一種四環(huán)素的免疫學(xué)檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本實用新型公開了一種四環(huán)素的免疫學(xué)檢測試劑盒。試劑盒包括盒體、盒蓋、設(shè)置于盒體內(nèi)的底部固定座和頂部固定座，所述的底部固定座上有各種試劑瓶下凹瓶位，用于放置四環(huán)素抗體工作液、酶標二抗工作液、顯色液、終止液、濃縮洗滌液、四環(huán)素標準液、基質(zhì)稀釋液和Tween-20備用液，所述的頂部固定座上有各種卡槽或凹槽，用于放置酶標板、微孔條、吸管、比色卡和pH試紙。該實用新型采用間接競爭ELISA方法進行四環(huán)素含量的定性、定量檢測，具有操作簡單、靈敏度高、成本低廉等優(yōu)點，適合大批量樣品的現(xiàn)場快速檢測。
【專利說明】 一種四環(huán)素的免疫學(xué)檢測試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本實用新型涉及一種醫(yī)藥生物領(lǐng)域的檢測試劑盒，具體涉及一種用于測定樣品溶液中四環(huán)素殘留含量的免疫學(xué)檢測試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002]四環(huán)素類藥物(Tetracycline, TCs)是由鏈霉菌產(chǎn)生的一類堿性廣譜抗生素，在化學(xué)結(jié)構(gòu)上屬于多環(huán)并四苯羧基酰胺母核的衍生物，包括金霉素、土霉素、四環(huán)素和去甲金霉素，以及半合成的多西環(huán)素和米諾環(huán)素等。該類藥物能特異性地與細菌核糖體30S亞基的A位置結(jié)合，阻止氨基酰-tRNA在該位置上的聯(lián)結(jié)，從而抑制肽鏈的增長、影響細菌蛋白質(zhì)的合成。四環(huán)素類藥物主要用于立克氏次體、衣原體、支原體及回歸熱螺旋體等非細菌性感染，以及治療敏感菌引起的呼吸道、膽道、尿路及皮膚軟組織等部位的多種感染性疾病。在畜禽生產(chǎn)中，四環(huán)素類藥物被廣泛作為治療藥物和藥物添加劑使用，用于防治消化道感染、促進生長和提高奶牛產(chǎn)奶量。
[0003]隨著四環(huán)素類抗生素被大量、廣泛的應(yīng)用于禽畜養(yǎng)殖業(yè)，其造成的食品殘留給人類身心健康帶來極大的安全隱患。人長期攝入四環(huán)素類抗生素會引起各種慢性和蓄積性疾病，主要表現(xiàn)為對胃、腸、肝臟的損害，以及牙齒的染色，還會造成過敏反應(yīng)、二重感染、致畸胎等，同時還會導(dǎo)致人體腸道中菌群平衡的失調(diào)以及耐藥菌株的產(chǎn)生。因此，世界各國對TCs殘留檢測十分關(guān)注。日本要求進口畜禽肉中四環(huán)素族殘留量不得超過0.05mg/kg，澳大利亞規(guī)定四環(huán)素類總量不得大于0.3mg/kg,歐盟一律標準為0.01mg/kg，美國藥品監(jiān)督管理局規(guī)定TCs在動物肌肉組織中殘留總量不超過0.02mg/kg,牛奶中為0.3mg/kg。我國農(nóng)業(yè)部于2002年修訂了《動物性食品中獸藥最高殘留限量》，其中規(guī)定牛/羊奶以及所有動物肌肉中四環(huán)素類抗生素的最高殘留量為0.lmg/kg，對動物肝臟、腎臟、蛋中四環(huán)素殘留也有相應(yīng)限量規(guī)定。
