一種檢測(cè)涕滅威的新型適體試紙的制作方法
【專利摘要】本實(shí)用新型公開(kāi)了一種檢測(cè)涕滅威的新型適體試紙，所述的試紙是由底板（1）、吸水墊（2）、NC膜（3）、適體-熒光-微球墊（4）、樣品吸液層（5）組成；底板（1）是長(zhǎng)方形的平板，樣品吸液層（5）、適體-熒光-微球墊（4）、NC膜（3）、吸水墊（2）依次順序粘貼在底板（1）上；所述吸水墊（2）與所述NC膜（3）之間的反應(yīng)區(qū)設(shè)有具有互補(bǔ)序列的檢測(cè)線（6）、由生物素形成的質(zhì)控線（7）。該檢測(cè)涕滅威殘留的適體熒光微球試紙靈敏度高、操作簡(jiǎn)便快速、顯示結(jié)果形象直觀準(zhǔn)確、成本低、易于大范圍推廣應(yīng)用。
【專利說(shuō)明】一種檢測(cè)涕滅威的新型適體試紙

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本實(shí)用新型涉及檢測(cè)試紙【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種檢測(cè)涕滅威的新型適體試紙。

【背景技術(shù)】
[0002]涕滅威，化學(xué)名稱2-甲基-2-(甲硫基)丙醛-O-甲基氨基甲?；?，屬氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥，是一種高效、劇毒、廣譜、內(nèi)吸性的殺蟲(chóng)、殺螨、殺線蟲(chóng)劑，已被廣泛用于棉花、花生、玉米、大豆、甜菜、甘蔗、小麥、果樹(shù)、馬鈴薯、煙草等許多作物上以防治螨類(lèi)、蚜蟲(chóng)及線蟲(chóng)等多種害蟲(chóng)，目前全世界已有70多個(gè)國(guó)家和地區(qū)在不同作物上登記使用。
[0003]涕滅威用量大，對(duì)人和動(dòng)物具有很高的毒性，并且不易降解(降解產(chǎn)物涕滅威亞砜和涕滅威砜依然保持著高的生物毒性和更長(zhǎng)的半衰期)，容易造成環(huán)境污染，且我國(guó)的農(nóng)藥的使用情況十分復(fù)雜，長(zhǎng)期不合理、超劑量使用化學(xué)農(nóng)藥，使得害蟲(chóng)抗藥性逐年增強(qiáng)，抗藥性的增強(qiáng)又迫使農(nóng)業(yè)生產(chǎn)者不斷加大農(nóng)藥的用量和使用次數(shù)，農(nóng)藥的濃度越用越大，高殘留農(nóng)藥和劇毒農(nóng)藥的使用也越來(lái)越廣，甚至有人將涕滅威施用于蔬菜產(chǎn)品上，使農(nóng)產(chǎn)品的殘留嚴(yán)重超標(biāo)，大大降低了農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量。農(nóng)藥的不合理使用給人類(lèi)及生態(tài)環(huán)境造成了越來(lái)越嚴(yán)重的不良后果，農(nóng)藥的污染問(wèn)題已成為全球關(guān)注的熱點(diǎn)。
[0004]目前涕滅威殘留檢測(cè)常采用氣相色譜(GC)和高效液相色譜(HPLC)法，由于氨基甲酸酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑在高溫下易分解，化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，而液相柱后衍生不好掌握，這兩種分析方法都存在一定的局限性，而且這些方法需要較昂貴的儀器并且樣品前處理過(guò)程復(fù)雜，因而難以滿足實(shí)際檢測(cè)的需要。免疫分析方法具有快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，可進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定，近年已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥殘留檢測(cè)。SDIX公司生產(chǎn)的涕滅威的96孔板式ELISA試劑盒對(duì)涕滅威的檢出限為I μ g/L，膠體金標(biāo)記免疫分析試紙的檢出限為10 μ g/L。但是涕滅威的分子量為190，為小分子化合物，本身不具有免疫原性。因此，制備抗體需要通過(guò)與大分子蛋白質(zhì)交聯(lián)才能成為免疫原，過(guò)程繁瑣，且抗體的質(zhì)量受抗原影響很大。
