本發(fā)明涉及對肥料中抑制劑作用效果的測定方法，具體來說是一種測定穩(wěn)定性肥料中脲酶抑制劑抑制效果的方法。
背景技術：
穩(wěn)定性肥料是經過一定工藝加入脲酶抑制劑和(或)硝化抑制劑，施入土壤后能通過脲酶抑制劑抑制尿素的水解，和(或)通過硝化抑制劑抑制銨態(tài)氮的硝化，使肥效期得到延長的一類含氮素肥料(包括含氮的二元或三元肥料和單質氮肥)。在肥料的長效作用中，脲酶抑制劑起到了關鍵性作用，脲酶抑制劑是通過抑制脲酶的活性，間接地抑制脲酶對尿素的水解作用，其減緩了尿素向銨態(tài)氮的轉化。因此，檢驗穩(wěn)定性肥料中的脲酶抑制劑的抑制效果無疑非常重要。
目前，已建立了一系列的緩釋肥料行業(yè)(或企業(yè))的檢測標準和檢測方法(如土培法)，但存在著諸多弊端：諸如檢測過程的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性較差、土壤脲酶活性難能達到統(tǒng)一標準、操作的程序繁雜且時間冗長、檢測的影響因素不確定、不統(tǒng)一等等。
鑒于上述弊端，為了快捷而準確地對穩(wěn)定性肥料進行評價，需要提供一種快速準確的測定穩(wěn)定性肥料中脲酶抑制劑抑制效果的方法。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種測定穩(wěn)定性肥料中脲酶抑制劑抑制效果的方法。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案為：
一種測定穩(wěn)定性肥料中脲酶抑制劑抑制效果的方法，將待測樣品經緩沖液溶解室溫下震蕩，取溶解待測樣品的濾液采用對二甲氨基苯甲醛比色法測定溶解待測樣品的濾液中的尿素濃度，進而計算出待測樣中的尿素含量(x)，由此計算出尿素殘留量測定中樣品的稱樣量(m1)；
根據(jù)上述樣品的稱樣量(m1)，再次分別稱取待測樣品和對照樣品，并向兩種樣品中分別加入風干土和脲酶溶液，而后分別于室溫下震蕩培養(yǎng)，取各培養(yǎng)液培養(yǎng)后濾液采用對二甲氨基苯甲醛比色法測定濾液中的尿素濃度，進而計算出待測樣品中尿素殘留量A和對照樣品中尿素殘留量B，待用；
由上述待測樣品和對照樣品中尿素殘留量A、B的計算得到尿素殘留差異率，進而得出待測樣品中脲酶抑制劑抑制效果。
所述的穩(wěn)定性肥料必須是含有一種或多種脲酶抑制劑的穩(wěn)定性肥料；所述的脲酶抑制劑為在一段時間內通過抑制脲酶的活性，從而減緩尿素水解的一類物質，常用的脲酶抑制劑有NBPT、PPD、TPT、PT、HQ、TU、P-苯琨等。
對照樣品的配制方法為，稱取與試料中等氮、五氧化二磷、氧化鉀百分含量的分析純試劑作為對照樣品，其中酰銨態(tài)氮肥的含量按實際測得的肥料中酰胺態(tài)氮含量計算，以尿素形式配入，銨態(tài)氮肥可使用磷酸一銨加入，不足的磷肥可使用氯化銨配入，鉀肥可使用氯化鉀。
所述風干土的加入量為尿素質量的10-20倍；脲酶溶液中加入量以脲酶計為尿素質量的3％-4％。
尿素殘留差異率的計算：尿素殘留差異率
其中：A——試料的尿素殘留量，單位為毫克(mg)；B——對照樣品的尿素殘留量，單位為毫克(mg)。
所述緩沖液為磷酸氫二鈉和磷酸二氫鉀配制得到的pH為6.5的溶液。
所述樣品的稱樣量(m1)以公式，計算。