[0004]食品中四環(huán)素類抗生素殘留檢測方法有高效液相色譜法、毛細管電泳法、電化學(xué)分析、化學(xué)發(fā)光及液相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用法等，這些方法對待測樣品的前處理要求高，且操作煩瑣，需要精密的儀器設(shè)備。而免疫學(xué)方法具有快速、靈敏、特異性強等特點，是獸藥殘留檢測的有效方法之一。因此，研制快速、靈敏、高效的四環(huán)素殘留檢測間接競爭ELISA試劑盒對于保障動物性食品安全具有十分重要的意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本實用新型的目的是提供了一種小巧輕便的四環(huán)素的免疫學(xué)檢測試劑盒，使用該試劑盒操作簡便，靈敏度高，成本低，穩(wěn)定性好，可進行一次連續(xù)多個樣品中四環(huán)素含量的測定，減少了樣品檢測所需要的時間。
[0006]本實用新型的技術(shù)方案是:
[0007]一種四環(huán)素的免疫學(xué)檢測試劑盒，包括盒體和連接于盒體上的盒蓋，開口一側(cè)的盒蓋與盒體上分別設(shè)有相對應(yīng)的盒蓋卡頭和盒體卡槽，其特征在于:所述的盒體內(nèi)部由上到下依次設(shè)有頂部固定座和底部固定座，其中底部固定座由底部間隔分為A、B兩部分，A部分設(shè)有7個試劑瓶下凹瓶位，B部分設(shè)有5個試劑瓶下凹瓶位，A部分的7個試劑瓶下凹瓶位內(nèi)分別放置有四環(huán)素抗體工作液、酶標二抗工作液、顯色劑A液、顯色劑B液、終止液、濃縮洗滌液和四環(huán)素標準液，B部分的5個試劑瓶下凹瓶位內(nèi)分別放置有肌肉稀釋液、肝臟稀釋液、牛奶稀釋液、飼料稀釋液和Tween-20備用液，所述的頂部固定座由手柄分為A、B兩部分，A部分設(shè)有2個卡槽，B部分設(shè)有6個凹槽，A部分的2個卡槽內(nèi)分別放置有96孔酶標板和酶標反應(yīng)微孔條，B部分的6個凹槽內(nèi)分別放置有1.0mL吸管、100 μ L微吸管、60 μ L微吸管、50 μ L微吸管、比色卡和pH試紙，在頂部固定座B部分的上方放置有基質(zhì)標準曲線和說明書。
[0008]所述的酶標板由聚苯乙烯制成，采用96孔試劑板作為固相載體，放于鋁鉬袋內(nèi)，并置于酶標板卡槽中，且酶標板由外框支撐架和放置其上的可拆裝酶標反應(yīng)微孔條組成，每個可拆裝酶標反應(yīng)微孔條有12個反應(yīng)孔，其上預(yù)包被四環(huán)素偶聯(lián)抗原。
[0009]本實用新型的有益效果是:試劑盒所需儀器較少，操作簡單易行，且能快速、準確、批量地用于樣品溶液中四環(huán)素含量的定量、定性檢測。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1是本實用新型的結(jié)構(gòu)示意圖，圖2是本實用新型中底部固定座的結(jié)構(gòu)示意圖，圖3是本實用新型中頂部固定座的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0011]圖面說明:1、盒體,2、盒蓋，3、底部固定座，4、頂部固定座；5、盒體卡槽，6、盒蓋卡頭，7、底座間隔，8、四環(huán)素抗體工作液瓶位，9、酶標二抗工作液瓶位，10、顯色劑A液瓶位，
11、顯色劑B液瓶位，12、終止液瓶位，13、濃縮洗滌液瓶位，14、四環(huán)素標準液瓶位，15、肌肉稀釋液瓶位，16、肝臟稀釋液瓶位，17、牛奶稀釋液瓶位，18、飼料稀釋液瓶位，19、Tween-20備用液瓶位，20、手柄，21、酶標板卡槽，22、酶標反應(yīng)微孔條卡槽，23、1.0ml吸管凹槽，24、ΙΟΟμΙ微吸管凹槽，25、60μ1微吸管凹槽，26、50μ1微吸管凹槽，27、比色卡凹槽，28、pH試紙凹槽。

【具體實施方式】
[0012]結(jié)合附圖詳細描述實施例。一種四環(huán)素的免疫學(xué)檢測試劑盒，包括盒體1、盒蓋2、設(shè)置盒體I內(nèi)的底部固定座3和頂部固定座4，所述的盒體I上有盒體卡槽5，與盒蓋2上的盒蓋卡頭6相對應(yīng)，用于開關(guān)試劑盒。
