本發(fā)明屬于生化分析技術(shù)領(lǐng)域，涉及固相富集糖蛋白的方法及糖蛋白的質(zhì)譜檢測分析。

背景技術(shù)：

研究公開了糖基化是生物體內(nèi)組普遍存在的一種翻譯后修飾，并執(zhí)行著重要的生物學(xué)功能。糖基化修飾在各種生命現(xiàn)象中起著重要的作用，如，參與細(xì)胞粘附及信號傳導(dǎo)，影響蛋白質(zhì)的分泌和穩(wěn)定性，免疫及炎癥反應(yīng)以及影響蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)送方向等。研究報道，約有生物體內(nèi)1/2以上的蛋白質(zhì)會發(fā)生糖基化。更重要的是，有些糖蛋白通常被認(rèn)為是重要的生物標(biāo)志物，因此它們的檢測往往和相關(guān)病理或生理過程有著非常緊密的聯(lián)系。例如，乳腺癌中的Her2/neu、前列腺癌中的前列腺特異性抗原、卵巢癌中的CA125等都是糖蛋白，而且都被認(rèn)為是診斷標(biāo)志物及治療的標(biāo)靶。然而，糖蛋白的研究還面臨以下兩方面困難。首先，含有糖基化修飾的蛋白質(zhì)種類雖然很多，但其豐度卻通常較低，而且其酶解成肽段后占全部肽段的比例更低，通常只有1-3％左右的肽段帶有糖基化修飾；第二，帶有糖基化修飾的肽段在質(zhì)譜中的離子化效率往往比非修飾肽段低，因而不易被質(zhì)譜鑒定；第三，盡管已經(jīng)有較多的方法實現(xiàn)了糖蛋白的富集，但用傳統(tǒng)的方法，如抗原抗體免疫反應(yīng)和蛋白質(zhì)印記法，只能單獨研究很少量的蛋白，而且比較耗時。因此，一種高通量、高靈敏、高選擇的糖蛋白檢測系統(tǒng)和方法亟待開發(fā)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于提供一種步驟簡單、操作方便、快速高效、能實現(xiàn)固相富集糖蛋白并聯(lián)用質(zhì)譜檢測的系統(tǒng)及檢測方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一種糖蛋白固相富集耦合質(zhì)譜檢測的系統(tǒng)，包括酰肼修飾的多孔酶反應(yīng)器及質(zhì)譜儀；所述酰肼修飾的多孔酶反應(yīng)器采用酰肼基團(tuán)修飾的多孔氧化硅材料為吸附劑，對糖蛋白進(jìn)行選擇性富集和快速原位酶解，酶解產(chǎn)物由所述質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析。

進(jìn)一步地，所述多孔氧化硅材料采用酰肼修飾。氧化硅為SiO₂。

進(jìn)一步地，經(jīng)酰肼基團(tuán)修飾的所述多孔氧化硅材料的孔徑小于等于10μm，優(yōu) 選為100nm左右。

進(jìn)一步地，經(jīng)酰肼基團(tuán)修飾的所述多孔氧化硅材料的水滴接觸角大于等于20度。

進(jìn)一步地，所述質(zhì)譜儀包括電噴霧型質(zhì)譜儀或激光解析電離型質(zhì)譜儀。

一種糖蛋白固相富集耦合質(zhì)譜檢測的方法，包括以下步驟：

步驟1：合成酰肼基團(tuán)修飾的多孔氧化硅材料；

步驟2：在生物樣品中，加入步驟1中經(jīng)酰肼基團(tuán)修飾的多孔氧化硅材料；

步驟3：收集下層固體相，即所述經(jīng)酰肼基團(tuán)修飾的多孔氧化硅材料；

步驟4：清洗步驟3中收集到的所述下層固體相，加入蛋白酶進(jìn)行酶解；

步驟5：進(jìn)行質(zhì)譜分析。

進(jìn)一步地，所述步驟1中采用后嫁接法合成酰肼修飾的多孔氧化硅材料。

進(jìn)一步地，所述步驟2中所述生物樣品的濃度為0.001mg/mL～100mg/mL，體積小于100mL。

進(jìn)一步地，所述步驟4中酶解溶液的pH值范圍為4～11，溫度范圍為20～50℃。

進(jìn)一步地，所述步驟4中的蛋白酶為胰蛋白酶。

本發(fā)明利用酰肼修飾的材料表面與糖蛋白的化學(xué)結(jié)合作用以及多孔氧化硅材料的孔容限定作用，實現(xiàn)糖蛋白在眾多蛋白中的選擇性富集，對富集有糖蛋白的氧化硅納米材料進(jìn)行原位酶解，分別收集富集有糖基化肽的氧化硅納米材料和上清溶液，對富集有糖基化肽的氧化硅納米材料進(jìn)行洗脫，洗脫液和上清溶液混合后進(jìn)行質(zhì)譜檢測，根據(jù)譜圖數(shù)據(jù)分析，可實現(xiàn)對糖蛋白有效精確的分析。本發(fā)明選用的功能化的多孔氧化硅材料具有巨大的比表面積和孔容體積，蛋白的選擇性富集和快速原位酶解，可以有效檢測低豐度糖蛋白，同時免去傳統(tǒng)酶解耗時長等缺點。利用多孔材料的預(yù)處理富集有利于低豐度糖蛋白的檢測，而質(zhì)譜技術(shù)又提供高通量分析糖蛋白的方法。這種酰肼修飾的多孔氧化硅材料固相富集糖蛋白與質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)可以實現(xiàn)對糖蛋白快速、高效、靈敏、選擇性的檢測。