所述尿素質量的測定使用對二甲氨基苯甲醛比色法。所述對二甲氨基苯甲醛分光光度法測定，吸取一定量的濾液，加入適量對二甲氨基苯甲醛顯色劑，用蒸餾水定容至25mL后放置20min,用1cm比色皿在420nm波長處測定樣品吸光度值，根據(jù)標準曲線的線性回歸方程計算出尿素濃度C g/L，根據(jù)公式m＝6250×C計算出尿素質量m mg。
所述尿素標準曲線是以尿素濃度為縱坐標，吸光度為橫坐標，根據(jù)以不同濃度尿素標準溶液在顯色劑對二甲氨基苯甲醛作用下于420nm波長處測得的吸光度，繪制標準曲線并得出線性回歸方程。
所述風干土為按五點法采回的耕層土壤(0-20cm，pH值5.5-8.5)，風干，研磨，過1mm篩。
本發(fā)明所具有優(yōu)點：
本發(fā)明方法能夠快速準確的測定穩(wěn)定性肥料中脲酶抑制劑的作用效果。該方法將脲酶引入監(jiān)測體系中，加快了肥料中尿素的水解速度，使得添加了脲酶抑制劑的穩(wěn)定性肥料對于尿素轉化的抑制作用效果在短時間內表現(xiàn)出來，并通過尿素殘留差異率這個指標準確的體現(xiàn)出來。本發(fā)明方法降低了傳統(tǒng)方法中土壤差異對檢測結果的干擾，檢測效率高、準確度高、操作快捷簡便，結果準確可靠，重現(xiàn)性好。
具體實施方式
下面通過具體實施例對本發(fā)明做進一步詳述，以下實施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本發(fā)明的保護范圍。
本發(fā)明通過加入一定量的脲酶溶液來加快含有脲酶抑制劑的穩(wěn)定性肥料中尿素的水解速度，以基礎肥料作為對照，經過一段時間的震蕩培養(yǎng)，用對二甲氨基苯甲醛比色法測定穩(wěn)定性肥料和對照肥料中尿素的殘留質量，從而計算出兩者的尿素殘留差異率，來判斷脲酶抑制劑的作用效果。本發(fā)明人為加入脲酶溶液，快速分解肥料中的尿素，縮短了檢測時間，降 低了傳統(tǒng)方法中因土壤差異對檢測結果帶來的干擾。簡化了操作步驟；方法準確度高，易操作；結果穩(wěn)定可靠，重現(xiàn)性好。
試劑和材料
1)脲酶：巨豆酶，活性為1U/mg，-20℃冰箱內保存；脲酶溶液ρ＝0.15g/L：稱取0.1500g活性為1U/mg的脲酶干粉，溶解于緩沖液中，用緩沖液定容至1000mL，現(xiàn)用現(xiàn)配。
2)對二甲氨基苯甲醛顯色劑：準確稱量2.0000g對二甲氨基苯甲醛溶于由10mL濃鹽酸和100mL無水乙醇組成的混合液中，于棕色瓶中存放。
3)緩沖液：稱取22.25g磷酸氫二鈉和17.00g磷酸二氫鉀溶解于800mL水中，定容至2L。
4)尿素標準溶液ρ＝0.5g/L：稱取0.5000g尿素(分析純)溶解于500mL水中，定容至1L，置于冰箱中4℃冷藏保存。
5)風干土：將未施過肥料兩個月以上的耕層土壤(0-20cm，pH值5.5-8.5)按五點法采回實驗室，風干，研磨，過1mm篩，混勻備用。
實施例1
1)稱取約含0.5g尿素的試樣m0g，置于250mL錐形瓶內，準確加入100mL緩沖液，于25℃恒溫培養(yǎng)振蕩器內(180r/min)振蕩0.5h后取出過濾，吸取2.0mL濾液，用蒸餾水稀釋至50mL。吸取10.0mL稀釋后的濾液至25mL容量瓶內，加入10mL對二甲氨基苯甲醛顯色劑，用蒸餾水定容。放置20min，待氣泡完全消失后，用1cm比色皿，以試劑空白做參比，在420nm波長處測定吸光度值，根據(jù)標準曲線的線性回歸方程計算出尿素濃度C g/L。
尿素質量m(mg)的計算：
m—尿素質量，單位為毫克(mg)；
