本專利申請主張2014年9月25日提交的美國臨時專利申請序列號no.62/055,491的優(yōu)先權，該專利申請的全部內(nèi)容作為參考并入本文。

本發(fā)明總體上涉及癌癥診斷領域，并且更具體地涉及用于預期鑒別mcrpc患者中對ar靶向療法的新生抵抗性(denovoresistance)的方法。

發(fā)明背景

在美國，前列腺癌(pc)仍是最常見的非皮膚癌癥。僅在2014年，前列腺癌的預計發(fā)病率為233,000例，其中死亡29,480人，這使得轉移性前列腺癌療法確實成為尚未滿足的醫(yī)學需求。siegeletal.,2014.cacancerjclin.2014；64(1):9–29。歐洲流行病學研究顯示了相當?shù)臄?shù)據(jù)，其中2012年預計新發(fā)病416,700例，占癌癥診斷患者的22.8％。總的來說，預期有92,200例pc-特異性死亡，這使得3位癌癥患者中有1位最可能死于pc，其死亡率為9.5％。

隨著僅在過去5年中所測試和批準用于患有轉移性去勢治療-抵抗性前列腺癌(mcrpc)的患者治療的新型藥劑的指數(shù)增長，出現(xiàn)了有關這些藥劑的最佳順序和組合的問題。存在一些幫助指導臨床醫(yī)師最佳的順序方法，并且將評價癥狀的存在或缺少、表現(xiàn)狀況以及疾病負荷，從而幫助對于這些試劑確定最佳順序的指南。mohleretal.,2014,jnatlcomprcancnetw.2013；11(12):1471–1479；cooksonetal.,2013,jurol.2013；190(2):429–438。目前，批準的治療包括紫杉烷類細胞毒性藥物和雄激素-靶向療法。對于臨床醫(yī)師而言，挑戰(zhàn)在于決定施用這些療法的最佳順序從而為患者提供最大的益處。然而，基于患者之間對療法的異質(zhì)反應并且根據(jù)每種藥劑的交叉耐藥性，治療失敗仍是巨大的挑戰(zhàn)。mezynskietal.annoncol.2012；23(11):2943–2947；noonanetal.,annoncol.2013；24(7):1802–1807；pezaroetal.,eururol.2014,66(3):459–465。另外，患者會失去從已證明提供整體存活期延長的每種藥物獲得最大益處的治療窗口。因此，鑒別具有最大可能從靶向療法獲得益處的目標人群的更好方法仍是重要的目的。

循環(huán)腫瘤細胞(ctc)代表了癌癥診斷中的巨大發(fā)展，并且由于它們的無創(chuàng)測量而使其更有吸引力。cristofanillietal.,nengljmed351:781-91,(2004)。從原發(fā)瘤或其轉移性位點釋放的ctc具有腫瘤生物學相關的重要信息。定量和鑒定ctc作為液體活組織檢查幫助臨床醫(yī)師選擇治療時程并監(jiān)視患者癌癥發(fā)展。因此，ctc不但可以認為是轉移性疾病的替代生物標志物，而且是無創(chuàng)追蹤腫瘤變化、治療反應、癌癥復發(fā)或患者結局的有希望的重要工具。歷史上，血流中極低水平的ctc結合它們未知的表型明顯阻礙了它們的檢測并且限制了它們的臨床應用。目前，為了利用它們的信息，已發(fā)展了用于ctc檢測、分離和鑒定的多種技術。

仍需要開發(fā)預期鑒別患有對ar靶向療法具有新生抵抗性的腫瘤的患者的準確、無創(chuàng)方法以降低發(fā)病率并且能早期探索替代治療方法。本發(fā)明基于能夠?qū)tc進行表型鑒定的穩(wěn)健ctc檢測和鑒定平臺，通過提供ar靶向療法新生抵抗性的多變量生物標志物預測因子來解決該需求。還提供了相關優(yōu)勢。

發(fā)明概述

本發(fā)明提供了用于預期鑒別mcrpc患者中ar靶向療法的新生抵抗性的方法。

本發(fā)明公開內(nèi)容提供了預測對于前列腺癌患者腫瘤中雄激素受體(ar)靶向療法的新生抵抗性的方法，包括(a)實施包括獲自患者的血液樣品中有核細胞的免疫熒光染色和形態(tài)學表征的直接分析以產(chǎn)生循環(huán)腫瘤細胞(ctc)數(shù)據(jù)，其中所述分析包括確定一組對于雄激素受體(ar)靶向療法的新生抵抗性的常規(guī)和非常規(guī)ctc生物標志物的可測量特征，和(c)評價該ctc數(shù)據(jù)以確定前列腺癌患者腫瘤中ar靶向療法的新生抵抗性的概率。在一些實施方式中，所述免疫熒光染色包括有核細胞的染色，其包括廣譜細胞角蛋白(pancytokeratin)、分化簇(cd)45、二脒基-2-苯基吲哚(dapi)和ar。在一些實施方式中，所述生物標志物包括(1)ctc異質(zhì)性，(2)具有明顯核仁形態(tài)的細胞角蛋白陽性(ck+)、arn-末端陽性ctc的頻率，和(3)arc-末端截短ctc的頻率。根據(jù)權利要求3所述的方法，ctc異質(zhì)性還包括選自下列的生物標志物：常規(guī)ctc、ctc簇、ck-ctc、小ctc、核仁⁺ctc、ck斑點型ctc和表1所列的生物標志物。