[0013]所述的底部固定座3由底部間隔7分為A、B兩部分，A部分設(shè)有7個試劑瓶下凹瓶位，B部分設(shè)有5個試劑瓶下凹瓶位。A部分四環(huán)素抗體工作液瓶位8放置有白色塑料試劑瓶封裝的6ml四環(huán)素抗體工作液，酶標二抗工作液瓶位9放置有紅色塑料試劑瓶封裝的6ml兔抗鼠酶標二抗(RaMIgG-HRP)，顯色劑A液瓶位10放置有黑色塑料試劑瓶封裝的4ml底物顯色劑A液，顯色劑B液瓶位11放置有綠色塑料試劑瓶封裝的4ml底物顯色劑B液，終止液瓶位12放置有黃色塑料試劑瓶封裝的7ml 2M硫酸溶液，濃縮洗滌液瓶位13放置有半透明塑料試劑瓶封裝的40ml濃縮洗滌液(10X )，四環(huán)素標準液瓶位14放置有白色透明塑料試劑瓶封裝的2ml四環(huán)素標準品溶液(lmg/ml)。B部分肌肉稀釋液瓶位15放置有紅色帽的半透明塑料試劑瓶封裝的50ml肌肉樣品稀釋液，肝臟稀釋液瓶位16放置有黃色帽的半透明塑料試劑瓶封裝的50ml肝臟樣品稀釋液，牛奶稀釋液瓶位17放置有白色帽的半透明塑料試劑瓶封裝的20ml牛奶樣品稀釋液，飼料稀釋液瓶位18放置有灰色帽的半透明塑料試劑瓶封裝的20ml飼料樣品稀釋液，Tween-20備用液瓶位19放置有黑色帽的黑色塑料試劑瓶封裝的3ml Tween-20表面活性劑。
[0014]所述的頂部固定座4由手柄20分為A、B兩部分，A部分設(shè)有2個卡槽，B部分設(shè)有6個凹槽。A部分的酶標板卡槽21放置一塊由聚苯乙烯制成的酶標板，采用96孔試劑板作為固相載體，放于鋁鉬袋內(nèi)，且酶標板由外框支撐架和放置其上的可拆裝酶標反應(yīng)微孔條組成，每個可拆裝酶標反應(yīng)微孔條有12個反應(yīng)孔，其上預(yù)包被四環(huán)素偶聯(lián)抗原，酶標反應(yīng)微孔條卡槽22放置有24-36條散裝酶標反應(yīng)微孔條，使用時安裝在酶標板外框支撐架上，使試劑盒檢測容量擴大2-3倍。B部分的1.0ml吸管凹槽23放置有50根1.0ml容量的吸管，用于樣品基質(zhì)的采樣，ΙΟΟμΙ微吸管凹槽24放置有50根ΙΟΟμΙ容量的微吸管，用于添加終止液，60μ1微吸管凹槽25放置有50根60μ1容量的微吸管，用于添加顯色劑溶液，50μ1微吸管凹槽26放置有50根50μ1容量的微吸管，用于添加四環(huán)素抗體工作液和酶標二抗工作液，比色卡凹槽27放置有不同基質(zhì)條件下的比色卡，顯示不同顏色試劑孔對應(yīng)的吸光度值和四環(huán)素殘留含量，用于樣品含量的大概推算，PH試紙凹槽28放置不同種類的pH試紙，用來測定不同溶液的PH值。B部分凹槽的表面還放置有基質(zhì)標準曲線和說明書，將酶標儀測定的吸光度值代入標準曲線，可準確測定樣品溶液中四環(huán)素殘留含量。
[0015]動物可食組織中四環(huán)素含量測定:
[0016]I)樣本前處理:稱取切碎、勻質(zhì)后的動物組織樣品1.0±0.05g至5ml離心管中，加入2ml pH4.0的Mcllvaine-EDTA樣品提取液,鏇潤混合3?5min,室溫下4000r/min離心5min ;移取Iml上清液于5ml離心管中,加入50 μ I 4mol/L NaOH,振蕩混勻；再加入Iml正己烷，漩渦混合30s ;靜置5min分層后，吸取至少100 μ I下層溶液與等體積PBS緩沖液混合后待檢。