C—根據(jù)標準曲線的線性回歸方程計算出尿素濃度，單位為克每升(g/L)；
25—顯色體積，單位為毫升(mL)；
—稀釋倍數(shù)；
—分取倍數(shù)。
尿素含量(x％)的計算：
其中：
x—尿素含量，單位為％；
m—尿素質量，單位為毫克(mg)；
m0—試樣稱樣量，單位為克(g)；
1000—換算系數(shù)，毫克換算成克；
100—百分含量換算。
計算結果保留到小數(shù)點后一位。
三次平行，取平行測定結果的算術平均值為測定結果。
尿素殘留量的測定中試料和對照樣品的稱樣量m1(g)的計算：
其中：
m1—尿素殘留量的測定中試料和對照樣品的稱樣量，單位為毫克(mg)；
x—尿素含量，單位為％；
2)尿素標準曲線制作：分別吸取0.5g/L的尿素標準溶液0.0、2.0、4.0、6.0、8.0和10.0mL，分別移至25mL容量瓶中，加10mL對二甲氨基苯甲醛顯色劑，用蒸餾水定容。此尿素系列標準溶液尿素濃度分別為0.00、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20g/L。放置20min，待氣泡完全消失后，用1cm比色皿，在420nm波長處比色，測定吸光度，以尿素濃度為縱坐標，吸光度為橫坐標，繪制標準曲線并得出線性回歸方程。
3)對照樣品的配制：稱取與試料中等氮、五氧化二磷、氧化鉀百分含量的分析純試劑作為對照樣品，其中酰銨態(tài)氮肥的含量按實際測得的肥料中酰胺態(tài)氮含量計算，以尿素形式配入，銨態(tài)氮肥可使用磷酸一銨加入，不足的磷肥可使用氯化銨配入，鉀肥可使用氯化鉀。
4)尿素殘留量的測定：分別稱取m1g(前面根據(jù)尿素含量計算出的稱樣量)試料和對照樣品，置于250mL錐形瓶中，在兩個瓶中再分別加入5.00g風干土和0.15g/L的脲酶液(其中脲酶液是將活性為1U/mg的脲酶用緩沖溶液配制而成的)100mL，在37℃恒溫振蕩器(180r/min)中振蕩5h后取出過濾。
5)吸取2.0mL濾液，用蒸餾水稀釋至50mL。吸取5.0mL稀釋后的濾液至25mL容量瓶內，加10mL對二甲氨基苯甲醛顯色劑，用蒸餾水定容。放置20min，待氣泡完全消失后，用1cm比色皿，以試劑空白做參比，在420nm波長處測定吸光度值，根據(jù)尿素標準曲線的線性回歸方程計算出尿素殘留量。
6)三次平行，取平行測定結果的算術平均值為測定結果。平行測定結果之間相對偏差不大于5.0％。
7)尿素殘留差異率(dU)的計算：
其中：
A—穩(wěn)定性肥料的尿素殘留量，單位為毫克(mg)；
B—對照肥料的尿素殘留量，單位為毫克(mg)。
計算結果保留到小數(shù)點后一位。
實施例2
試樣樣品為市場上收集的兩種不同配方的穩(wěn)定性肥料產品，這兩個產品均含有脲酶抑制劑。1號樣品配方為N-P2O5-K2O＝23-13-8；2號樣品配方為N-P2O5-K2O＝26-12-10。用上述檢測方法對這兩種樣品進行尿素含量及尿素殘留差異率的測定。對檢測結果進行分析，驗證該方法的可靠性。
對這兩種樣品的具體分析步驟如下：
1)將收集到的1、2號樣品分別研磨粉碎，過0.25mm篩，裝袋備用。
2)分別稱取約含0.5g尿素的試樣樣品1和2m0g，分別置于250mL錐形瓶內，分別準確加入100mL緩沖液，于25℃恒溫培養(yǎng)振蕩器內(180r/min)振蕩0.5h后分別取出過濾，吸取2.0mL濾液，用蒸餾水稀釋至50mL。分別吸取10.0mL稀釋后的濾液至25mL容量瓶內，加入10mL對二甲氨基苯甲醛顯色劑，用蒸餾水定容。放置20min，待氣泡完全消失后，用1cm比色皿，以試劑空白做參比，在420nm波長處測定吸光度值，根據(jù)標準曲線的線性回歸方程計算出尿素濃度C g/L。