[0005]核酸適體是一種比抗體具有更高特異性的配基，其體外篩選、體外制備的特點(diǎn)能夠有效克服抗體制備周期長(zhǎng)、生產(chǎn)成本高、技術(shù)難度大、批間差異大、克隆株不易有效保存的缺點(diǎn)，并且核酸適體開(kāi)發(fā)周期短、生產(chǎn)成本低、使用方便在檢測(cè)分析領(lǐng)域中的應(yīng)用已經(jīng)被廣泛認(rèn)可，因此，核酸適體在涕滅威的快速檢測(cè)中具有良好的應(yīng)用前景。
實(shí)用新型內(nèi)容
[0006]為了使得涕滅威殘留能夠快速的定量檢測(cè)分析，本實(shí)用新型提供了一種靈敏度高、操作簡(jiǎn)便快速的檢測(cè)涕滅威殘留的適體試紙。
[0007]本實(shí)用新型采用如下技術(shù)方案:
[0008]本實(shí)用新型的檢測(cè)涕滅威的新型適體試紙是由底板、吸水墊、NC膜、適體-熒光-微球墊、樣品吸液層組成；底板是長(zhǎng)方形的平板，樣品吸液層、適體-突光-微球墊、NC膜、吸水墊依次順序粘貼在底板上。
[0009]NC膜和吸水墊之間依次設(shè)有檢測(cè)線和質(zhì)控線。
[0010]所述的底板的材料是塑料，優(yōu)選是PVC。
[0011]所述的吸水墊的材料是濾紙。
[0012]所述的適體-熒光-微球墊是涕滅威適體組裝的納米熒光微球墊，上面是標(biāo)記鏈親和素標(biāo)記的涕滅威適體與納米熒光微球顆粒聚集體。
[0013]所述的樣品吸液層的材料是玻璃纖維素膜。
[0014]所述的檢測(cè)線是涕滅威適體互補(bǔ)序列的檢測(cè)線。
[0015]所述的質(zhì)控線是生物素質(zhì)控線。
[0016]本實(shí)用新型的積極效果如下:
[0017]1、靈敏度高。涕滅威快速檢測(cè)試紙以凝膠結(jié)合高親和力的適體為基礎(chǔ)制備而成，以適體為關(guān)鍵材料建立起的涕滅威快速篩查技術(shù)最低能夠檢測(cè)出濃度約為0.1 μ g/mL的涕滅威。
[0018]2、操作簡(jiǎn)便快速。使用快速檢測(cè)試紙只需將試紙插入樣品液中，5分鐘左右顯示結(jié)果O
[0019]3、顯示結(jié)果更加準(zhǔn)確，以熒光條帶為檢測(cè)結(jié)果。進(jìn)一步研究可發(fā)現(xiàn)配用專門(mén)的熒光檢測(cè)儀樣品中涕滅威的含量與檢測(cè)線的熒光值呈反相關(guān)，樣品中涕滅威含量越高，檢測(cè)線的熒光值越低。
[0020]4、成本低。適體的篩選過(guò)程避免了動(dòng)物免疫，篩選過(guò)程簡(jiǎn)便，后期制備只需要化學(xué)合成，不需要培養(yǎng)細(xì)胞等步驟，制作周期和成本都遠(yuǎn)低于抗體。
[0021]5、易于大范圍推廣應(yīng)用?？焖贆z測(cè)試紙操作簡(jiǎn)單，能較好的滿足不同層次人員的需要，該實(shí)用新型具有廣闊的市場(chǎng)前景和較大的社會(huì)、經(jīng)濟(jì)效益。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0022]圖1示出了本實(shí)用新型的檢測(cè)涕滅威的適體熒光試紙的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0023]圖2示出了檢測(cè)涕滅威殘留的適體試紙的檢測(cè)結(jié)果示意圖。
[0024]附圖標(biāo)記如下:
[0025]I底板、2吸水墊、3 NC膜、4適體-熒光微球墊、5樣品吸液層、6檢測(cè)線、7質(zhì)控線。