根據(jù)詳細說明和權利要求，本發(fā)明的其他特征和優(yōu)勢將是顯而易見的。

附圖說明

圖1顯示ar信號指導療法(a，真實起反應者，n＝30；b，獲得性抵抗者，n＝23；c，重新抵抗者，n＝33)之后的psa變化類型。

圖2a和圖2b顯示了方法和圖像的示意圖。圖2a顯示了epic的ctc采集和檢測過程的示意圖，其如下所示進行：(1)血液裂解，將來自血液樣品的有核細胞置于載玻片上；(2)將載玻片保存在-80℃生物儲備庫中；(3)用ck、cd45、dapi和ar對載玻片染色；(4)掃描載玻片；(5)運行多參數(shù)數(shù)字病理算法，和(6)ctc的軟件和人讀取器確認和生物標志物表達的定量。圖2b顯示了常規(guī)(細胞角蛋白陽性(紅色)、cd45陰性(綠色)，含dapi核(藍色)，形態(tài)不同于周圍白細胞)和非常規(guī)ctc的圖像。

圖3.ar療法反應/抵抗的ctc特征。圖3顯示了表示常規(guī)ctc和非常規(guī)ctc的數(shù)目/7.5ml相對于對a或e(左)或紫杉烷(右)的反應的箱形圖。箱的周邊定義了上和下四分位數(shù)，中值是箱內(nèi)的標志物。須觸線代表觀測值的1.5iqr。

圖4顯示了列出在一線、二線或三線a或e之前根據(jù)反應篩選的患者相對于特異性ctc特征的相對豐度分組的熱圖。ctc特征不互相排斥并且可以不代表唯一事件。對每種表型，以ctc/ml報告所顯示的值(平均ar+/ctc除外)，并且所顯示的值是彩色編碼的以反應所有患者間的相對豐度(高＝紅/深灰色并且為正數(shù)，中等＝黃/淺灰，低＝綠/深灰并且為負數(shù))。

圖5顯示了列出在一線、二線或三線紫杉烷之前根據(jù)反應篩選的患者相對于特異性ctc特征的相對豐度分組的熱圖。ctc特征不互相排斥并且可以不代表唯一事件。對每種表型，以ctc/ml報告所顯示的值(平均ar+/ctc除外)，并且所顯示的值是彩色編碼的以反應所有患者間的相對豐度(高＝紅/深灰色并且為正數(shù)，中等＝黃/淺灰，低＝綠/深灰并且為負數(shù))。

圖6.ar配體結合域改變的測量。圖6顯示了比較接受ar療法的兩位代表性(頂部，1位ar療法抵抗患者；底部，1位ar療法起反應患者)患者(兩者均>40ar+ctc/7.5ml)之間的ar表達值的柱狀圖。使用針對arn-末端蛋白表達和arc-末端蛋白表達的2-靶標測定，檢驗ctc的ar配體結合域(lbd)變化。arc-末端變體表達的喪失與ar療法抵抗性有關。

圖7a-圖7c.ar療法新生抵抗性的預測。圖7a顯示了比較使用分子和形態(tài)學變量預測ar療法反應的單變量和多變量模型的表。圖7b和圖7c顯示了瀑布圖，其顯示了ar療法抵抗性預測與ar療法(圖7b)和紫杉烷(圖7c)治療患者的最大psa降低％之間的關系。

圖8.一線、二線或三線治療決策之間的ctc頻率。圖8顯示了表示使用ar療法或紫杉烷療法的一線、二線或三線治療之前，患者內(nèi)部ctc/7.5ml值的分布的箱形圖。箱的周邊定義了上和下四分位數(shù)，中值是箱內(nèi)的標志物。須觸線代表觀測值的1.5iqr。

圖9a-圖9c顯示了列出在一線(圖9a)、二線(圖9b)或三線(圖9c)療法之前篩選的患者相對于具有特異性特征的ctc的相對豐度(行)的熱圖。ctc特征不互相排斥并且可以不代表唯一事件。對每種表型，以ctc/7.5ml報告所顯示的值(平均ar表達除外)，并且所顯示的值是彩色編碼的以反應所有患者間的相對豐度(高＝紅/深灰色并且為正數(shù)，中等＝黃/淺灰，低＝綠/深灰并且為負數(shù))。

圖10.ctc表型的異質(zhì)性。圖10顯示了點狀圖，其描述了在一線、二線和三線治療決策時，以具有大于1、10或100個ctc/7.5ml的患者表示的最常見的ctc表型的％。右上角表格顯示了組間不相同的ctc亞群中所觀察到的異質(zhì)性的概率。

圖11a和圖11b.ar定位的異質(zhì)性。圖11a顯示了ctc免疫熒光圖像，其顯示了核ar染色、核和細胞質(zhì)ar染色以及細胞質(zhì)ar染色。圖11b是描述在一線、二線、三線療法時具有>5個ar陽性ctc(其中ar定位至核、細胞漿或兩者)的患者的分布的表。

圖12顯示了瀑布圖，其描述了如通過最大psa表達減少％所測量的對一線(淺澄色/箱1)、二線(綠色/箱3)或三線(藍色/箱2)療法的反應的異質(zhì)性。

圖13.ar療法抵抗性的ctc特征隨連續(xù)療法增加。圖13顯示了柱狀圖，其鑒別了預測在一線、二線和三線治療決策時ar療法(a或e)失敗的患者的百分比。預測模型使用了如本文所述的ctc鑒定。