[0017]2)試劑盒的操作步驟:①將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡20min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻取出所需數(shù)量的微孔條，將不用的微孔條放進原錫箔袋中并且與提供的干燥劑一起重新密封，保存于2-8°C 編號:將樣品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣品做2孔平行，并記錄樣品孔所在的位置加樣品:加樣品50 μ I到對應(yīng)的微孔中，隨即加入酶標二抗工作液50 μ I /孔，再加入四環(huán)素抗體工作液50 μ I /孔，輕輕振蕩混勻，置37°C避光環(huán)境中反應(yīng)30min 洗板:將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌工作液300 μ I/孔，充分洗滌5次，每次間隔10s，用吸水紙拍干；?顯色:加入底物顯色劑溶液60 μ I/孔(A液和B液各30 μ I )，輕輕振蕩混勻，置37°C避光環(huán)境反應(yīng)15_20min ；?測定:加入終止液100μ I/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標儀于450nm處，測定每孔吸光度值。
[0018]3)測定樣品溶液中四環(huán)素含量:
[0019]①定性測定:底物顯色15_20min后，將樣品孔藍色深淺與比色卡對比，獲得不同樣品基質(zhì)中四環(huán)素殘留大概含量。
[0020]②定量測定:加入終止液100 μ I/孔后，將酶標儀測定的吸光度值代入標準曲線，可準確測定樣品溶液中四環(huán)素殘留含量。
【權(quán)利要求】
1.一種四環(huán)素的免疫學(xué)檢測試劑盒，包括盒體和連接于盒體上的盒蓋，開口一側(cè)的盒蓋與盒體上分別設(shè)有相對應(yīng)的盒蓋卡頭和盒體卡槽，其特征在于:所述的盒體內(nèi)部由上到下依次設(shè)有頂部固定座和底部固定座，其中底部固定座由底部間隔分為A、B兩部分，A部分設(shè)有7個試劑瓶下凹瓶位，B部分設(shè)有5個試劑瓶下凹瓶位，A部分的7個試劑瓶下凹瓶位內(nèi)分別放置有四環(huán)素抗體工作液、酶標二抗工作液、顯色劑A液、顯色劑B液、終止液、濃縮洗滌液和四環(huán)素標準液，B部分的5個試劑瓶下凹瓶位內(nèi)分別放置有肌肉稀釋液、肝臟稀釋液、牛奶稀釋液、飼料稀釋液和Tween-20備用液，所述的頂部固定座由手柄分為A、B兩部分，A部分設(shè)有2個卡槽，B部分設(shè)有6個凹槽，A部分的2個卡槽內(nèi)分別放置有96孔酶標板和酶標反應(yīng)微孔條，B部分的6個凹槽內(nèi)分別放置有1.0mL吸管、100 μ L微吸管、60 μ L微吸管、50 μ L微吸管、比色卡和pH試紙，在頂部固定座B部分的上方放置有基質(zhì)標準曲線和說明書。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的四環(huán)素的免疫學(xué)檢測試劑盒，其特征在于:所述的酶標板由聚苯乙烯制成，采用96孔試劑板作為固相載體，放于鋁鉬袋內(nèi)，并置于酶標板卡槽中，且酶標板由外框支撐架和放置其上的可拆裝酶標反應(yīng)微孔條組成，每個可拆裝酶標反應(yīng)微孔條有12個反應(yīng)孔，其上預(yù)包被四環(huán)素偶聯(lián)抗原。
【文檔編號】G01N33/535GK203981685SQ201420336227
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年6月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月23日
【發(fā)明者】姜金慶, 李桂平, 馬金友, 王毅紅, 劉耀東, 郭芳, 吳寧鵬, 楊英軍 申請人:河南知微生物工程有限公司, 河南科技學(xué)院