【具體實(shí)施方式】
[0026]下面的實(shí)施例是對(duì)本實(shí)用新型的進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0027]圖1示出了本實(shí)用新型的檢測(cè)涕滅威的適體熒光微球試紙的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0028]該檢測(cè)涕滅威的適體熒光試紙，其包括依次順序粘貼在底板I上的吸水墊2、NC膜
3、適體-熒光微球墊4、樣品吸液層5，NC膜3上的反應(yīng)區(qū)設(shè)有具有互補(bǔ)序列的檢測(cè)線6、由生物素形成的質(zhì)控線7。
[0029]具體地，適體-熒光微球墊4上含有鏈接有涕滅威適體的納米熒光微球，在NC膜3上有互補(bǔ)序列構(gòu)成的隱形檢測(cè)線6。
[0030]其中，把試紙的樣品吸液層端插入果汁、蔬菜浸出液中，由于毛細(xì)作用進(jìn)行側(cè)向?qū)游?5-10min觀察結(jié)果。
[0031]其中，將涕滅威適體固定在適體-熒光微球墊上，用其互補(bǔ)序列作為檢測(cè)線，用生物素基團(tuán)作為質(zhì)控線，當(dāng)樣品中存在涕滅威時(shí)，適體不能與互補(bǔ)序列結(jié)合，則在檢測(cè)線處不顯示熒光條帶，而不存在涕滅威時(shí)兩條線都顯示熒光條帶，達(dá)到檢測(cè)的目的。
[0032]要制成檢測(cè)涕滅威殘留的適體熒光微球試紙首先需要篩選涕滅威適體，制備檢測(cè)線上的互補(bǔ)序列，制備熒光微球用于結(jié)合適體；整個(gè)制備過(guò)程中都不需要對(duì)涕滅威農(nóng)藥進(jìn)行改造和修飾，相比于免疫膠體金層析技術(shù)極大地簡(jiǎn)化了制備過(guò)程。以下是相關(guān)材料的制備方法:
[0033]1、運(yùn)用SELEX技術(shù)篩選抗涕滅威適體
[0034]本實(shí)用新型中用熒光素(FAM)將隨機(jī)寡聚核苷酸庫(kù)進(jìn)行標(biāo)記，每輪篩選的PCR擴(kuò)增用FAM標(biāo)記的上游引物進(jìn)行，通過(guò)比較篩選時(shí)投入樣品和洗脫樣品的熒光強(qiáng)度來(lái)判斷篩選效率。
[0035]SELEX具體過(guò)程如下:
[0036](I)雜交:將隨機(jī)庫(kù)以及封閉序列溶入200 μ L緩沖液PBS中，先90°C變性3 min再于4°C條件下孵育過(guò)夜；
[0037](2)固定:取200 μ L鏈親和素修飾的瓊脂糖凝膠用PBS洗滌5次，再將過(guò)夜孵育的溶液加入，于室溫條件下在旋轉(zhuǎn)混合器上作用；
[0038](3 )洗滌:用PBS快速洗滌上述凝膠5次；
[0039](4)負(fù)篩選:在上述洗滌過(guò)的凝膠中加入PBS，于室溫條件下在旋轉(zhuǎn)混合器上作用后離心；
[0040](5)洗脫:加入涕滅威溶液，于室溫條件下在旋轉(zhuǎn)混合器上競(jìng)爭(zhēng)洗脫，每輪減少作用時(shí)間，增加篩選壓力，離心后收集下清濾液；
[0041](6) PCR 擴(kuò)增；
[0042](7)雙鏈DNA拆分:拆分產(chǎn)物用微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)定量測(cè)定后用于進(jìn)入下一輪篩選。
[0043](8)重復(fù)篩選過(guò)程。
[0044]當(dāng)篩選效率不再上升時(shí)停止篩選，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)乙醇沉淀后備用。
[0045]2、測(cè)序
[0046](I)TA克隆:選用TA克隆試劑盒(pUC-T Simple Cloning Kit)進(jìn)行，TA克隆后隨機(jī)挑取白色菌落進(jìn)行PCR鑒定和測(cè)序鑒定。
[0047](2) PCR 鑒定。