圖14.ctc表型頻率隨連續(xù)療法升高。圖14顯示了柱狀圖，其鑒別了面對一線、二線和三線療法，具有>50ctc事件以及特定相關ctc特征(從左至右，每組柱狀圖為一線、二線和三線治療決策)的患者的百分比。

圖15a和圖15b。圖15a顯示了實施例1的研究群體，圖15b顯示了該群體的前一個患者療法。

圖16a和圖16b。圖16a顯示了實施例2的研究群體，圖16b顯示了mcrpc中的臨床治療決策點。

發(fā)明詳述

本發(fā)明公開部分基于一組生物標志物的鑒定，所述生物標志物可以預期預測患有mcrpc的患者中ar靶向療法的新生抵抗性。如本文所公開的，與對ar靶向療法起反應的患者相比，對ar靶向療法不起反應的患者顯示出ctc亞群更大的異質(zhì)性。如本文進一步公開的，可以使用測量ctc亞群異質(zhì)性的單個ctc鑒定來預測對ar靶向療法的抵抗性。本文還公開了可以使用ctc的上皮細胞表達、雄激素n-末端染色和形態(tài)學評價來預測對ar靶向療法的反應。另外，如本文所公開的，可以使用arc-末端缺失檢測來預測對ar靶向療法的抵抗性。

本文所公開的方法提供了對ar靶向療法的新生抵抗性的預測指示因素。預測生物標志物的鑒定使得能夠在整個mcrpc臨床進展期間對治療性干預和調(diào)整提供早期和發(fā)展的機會。實施生物標志物的可區(qū)分多變量模型來鑒別一組生物標志物，所述生物標志物使得所公開的方法能夠鑒別患有對ar靶向療法具有新生抵抗性的腫瘤的前列腺癌患者。因此，本發(fā)明公開涵蓋了多變量模型以鑒別患有對ar靶向療法具有新生抵抗性的腫瘤的前列腺癌患者。因此，本發(fā)明公開已鑒別了用于鑒別患有對ar靶向療法具有新生抵抗性的腫瘤的前列腺癌患者的預測生物標志物。

在一個實施方式中，本發(fā)明公開提供了預測對于前列腺癌患者腫瘤中雄激素受體(ar)靶向療法的新生抵抗性的方法，包括(a)實施包括得自患者的血液樣品中有核細胞的免疫熒光染色和形態(tài)學表征的直接分析以產(chǎn)生循環(huán)腫瘤細胞(ctc)數(shù)據(jù)，其中所述分析包括確定一組對于雄激素受體(ar)靶向療法的新生抵抗性的常規(guī)和非常規(guī)ctc生物標志物的可測量特征，和(c)評價ctc數(shù)據(jù)以確定前列腺癌患者腫瘤中ar靶向療法的新生抵抗性的概率。在具體的實施方式中，所述前列腺癌是轉移性去勢抵抗性前列腺癌(mcrpc)。在一些實施方式中，所述有核細胞的免疫熒光染色包括廣譜細胞角蛋白、分化簇(cd)45、二脒基-2-苯基吲哚(dapi)和ar。

在一些實施方式中，在本文所公開的方法中使用的生物標志物包括(1)ctc異質(zhì)性、(2)具有明顯核仁形態(tài)的細胞角蛋白陽性(ck+)、arn-末端陽性ctc的頻率和(3)arc-末端截短ctc的頻率。在其他實施方式中，ctc異質(zhì)性包括選自下列的ctc生物標志物：常規(guī)ctc、ctc簇、ck-ctc、小ctc、核仁⁺ctc和ck斑點型ctc以及表1所列的其他生物標志物。

由于2004年美國食品和藥物管理局(fda)的關鍵性批準，通過使用多西他賽，前列腺癌中藥物療法的快速進展得到了極大改善并且導致產(chǎn)生了新紀元，其中通過加入新型激素試劑、免疫療法、二線化療以及放射性藥物(參見表1)，進展已超越了雄激素阻斷療法(adt)。目前，順序的選擇依賴于患者情況，是否存在轉移性疾病癥狀。7,8位無癥狀或最低限度癥狀患者可能受益于sipuleucel-t的早期使用，而使用多西他賽的治療通常保留給具有疼痛的患者。鐳主要用于骨轉移患者，特別是在非侵襲性化療候選的那些患者，對于疼痛緩解作用，可以施用乙酸阿比特龍。在進行多西他賽施用后，可以提供試劑，如卡巴他賽、乙酸阿比特龍、恩雜魯胺或鐳。盡管通過使用這些療法，無疑改善了存活結局，但是對于每種方案，疾病最終將發(fā)展。

處于睪酮或更有效的二氫睪酮(dht)形式的雄激素已是前列腺癌發(fā)展和前列腺分化的明確定義的驅(qū)動因素。照此，當手術睪丸切除術形式的去勢治療實現(xiàn)顯著前列腺腫瘤消退時，在幾十年前已建立了晚期前列腺癌的治療主體。9從那時起，主要由于患者的優(yōu)先選擇，使用化學去勢的取代。10因此，adt已成為局部晚期或轉移性前列腺癌的標準全身治療。11盡管adt在大多數(shù)患者中幾乎始終有效，但是不可避免地發(fā)生了疾病向去勢治療抵抗性的發(fā)展。12目前，逐漸認識到盡管表面上睪酮達到去勢水平，但雄激素受體(ar)仍過表達，這是因為替代受體可以激活ar或者其他靶標基因可以幫助保持去勢-抵抗性表型，13,14因此，在文獻中已廣泛采用術語“去勢治療-抵抗性”。對這些雄激素在刺激前列腺癌生長中的作用的進一步理解導致開發(fā)和批準了阿比特龍和恩雜魯胺。

