定性檢測實(shí)驗(yàn)。在第I天進(jìn)行定標(biāo)之后，不再進(jìn)行重復(fù)定標(biāo)。分別在第1、3、5、7、14、21、30天對(duì)質(zhì)控品進(jìn)行檢測。檢測結(jié)果如圖3所示，本發(fā)明試劑測定隨著天數(shù)的增加，測值偏差維持在5%之內(nèi)。結(jié)果表明本試劑的開口至少能夠穩(wěn)定I個(gè)月，穩(wěn)定性好。
[0040]3、熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)
從市場上購買ASO質(zhì)控品(干粉)，依說明書的要求，復(fù)溶分管后儲(chǔ)存于-20°C條件下，長期保存。第一天定標(biāo)后，將本發(fā)明試劑閉口放置在37°C烘箱中保存。進(jìn)行10天加速破壞性實(shí)驗(yàn)。分別在第1、3、5、7、9、10天測定質(zhì)控品。檢測結(jié)果如圖4所示，本發(fā)明試劑在前9天測定值偏差在5%之內(nèi)，第10天測值超過5%。結(jié)果表明本發(fā)明試劑至少在37°C環(huán)境中能保存9天。按照試劑保存在4°C條件下估算，試劑至少能夠穩(wěn)定15個(gè)月。穩(wěn)定性好。
[0041]以上僅是本發(fā)明的特征實(shí)施范例，對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍不構(gòu)成任何限制。凡采用同等交換或者等效替換而形成的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明權(quán)利保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種抗鏈球菌溶血素O抗體的檢測試劑盒，其特征在于:包括試劑I和試劑2，所述試劑I為促進(jìn)抗體抗原特異性結(jié)合的反應(yīng)液；所述試劑2由緩沖液和蛋白膠乳顆粒復(fù)合物組成；所述蛋白膠乳顆粒復(fù)合物為組合蛋白標(biāo)記在聚苯乙烯膠乳顆粒上形成的復(fù)合物；所述組合蛋白由鏈球菌溶血素O和惰性蛋白通過化學(xué)交聯(lián)而成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗鏈球菌溶血素O抗體的檢測試劑盒，其特征在于:試劑I由以下組分組成:100-400 mM Tris-HCl ；5-10 mM 聚乙二醇 6000;1 mg/mL Proclin-300 ；1-20 mM乙二胺四乙酸鈉；1_10 mg/mL BSA和150 mM氯化鈉。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗鏈球菌溶血素O抗體的檢測試劑盒，其特征在于:所述惰性蛋白為牛血清白蛋白或酪蛋白中的一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的所述的抗鏈球菌溶血素O抗體的檢測試劑盒，其特征在于:所述試劑2中的鏈球菌溶血素O為天然抗原或重組抗原。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗鏈球菌溶血素O抗體的檢測試劑盒，其特征在于:通過化學(xué)交聯(lián)制備所述組合蛋白的交聯(lián)劑為1- (3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)、N-羥基丁二酰亞胺(NHS)或戊二醛中的一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗鏈球菌溶血素O抗體的檢測試劑盒，其特征在于:蛋白膠乳顆粒復(fù)合物是先由組合蛋白上的氨基通過EDC和聚苯乙烯膠乳顆粒表面羧基反應(yīng)形成化學(xué)交聯(lián)，然后加入還原性物質(zhì)進(jìn)行反應(yīng)制得。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的抗鏈球菌溶血素O抗體的檢測試劑盒，其特征在于:所述還原性物質(zhì)為亞硫酸鈉、硫辛酸、硼氫化鉀或硼氫化鈉中的一種。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗鏈球菌溶血素O抗體的檢測試劑盒，其特征在于:所述試劑2中蛋白膠乳顆粒復(fù)合物含量為1-10 mg/mL。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK104483492SQ201410804871
【公開日】2015年4月1日 申請(qǐng)日期:2014年12月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月22日
【發(fā)明者】鄒炳德, 鄒繼華, 方亮 申請(qǐng)人:寧波美康生物科技股份有限公司