[0048](3)測(cè)序鑒定:對(duì)PCR鑒定為陽(yáng)性的克隆作進(jìn)一步測(cè)序鑒定。
[0049](4)將測(cè)序成功的序列進(jìn)行合成，修飾鏈親和素基團(tuán)，以供下一步試紙條組裝使用。
[0050]3、適體-突光微球墊的制備
[0051](I)熒光微球的制備:常規(guī)方法制備包裹熒光物質(zhì)的直徑為10 μ m的二氧化硅熒光微球；
[0052](2)用熒光微球標(biāo)記涕滅威適體，并將其噴涂在玻璃纖維素膜上。
[0053]4、檢測(cè)涕滅威殘留的適體試紙實(shí)施檢測(cè)原理
[0054](I)把試紙的樣品吸液層端插入果汁、蔬菜浸出液中，由于毛細(xì)作用進(jìn)行側(cè)向?qū)游?5-10min觀察；
[0055](2)熒光微球在燈源激發(fā)下，發(fā)出強(qiáng)烈的熒光條帶；
[0056](3)檢測(cè)涕滅威濃度0.1 μ g/mL以上，NC膜上出現(xiàn)一條質(zhì)控線的熒光條帶為陽(yáng)性；
0.1 μ g/mL以下出現(xiàn)雙熒光條帶為陰性。
[0057]對(duì)于所屬【技術(shù)領(lǐng)域】的技術(shù)人員而言，隨著技術(shù)的發(fā)展，本實(shí)用新型構(gòu)思可以不同方式實(shí)現(xiàn)。本實(shí)用新型的實(shí)施方式并不僅限于以上描述的實(shí)施例，而且可在權(quán)利要求的范圍內(nèi)進(jìn)行變化。
【權(quán)利要求】
1.一種檢測(cè)涕滅威的新型適體試紙，其特征在于:所述的試紙是由底板(I)、吸水墊(2)、NC膜(3)、適體-熒光-微球墊(4)、樣品吸液層(5)組成；底板(I)是長(zhǎng)方形的平板，樣品吸液層(5 )、適體-熒光-微球墊(4)、NC膜(3 )、吸水墊(2 )依次順序粘貼在底板(I)上。
2.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)涕滅威的新型適體試紙，其特征在于:NC膜(3)和吸水墊(2 )之間依次設(shè)有檢測(cè)線(6 )和質(zhì)控線(7 )。
3.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)涕滅威的新型適體試紙，其特征在于:所述的底板(I)的材料是塑料。
4.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)涕滅威的新型適體試紙，其特征在于:所述的底板(I)的材料是PVC。
5.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)涕滅威的新型適體試紙，其特征在于:所述的吸水墊(2)的材料是濾紙。
6.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)涕滅威的新型適體試紙，其特征在于:所述的適體-熒光-微球墊(4)是涕滅威適體組裝的納米熒光微球墊。
7.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)涕滅威的新型適體試紙，其特征在于:所述的樣品吸液層(5)的材料是玻璃纖維素膜。
8.如權(quán)利要求2所述的檢測(cè)涕滅威的新型適體試紙，其特征在于:所述的檢測(cè)線(6)是涕滅威適體互補(bǔ)序列的檢測(cè)線。
9.如權(quán)利要求2所述的檢測(cè)涕滅威的新型適體試紙，其特征在于:所述的質(zhì)控線(7)是生物素質(zhì)控線。
【文檔編號(hào)】G01N21/64GK204008470SQ201420428546
【公開(kāi)日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2014年7月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月31日
【發(fā)明者】王耘, 王淮慶 申請(qǐng)人:金陵科技學(xué)院