一些因素與前列腺癌高風險有關。遺傳學、年齡增長以及環(huán)境和地理因素起主要作用。但是，在一些個體中，飲食因素，如紅肉中存在的脂肪-脂肪酸、α亞麻酸的大量消費、微量元素，如硒的缺乏以及低水平的維生素d和e也涉及到前列腺癌發(fā)展的高風險。

應注意除非內(nèi)容中明確規(guī)定，否則如本說明書和所附權利要求中所使用的，單數(shù)形式的“一個”和“所述”包括復數(shù)對象。因此，例如，對“生物標志物”的提及包括兩種或更多種生物標志物的混合物等。

具體地，與給定量有關的術語“約”表示包括正或負5％的偏差。

除非內(nèi)容中明確規(guī)定，否則如包括所附權利要求在內(nèi)的本發(fā)明申請中所使用的，單數(shù)形式的“一個”和“所述”包括復數(shù)參考并且與“至少一個”和“一個或多個”是可互換使用的。

如本文所使用的，術語“包含”、“包括”、“含有”及其任何變化形式旨在覆蓋非排他包含物，從而包含、包括或含有元素或元素表的工藝、方法、方法限定的產(chǎn)品或物質(zhì)組合物不僅僅包括那些元素，而且可以包括未明確列出的或非這些工藝、方法、方法限定的產(chǎn)品或物質(zhì)組合物固有的其他元素。

“生物標志物”是可以測量并且與前列腺癌，具體地，mcrpc的概率有關的任何分子、性質(zhì)、特性或方面。所述術語還涵蓋了可以測量并且與預測對前列腺癌療法，例如，ar靶向療法的反應有關的任何性質(zhì)、特性、特征或方面。對于ctc生物標志物，這些可測量特征可以包括(例如)生物樣品中生物標志物或其型的存在、不存在或濃度，改變的免疫熒光和/或形態(tài)學表型，如(例如)核的詳細信息、核輪廓、存在或不存在核仁、細胞漿的質(zhì)量、細胞漿的量、與適當對照受試者相比免疫熒光染色譜圖的強度和/或?qū)tc生物標志物觀察到的表型的存在或異質(zhì)性程度。除ctc生物標志物之外，生物標志物還可以包括風險指征，包括(例如)年齡、家族史、種族和飲食。

如本文所使用的，術語“組”是指包含一個或多個生物標志物的組合物，如陣列或集合。該術語還可以表示本文所述的一種或多種生物標志物的表達類型的譜圖或指數(shù)。用于生物標志物組的生物標志物的數(shù)目基于生物標志物值的特定組合的靈敏度和特異性值。

如本文所使用的術語“患者”優(yōu)選地指人，但是還涵蓋其他哺乳動物。注意到如本文所使用的術語“生物”、“個體”、“受試者”或“患者”作為同義詞并且可互換使用。

如本文所使用的，術語“循環(huán)腫瘤細胞”或“ctc”旨在涵蓋生物樣品中存在的并且與前列腺癌有關的任何稀有細胞?？梢宰鳛閱蝹€細胞或ctc簇提供的ctc通常是在患者循環(huán)中以極低濃度存在的從實體瘤上脫落的上皮細胞。

如本文所使用的，“常規(guī)ctc”是指單個ctc，它是細胞角蛋白陽性、cd45陰性的，含有dapi核，并且形態(tài)上不同于周圍白細胞。

如本文所使用的，“非常規(guī)ctc”是指至少一種特性不同于常規(guī)ctc的ctc。非常規(guī)ctc包括圖2部分b中所示的5種ctc子類型，其包括ctc簇、至少一種其他生物標志物為陽性從而使其分類為ctc的ck陰性ctc、小ctc、核仁⁺ctc和ck斑點型ctc。如本文所使用的，術語“ctc簇”表示具有接觸細胞膜的兩個或更多個ctc。

如本文所使用的，術語“ctc異質(zhì)性”是指樣品中所觀察到的ctc子類型的數(shù)量和/或頻率。ctc子類型包括本文所述的非常規(guī)ctc以及其特征為與常規(guī)ctc不相關的形態(tài)學和/或免疫熒光表型的任何ctc。如本文所公開的，與對ar靶向療法起反應的患者相比，在對ar靶向療法不起反應的患者異質(zhì)性更強。因此，可以分配對應于樣品ctc子類型數(shù)目的得分。例如，涵蓋每一個可觀察的ctc子類型的樣品將分配最高異質(zhì)性得分，這可以預測患者將不會對ar靶向療法起反應。相反，異質(zhì)性缺乏對應于低異質(zhì)性得分，其可以預測患者有可能對ar靶向療法起反應。可以將患者異質(zhì)性得分計算為每7.5ml血液樣品的生物標志物數(shù)目(異質(zhì)性得分(每位患者)＝#生物標志物，其中[生物標志物]/7.5ml>0)。ctc異質(zhì)性是用于實踐本發(fā)明所述的方法的生物標志物，其涵蓋了總體而言還用作生物標志物的多個可測量特征。表1列出了用于實踐本發(fā)明所述的方法的異質(zhì)性生物標志物的列表。