尿素質量m(mg)的計算：
m—尿素質量，單位為毫克(mg)；
C—根據(jù)標準曲線的線性回歸方程計算出尿素濃度，單位為克每升(g/L)；
25—顯色體積，單位為毫升(mL)；
—稀釋倍數(shù)；
—分取倍數(shù)。
尿素含量(x％)的計算：
其中：
x—尿素含量，單位為％；
m—尿素質量，單位為毫克(mg)；
m0—試樣稱樣量，單位為克(g)；
1000—換算系數(shù)，毫克換算成克；
100—百分含量換算。
計算結果保留到小數(shù)點后一位。
三次平行，取平行測定結果的算術平均值為測定結果。
尿素殘留量的測定中試料和對照樣品的稱樣量m1(g)的計算：
其中：
m1—尿素殘留量的測定中試料和對照樣品的稱樣量，單位為毫克(mg)；
x—尿素含量，單位為％；
3)尿素標準曲線制作：分別吸取0.5g/L的尿素標準溶液0.0、2.0、4.0、6.0、8.0和10.0mL，分別移至25mL容量瓶中，加10mL對二甲氨基苯甲醛顯色劑，用蒸餾水定容。此尿素系列標準溶液尿素濃度分別為0.00、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20g/L。放置20min，待氣泡完全消失后，用1cm比色皿，在420nm波長處比色，測定吸光度，以尿素濃度為縱坐標，吸光度為橫坐標，繪制標準曲線并得出線性回歸方程。
4)對照樣品的配制：稱取與試料中等氮、五氧化二磷、氧化鉀百分含量的分析純試劑作為對照樣品，其中酰銨態(tài)氮肥的含量按實際測得的肥料中酰胺態(tài)氮含量計算，以尿素形式配入，銨態(tài)氮肥可使用磷酸一銨加入，不足的磷肥可使用氯化銨配入，鉀肥可使用氯化鉀。
5)尿素殘留量的測定：分別稱取m1g(前面根據(jù)尿素含量計算出的稱樣量)試料和對照樣品，置于250mL錐形瓶中，在兩個瓶中再分別加入5.00g風干土和0.15g/L的脲酶液(其中脲酶液是將活性為1U/mg的脲酶用緩沖溶液配制而成的)100mL，在37℃恒溫振蕩器(180r/min)中振蕩5h后取出過濾。
6)吸取2.0mL濾液，稀釋至50mL。吸取5.0mL稀釋后的濾液至25mL容量瓶內，加10mL對二甲氨基苯甲醛顯色劑，用蒸餾水定容。放置20min，待氣泡完全消失后，用1cm比色皿，以試劑空白做參比，在420nm波長處測定吸光度值，根據(jù)尿素標準曲線的線性回歸方程計算出尿素殘留量。
7)三次平行，取平行測定結果的算術平均值為測定結果。平行測定結果之間相對偏差不大于5.0％。
8)尿素殘留差異率(dU)的計算：
其中：
A—穩(wěn)定性肥料的尿素殘留量，單位為毫克(mg)；
B—對照肥料的尿素殘留量，單位為毫克(mg)。
計算結果保留到小數(shù)點后一位。
9)試驗結果如下表1：
表1
從上表中的數(shù)據(jù)可以看出，對不同配方樣品的尿素含量和尿素殘留差異率的測定結果都有較高的的精密度，相對標準偏差均小于5％。按照本發(fā)明的檢測方法，其尿素殘留差異率均可以達到常規(guī)行業(yè)理想的檢測標準。由此可以確認本方法穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，結果準確可靠。采用本檢測方法是耐得住生產樣品檢驗的。