本發(fā)明屬于海洋生物醫(yī)藥技術領域，具體涉及一種擬海桑提取物的生物活性MTT測定方法。
背景技術：
擬海桑(Sonneratiapara caseolaris)屬于海?？坪Ｉ?，為我國稀有瀕危紅樹植物，僅天然分布于海南島，分布范圍狹窄，個體數(shù)量稀少。正處于瀕危狀態(tài)，被列入《中國生物多樣性國情研究報告》中國被子植物瀕危及稀有種名錄。在前期的生物活性篩選實驗中，擬海桑的甲醇提取物對小鼠白血病腫瘤細胞株P-388和人肝癌細胞株BEL-7402顯示較強的細胞毒活性。因此，本項目選擇擬海桑進行細致的化學成分研究，期望發(fā)現(xiàn)海洋來源活性先導化合物。
擬海桑化學成分的研究只有一篇報道，2012年郭躍偉課題組對采自廣東湛江的擬海桑進行化學成分研究，從中分離得到一個新骨架化合物ParacaseolideA(69)是一個二聚-烷基丁內酯類化合物內酯甲素，體外藥理活性篩選顯示該化合物對細胞周期分裂蛋白25B具有顯著的抑制活性。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明旨在為擬海桑的提取物提供一種方便可靠的生物活性測定方法。
一種擬海桑提取物的生物活性MTT測定方法，包括如下步驟：
(1)取對數(shù)期腫瘤細胞，調整細胞懸液的濃度為200000個/mL，每孔200μL，加入96孔細胞培養(yǎng)板中；
(2)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h(37oC，5%CO2)；
(3)待測樣品分別設5個濃度梯度(每個濃度3個平行樣)，同時設陰性、陽性對照，每孔加空白液或樣品液2μL，培養(yǎng)72h；
(4)每孔加入MTT液10μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h；
(5)終止培養(yǎng)，離心8min(37oC、2000r/min)，吸去孔內培養(yǎng)液；
(6)每孔加入DMSO各100μL，于微量振蕩器中振蕩15min，直至結晶充分溶解；
(7)酶標儀測定每孔在570nm處的吸光值(即OD值)。取三孔的平均OD值，按公式IR%=(OD空白對照-OD樣品)/OD空白對照×100%計算樣品對細胞增殖的抑制率(IR%)。
測定原理為：MTT為3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide，3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，是一種黃顏色的染料，其檢測原理為在活細胞線粒體中，琥珀酸脫氫酶可以使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶（Formazan）并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。Formazan與活細胞數(shù)成正比，二甲基亞砜（DMSO）能溶解細胞中的甲瓚，用酶標儀在570nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數(shù)量。以此原理來測定化合物的抗腫瘤活性。
本發(fā)明的測定方法相對于現(xiàn)有技術簡單快速、而且檢測結果可靠，適于推廣應用。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明。
選擇HL-60、P388和K562細胞株用MTT法對從擬海桑分離得到的木質素類化合物(SP-29~SP-32)進行細胞毒活性的評價，包括如下步驟：
(1)取對數(shù)期腫瘤細胞，調整細胞懸液的濃度為200000個/mL，每孔200μL，加入96孔細胞培養(yǎng)板中；
(2)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h(37oC，5%CO2)；
(3)待測樣品分別設5個濃度梯度(每個濃度3個平行樣)，同時設陰性、陽性對照，每孔加空白液或樣品液2μL，培養(yǎng)72h；
(4)每孔加入MTT液10μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h；
(5)終止培養(yǎng)，離心8min(37oC、2000r/min)，吸去孔內培養(yǎng)液；
(6)每孔加入DMSO各100μL，于微量振蕩器中振蕩15min，直至結晶充分溶解；
(7)酶標儀測定每孔在570nm處的吸光值(即OD值)。取三孔的平均OD值，按公式IR%=(OD空白對照-OD樣品)/OD空白對照×100%計算樣品對細胞增殖的抑制率(IR%)。
測定結果見表，分析表中數(shù)據(jù)可以看出在濃度為50μM濃度水平，化合物SP-29和SP-31對3種腫瘤細胞株都具有中等以上的抑制活性，SP-30對K562細胞株有中等強度的細胞毒活性，SP-32對這3種細胞株的活性均較弱。
表1 擬海桑中木質素類化合物SP-29~SP-32對HL-60腫瘤細胞株的抑制率(%)
表2 擬海桑中木質素類化合物SP-29~SP-32對P388腫瘤細胞株的抑制率(%)
表3 擬海桑中木質素類化合物SP-29~SP-32對K562腫瘤細胞株的抑制率(%)
對初篩活性較好的化合物(抑制率大于30%)進行了IC50測試，IC50結果顯示化合物SP-31對腫瘤細胞株P388、HL-60和K562均有很強的細胞毒活性，化合物SP-29對這3種細胞株表現(xiàn)出中等強度的抑制作用，而化合物SP-30和SP-32均無活性。比較其結構可以發(fā)現(xiàn)，化合物SP-29和SP-31結構中都含有甲氧基，而SP-30和SP-32中卻沒有，推斷可能甲氧基對抗腫瘤活性起著至關重要的作用，比較SP-29和SP-31的結構和活性不難發(fā)現(xiàn)甲氧基的位置對于抗腫瘤活性的選擇性具有顯著影響。