在一些實施方式中，arc-末端截短ctc的頻率是用于實踐本發(fā)明所述的方法的生物標志物。如本文所公開的，與n-末端ar核染色相比核c-末端ar染色的減少可以預測患者將不會對ar靶向療法起反應。

以其最廣泛的含義，生物樣品可以是含有ctc的任何樣品。樣品可以包括體液，如血液；細胞制劑的可溶性部分或其中生長細胞的培養(yǎng)基的一部分；分離或提取自細胞的染色體、細胞器或膜；在溶液中或與基底結合的基因組dna、rna或cdna；細胞；組織；組織印跡；指紋；細胞；皮膚等。得自受試者的生物樣品可以是含有細胞的任何樣品，并且涵蓋了其中可以檢測ctc的任何材料。樣品可以是(例如)全血、血漿、唾液或者含有細胞的其他體液或組織。

在具體的實施方式中，所述生物樣品是血液樣品。如本文所述，樣品可以是全血，更優(yōu)選地周圍血液或者周圍血液細胞部分。如本領域技術人員將理解的，血液樣品可以包括血液的任何部分或組分，無限制地，t細胞、單核細胞、嗜中性白細胞、紅細胞、血小板和微囊，如外來體和外來體樣微囊。在本發(fā)明公開的背景中，包含在血液樣品中的血細胞涵蓋了任何有核細胞并且不局限于全血組分。照此，血細胞包括(例如)白細胞(wbc)和稀有細胞，包括ctc。

本發(fā)明公開的樣品可以分別包含通過本領域中熟知的方法(例如，facs、免疫組織化學)可分辨的多個細胞群體和細胞亞群。例如，血液樣品可以含有無核細胞群體，如紅細胞(例如，4-5百萬/μl)或血小板(150,000-400,000個細胞/μl)，和有核細胞群體，如wbc(例如，4,500-10,000個細胞/μl)、cec或ctc(循環(huán)腫瘤細胞；例如，2-800個細胞/μl)。wbc可以含有細胞亞群，例如，嗜中性白細胞(2,500-8,000個細胞/μl)、淋巴細胞(1,000-4,000個細胞/μl)、單核細胞(100-700個細胞/μl)、嗜曙紅細胞(50-500個細胞/μl)、嗜堿細胞(25-100個細胞/μl)等的細胞亞群。本發(fā)明公開的樣品是未富集的樣品，即它們未對有核細胞的任何具體群體或亞群富集。例如，未富集的血液樣品未對ctc、wbc、b細胞、t細胞、nk-細胞、單核細胞等富集。

在一些實施方式中，所述樣品是得自健康受試者或基于領域已知的臨床確立的標準(包括，例如，年齡、種族、家庭snd史)而視為前列腺癌或已有前列腺癌的轉移的高風險受試者的血液樣品。在一些實施方式中，所述血液樣品來自已基于組織或液體活組織檢查和/或手術或臨床基礎診斷為前列腺癌和/或mcrpc的受試者。在一些實施方式中，所述血液樣品得自顯示出本領域熟知的前列腺癌和/或mcrpc臨床表現(xiàn)的受試者或者表現(xiàn)出任何已知的前列腺癌和/或mcrpc風險因素的受試者。

如本文在產(chǎn)生ctc數(shù)據(jù)的背景中所使用的，術語“直接分析”是指與檢測前對樣品富集ctc相反，在存在于樣品中的所有周圍有核細胞的背景中檢測ctc。在一些實施方式中，所述方法包括提供包含ctc和至少200個周圍白細胞(wbc)的視場的顯微術。

本發(fā)明公開的基本方面在于就ctc檢測而言，所公開方法前所未有的穩(wěn)健性。就ctc而言，本文所公開的稀有事件檢測基于群體的直接分析(即未富集)，其涵蓋了在周圍非稀有事件的背景中鑒別稀有事件。根據(jù)所公開的方法，稀有事件的鑒別固有地將周圍事件鑒別為非稀有事件?？紤]周圍非稀有事件并確定非稀有事件的平均值，例如，非稀有事件的平均細胞大小，使得能夠通過除去噪音來標定檢測方法。結果是所公開的方法的穩(wěn)健性，這是使用未基于直接分析的方法所不可能實現(xiàn)的，并且相反將富集群體與稀有事件固有失真的背景比較相比較。本文所公開的直接分析方法的穩(wěn)健性使得能夠鑒定ctc，包括本文所述的ctc子類型，其使得能夠鑒別使用其他ctc檢測方法不能實現(xiàn)的表型和異質(zhì)性并且使得能夠在所主張的方法的背景中分析生物標志物。