以下將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，以充分說明本發(fā)明的目的、技術(shù)特征和技術(shù)效果。

附圖說明

圖1是本發(fā)明糖蛋白固相富集耦合質(zhì)譜檢測的流程圖；

圖2是本發(fā)明較優(yōu)實施例中得到的材料的掃描電子顯微鏡圖片和透射電子顯微鏡圖片，圖2a是透射電子顯微鏡圖片(TEM)，圖2b是掃描電子顯微鏡圖片(SEM)。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述。

酰肼修飾的多孔氧化硅納米材料可按下述步驟以有機(jī)硅為修飾劑通過后嫁接法合成：

將1.2～1.5克聚環(huán)氧乙烷-聚環(huán)氧丙烷-聚環(huán)氧乙烷三嵌段共聚物和1.5～1.8克無水硫酸鈉溶解在30～40克pH為5～6的醋酸-醋酸鈉緩沖液中，在室溫下機(jī)械攪拌24～36小時，再加入1.3～1.8克四甲氧基硅烷并攪拌24～36小時，然后置于不銹鋼高壓反應(yīng)釜中，將反應(yīng)釜置于100～130攝氏度的烘箱中24～36小時，取出，用去離子水洗滌除去未反應(yīng)的反應(yīng)物，最后將產(chǎn)物真空干燥并保存，取0.1～0.3克產(chǎn)物，加入0.2～0.3克(3-環(huán)氧丙氧基丙基)甲基二乙氧基硅烷，最后加入1.0～4.0克肼-水合物反應(yīng)24小時，收集備用。

配制1mg/mL的酰肼修飾的的多孔氧化硅材料，超聲震蕩10分鐘，在銅網(wǎng)和鋁箔上制樣，電子顯微鏡圖像采用JEOL2011顯微鏡。掃描電子顯微鏡圖像采用JEOL飛利浦XL30顯微鏡。其掃描電子顯微鏡圖片和透射電子顯微鏡圖片如圖2所示。

在較優(yōu)的實施例中，多孔氧化硅納米材料的孔徑為70～120nm，選用酰肼修飾的多孔氧化硅材料，與樣品溶液在35～40攝氏度下混合20～30分鐘，以使樣品中的糖蛋白充分吸附；樣品溶液濃度為0.1mg/mL～1mg/mL,體積為～1mL；所述的樣品溶液溶于0.2％氯化銨的羥乙基哌嗪乙硫磺酸緩沖液中。

本發(fā)明中，對于步驟3中得到的下層固體相，用25mM,pH～8.0的碳酸氫銨緩沖液清洗材料1～3次，去除材料上非特異性吸附的蛋白質(zhì)，再把材料重新溶于100mM,pH～8.0的緩沖液中，然后加10mg/mL胰蛋白酶溶液在納米材料孔中原位快速酶解。收集在上清中的酶解產(chǎn)物，進(jìn)行質(zhì)譜分析。

實施例1：酰肼修飾的大孔氧化硅納米材料對細(xì)胞裂解液富集能力的試驗。

配制細(xì)胞裂解液溶液(溶于乙腈水溶液中)，將材料在該溶液中孵育15～30分鐘，在離心作用下將材料從溶液中分離出來。棄除上清液，加入胰蛋白酶快速原位酶解。冷凍旋干酶解產(chǎn)物后，加入三氟乙酸的乙腈水溶液，進(jìn)入電噴霧型質(zhì)譜進(jìn)行分析，可一次性分析檢測數(shù)百種蛋白，并且富集效率很高，具體鑒定的部分糖蛋白見表1。

表1.細(xì)胞裂解液中糖蛋白的富集實驗后檢測到的部分糖蛋白。

實施例2：酰肼修飾的多孔氧化硅納米材料對血清溶液中糖蛋白富集能力的試驗。

配制血清溶液(溶于乙腈水溶液中)，將材料在該溶液中孵育15～30分鐘，在離心作用下將材料從溶液中分離出來。棄除上清液，加入胰蛋白酶快速原位酶解。冷凍旋干酶解產(chǎn)物后，加入三氟乙酸的乙腈水溶液，進(jìn)入電噴霧型質(zhì)譜進(jìn)行分析，可一次性分析檢測數(shù)百種蛋白，并且富集效率很高，具體鑒定的部分糖蛋白見表2。

以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的較佳具體實施例。應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域的普通技術(shù)無需創(chuàng)造性勞動就可以根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思作出諸多修改和變化。因此，凡本技術(shù)領(lǐng)域中技術(shù)人員依本發(fā)明的構(gòu)思在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上通過邏輯分析、推理或者有限的實驗可以得到的技術(shù)方案，皆應(yīng)在由權(quán)利要求書所確定的保護(hù)范圍內(nèi)。