在一些實施方式中，用于預測對于前列腺癌患者腫瘤中雄激素受體(ar)靶向療法的新生抵抗性的方法還可以涵蓋個體患者風險因素和成像數(shù)據(jù)，其包括本領域已知和使用的任何形式的成像方式，例如并且無限制地，通過x光計算機斷層成像(ct)、超聲、正電子發(fā)射斷層成象術(pet)、電阻抗斷層成像和磁共振(mri)。應理解本領域技術人員可以基于多個本領域已知的標準選擇成像方式。如本文所述，本發(fā)明所述的方法可以涵蓋一幅或多幅成像數(shù)據(jù)。在本文所公開的方法中，一個或多個個體風險因素可以選自年齡、種族、家族史。應理解本領域技術人員可以基于多個本領域已知的標準選擇其他個體風險因素。如本文所述，本發(fā)明所述的方法可以涵蓋一個或多個個體風險因素。因此，生物標志物可以包括成像數(shù)據(jù)、個體風險因素和ctc數(shù)據(jù)。如本文所述，生物標志物還可以包括(但不限于)生物分子，其包括核苷酸、核酸、核苷、氨基酸、糖、脂肪酸、類固醇、代謝產(chǎn)物、肽、多肽、蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪、激素、抗體、用作生物大分子的替代物的感興趣區(qū)及其組合(例如，糖蛋白、核糖核蛋白、脂蛋白)以及生物分子的部分或片段。

ctc數(shù)據(jù)可以包括形態(tài)特征和免疫熒光特征兩者。如本領域技術人員將理解的，生物標志物可以包括生物分子或生物分子的片段，其變化和/或檢測可以單獨或與其他可測量特征結合與前列腺癌和/或mcrpc相關聯(lián)?？梢宰鳛閱蝹€細胞或ctc簇存在的ctc通常是從實體瘤脫落的上皮細胞并且在受試者循環(huán)中以極低濃度存在。因此，血液樣品中ctc的檢測可以被稱為稀有事件檢測。血細胞群體中ctc的豐度小于1:1000，例如，豐度小于1:5000、1:10000、1:30000、1:50000、1:100000、1:300000、1:500000或1:1000000。在一些實施方式中，細胞群體中ctc的豐度為1:50000至1:100000。

本發(fā)明公開的樣品可以通過任何方式獲得，其包括(例如)通過實體組織活組織檢查或液體活組織檢查的方式(參見，例如，marrinuccid.etal.,2012,phys.biol.9016003)。簡要地，在具體的實施方式中，所述方法可以涵蓋7.5ml血液樣品中的溶胞和紅細胞的去除、殘余有核細胞在專用顯微鏡用載玻片上的沉積，每個載玻片容納大致0.5ml全血的等價物?？梢詮囊阎毎蚱浣M分的任何來源提取血液樣品，如靜脈血、動脈血、外周血、組織血、臍帶血等?？梢允褂檬熘统Ｒ?guī)的臨床方法處理樣品(例如，用于吸取和處理全血的程序)。在一些實施方式中，將血液樣品吸入抗凝血液收集管(bct)，其可以含有edta或streck無細胞dna^tm。在其他實施方式中，將血液樣品吸入管(veridex)。在進一步處理前，可以將血液樣品再儲存多至12小時、24小時、36小時、48小時或60小時。

在一些實施方式中，本發(fā)明公開的方法包括獲得血液樣品白細胞(wbc)計數(shù)的初始步驟。在某些實施方式中，可以通過使用wbc裝置(hemocue,angelholm,sweden)獲得wbc計數(shù)。在一些實施方式中，將wbc計數(shù)用于確定每個載玻片鋪板統(tǒng)一加載量的有核細胞所需的血液量并用于計算回每個血容量的ctc等價量。

在一些實施方式中，本發(fā)明公開的方法包括裂解血液樣品中紅細胞的初始步驟。在一些實施方式中，例如，通過將氯化銨溶液加入到血液樣品中來裂解紅細胞。在某些實施方式中，在紅細胞裂解后對血液樣品進行離心，并將有核細胞在(例如)pbs溶液中再懸浮。

在一些實施方式中，將來自樣品(如血液樣品)的有核細胞作為單層沉積在平面載體上。平面支持物可以是任何材料，例如，任何無熒光材料(fluorescentlyclearmaterial)、任何有助于細胞附著的材料、任何有助于容易除去細胞碎片的材料、任何厚度<100μm的材料。在一些實施方式中，所述材料為薄膜。在一些實施方式中，所述材料是玻璃載玻片。在某些實施方式中，所述方法包括將來自血液樣品的有核細胞作為單層沉積在玻璃載玻片上的初始步驟?？梢酝扛膊Ａлd玻片以允許活細胞的最大保留(參見，例如，marrinuccid.etal.,2012,phys.biol.9016003)。在一些實施方式中，將約50萬、100萬、150萬、200萬、250萬、300萬、350萬、400萬、450萬或500萬的有核細胞沉積在玻璃載玻片上。在一些實施方式中，本發(fā)明公開的方法包括將約300萬的細胞沉積在玻璃載玻片上。在其他實施方式中，本發(fā)明公開的方法包括將約200萬至約300萬之間的細胞沉積在玻璃載玻片上。在一些實施方式中，在已完成本發(fā)明公開的方法之后，玻璃載玻片和固定化細胞樣品對于進一步處理或?qū)嶒炇强捎玫摹?/p>

在一些實施方式中，本發(fā)明公開的方法包括在未富集血液樣品中鑒別有核細胞的初始步驟。在一些實施方式中，用熒光染色鑒別有核細胞。在某些實施方式中，熒光染色包括核酸特異性染色。在某些實施方式中，熒光染色劑為二脒基-2-苯基吲哚(dapi)。在一些實施方式中，有核細胞的免疫熒光染色包括廣譜細胞角蛋白(pancytokeratin)、分化簇(cd)45和dapi。在本文進一步描述的一些實施方式中，ctc包括來自周圍有核細胞的不同的免疫熒光染色。在一些實施方式中，ctc不同的免疫熒光染色包括dapi(+)、ck(+)和cd45(-)。在一些實施方式中，ctc的鑒別還包括將廣譜細胞角蛋白熒光染色的強度與周圍有核細胞進行比較。在一些實施方式中，通過熒光掃描顯微術產(chǎn)生ctc數(shù)據(jù)以檢測血液樣品中有核細胞的免疫熒光染色。marrinuccid.etal.,2012,phys.biol.9016003。

在具體的實施方式中，保留了所有有核細胞并且用靶向細胞角蛋白(ck)的單克隆抗體免疫熒光染色，細胞角蛋白是僅存在于上皮細胞中的中間絲，pan白細胞特異性抗體靶向常見的白細胞抗原cd45和核染劑dapi。可以在多個熒光通道中對有核血細胞成像以產(chǎn)生保留了核輪廓和細胞漿分布的精細細胞學詳細信息的高質(zhì)量和高分辨率數(shù)字圖像。盡管可以用靶向cd45的pan白細胞特異性抗體鑒別周圍wbc，但是可以將ctc鑒別為dapi(+)、ck(+)和cd45(-)。在本文所述的方法中，ctc包括與周圍有核細胞不同的免疫熒光染色。

在其他實施方式中，所述ctc數(shù)據(jù)包括也稱為高分辨率ctc(hd-ctc)的常規(guī)ctc。常規(guī)ctc是ck陽性、cd45陰性的，其包含完整的dapi陽性核而無可鑒別的凋亡變化或破裂外形，并且在形態(tài)上不同于周圍白細胞(wbc)。如前所述，在hd-ctc計數(shù)期間，可以將dapi(+)、ck(+)和cd45(-)強度分類為可測量特征(圖1)。nievaetal.,physbiol9:016004(2012)。本文所公開的方法所使用的未富集直接分析導致了高靈敏度和高特異性，盡管已知增加高分辨率細胞形態(tài)使得能夠?qū)tc群體進行詳細的形態(tài)學表征是非均一的。

盡管可以將ctc鑒別為包含dapi(+)、ck(+)和cd45(-)細胞，但是可以通過本領域技術人員選擇用于產(chǎn)生ctc數(shù)據(jù)和/或鑒別ctc和ctc簇的任何其他生物標志物實踐本發(fā)明所述的方法。本領域技術人員知道如何選擇形態(tài)特征、生物分子或生物分子片段，其變化和/或檢測可以與ctc有關。分子生物標志物包括(但不限于)生物分子，其包括核苷酸、核酸、核苷、氨基酸、糖、脂肪酸、類固醇、代謝產(chǎn)物、肽、多肽、蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪、激素、抗體、用作生物大分子的替代物的感興趣區(qū)及其組合(例如，糖蛋白、核糖核蛋白、脂蛋白)。該術語還包括生物分子的部分或片段，例如，蛋白質(zhì)的肽片段或多肽。

本領域技術人員將理解一些方法可以用于產(chǎn)生ctc數(shù)據(jù)，其包括基于顯微術的方法，包括熒光掃描顯微術(參見，例如，marrinuccid.等人,2012,phys.biol.9016003)、質(zhì)譜分析法，如ms/ms、lc-ms/ms、多次反應監(jiān)控(mrm)或srm以及產(chǎn)物離子監(jiān)控(pim)并且還包括基于抗體的方法，如免疫熒光法、免疫組織化學、免疫測定，如免疫印跡、酶聯(lián)免疫吸附測定(elisa)、免疫沉淀、放射免疫測定、斑點印跡和facs。免疫測定技術和規(guī)程通常是本領域技術人員所知的(price和newman,principlesandpracticeofimmunoassay,第2版,grove’sdictionaries,1997；和gosling,immunoassays:apracticalapproach,oxforduniversitypress,2000)。可以使用多種免疫測定技術，包含競爭和非競爭免疫測定(selfetal.,curr.opin.biotechnol.,7:60-65(1996)，還參見johnr.crowther,theelisaguidebook,第1版,humanapress2000,isbn0896037282和anintroductiontoradioimmunoassayandrelatedtechniques,chardt(主編),elsevierscience1995,isbn0444821198)。

本領域技術人員將進一步理解可以使用本領域中已知的任何種類的標志物-特異性結合劑來檢測生物標志物的存在與否，其包括(例如)抗體、適體、融合蛋白，如包含蛋白質(zhì)受體或蛋白質(zhì)配體成分的融合蛋白，或生物標志物特異性小分子結合劑。在一些實施方式中，通過抗體確定ck或cd45的存在與否。

本發(fā)明公開的抗體特異性結合生物標志物?？梢允褂帽绢I域中已知的任何適合的方法制備抗體。參見，例如，coligan,currentprotocolsinimmunology(1991)；harlow&lane,antibodies:alaboratorymanual(1988)；goding,monoclonalantibodies:principlesandpractice(第2版，1986)。所述抗體可以是任何免疫球蛋白或其衍生物，無論是天然的或者完全或部分合成產(chǎn)生的。維持特異結合能力的它的所有的衍生物也包含在該術語中。所述抗體具有與免疫球蛋白結合域同源或基本同源的并且可以來源于天然來源或者部分或完全合成產(chǎn)生的結合域。所述抗體可以是單克隆抗體或多克隆抗體。在一些實施方式中，抗體是單鏈抗體。本領域那些技術人員將理解抗體可以以任何多種形式提供，其包括(例如)人源化、部分人源化、嵌合、嵌合人源化等。所述抗體可以是抗體片段，其包括(但不限于)fab、fab'、f(ab')2、scfv、fv、dsfv雙鏈抗體和fd片段?？梢酝ㄟ^任何方式產(chǎn)生抗體。例如，所述抗體可以通過完整抗體的碎片化來酶促或化學產(chǎn)生和/或它可以從編碼所述部分抗體序列的基因重組產(chǎn)生。所述抗體可以包括單鏈抗體片段。作為另外一種選擇或者另外，所述抗體可以包括(例如)通過二硫鍵連接在一起的多條鏈，和得自這些分子的任何功能性片段，其中這些片段保留了親本抗體分子的特異結合性質(zhì)。由于它們作為完整分子的功能性組分的較小尺寸，對于在某些免疫化學技術和實驗應用中的使用，抗體片段可以提供優(yōu)于完整抗體的優(yōu)勢。

當在本發(fā)明所述的方法中產(chǎn)生ctc數(shù)據(jù)時，可以在本文所述的方法中使用可檢測的標記物以用于生物標志物的直接或間接檢測?？梢允褂枚喾N可檢測的標記物，并基于所需的靈敏度、與抗體綴合的容易性、穩(wěn)定性要求和可用的儀器以及處理規(guī)定選擇標記物。本領域技術人員熟悉基于本發(fā)明所述的方法中生物標志物的測定檢測的適合的可檢測標記物的選擇。適合的可檢測標記物包括(但不限于)熒光染料(例如，熒光素、異硫氰酸熒光素(fitc)、oregongreen^tm、羅丹明、得克薩斯紅、四若丹明異硫氰酸酯(tetrarhodimineisothiocynate,tritc)、cy3、cy5、alexa647、alexa555、alexa488)、熒光標志物(例如，綠色熒光蛋白(gfp)、藻紅蛋白等)、酶(例如，熒光素酶、辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等)、納米顆粒、生物素、洋地黃毒苷(digoxigenin)、金屬等。

對于質(zhì)譜基分析，使用同位素試劑的差異標記，例如，同位素編碼的親合標簽(icat)或使用同量異序標記試劑的近期變化、itraq(appliedbiosystems,fostercity,calif.)然后進行多維液相色譜(lc)和串聯(lián)質(zhì)譜(ms/ms)分析可以在本發(fā)明公開所述的方法的實踐中提供其他方法。

使用化學發(fā)光抗體的化學發(fā)光測定可以用于蛋白質(zhì)的靈敏、非放射性檢測。用熒色物標記的抗體也可以是適合的。熒色物的實例無限制地包括dapi、熒光素、hoechst33258、r-藻青蛋白、b-藻紅蛋白、r-藻紅蛋白、羅丹明、得克薩斯紅和麗絲胺(lissamine)。間接標記物包括在本領域中熟知的多種酶，如辣根過氧化物酶(hrp)、堿性磷酸酶(ap)、β-半乳糖苷酶、尿酶等。使用適合于辣根-過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶的底物的檢測系統(tǒng)在本領域中是熟知的。

可以(例如)使用顯微鏡，如熒光顯微鏡或熒光掃描顯微鏡分析來自直接或間接標記物的信號。作為另外一種選擇，可以使用分光光度計檢測來自發(fā)色底物的顏色；使用輻射計數(shù)器來檢測輻射，如γ粒子計數(shù)器檢測¹²⁵i；或者在存在特定波長的光的情況下使用熒光計檢測熒光。如果需要，用于實踐本發(fā)明公開的方法的測定可以自動或機械化進行，并且可以同時檢測來自多個樣品的信號。

在一些實施方式中，生物標志物是免疫熒光標志物。在一些實施方式中，免疫熒光標志物包括對上皮細胞特異的標志物。在一些實施方式中，免疫熒光標志物包括對白細胞(wbc)特異的標志物。在一些實施方式中，一個或多個免疫熒光標志物包括cd45和ck。

在一些實施方式中，有核細胞，如ctc或wbc中免疫熒光標志物的存在與否導致了不同的免疫熒光染色圖案?；谠诟髯约毎袡z測何種上皮細胞或wbc標志物，ctc和wbc的免疫熒光染色圖案可以是不同的。在一些實施方式中，確定一個或多個免疫熒光標志物的存在與否包括使用(例如)明確鑒別wbc的cd45的免疫熒光染色，將ctc不同的免疫熒光染色與wbc不同的免疫熒光染色相比較。存在與wbc多個亞群結合的其他可檢測標志物或可檢測標志物的組合。這些可以在多種組合中使用，包括與cd45的免疫熒光染色組合或作為它的替代。

在一些實施方式中，ctc包括不同于周圍有核細胞的形態(tài)特征。在一些實施方式中，所述形態(tài)特征包括核尺寸、核形狀、細胞尺寸、細胞形狀和/或核質(zhì)比。在一些實施方式中，所述方法還包括通過核詳細情況、核輪廓、核的存在與否、細胞漿質(zhì)量、細胞漿數(shù)量、免疫熒光染色圖案的強度來分析有核細胞。本領域的技術人員將理解本發(fā)明公開的形態(tài)特征可以包括可以確定并且與ctc檢測有關的細胞的任何特征、性質(zhì)、特性或方面。

可以通過本領域中已知的任何顯微方法產(chǎn)生ctc數(shù)據(jù)。在一些實施方式中，通過熒光掃描顯微術實施所述方法。在某些實施方式中，顯微方法提供了ctc及其周圍wbc的高分辨率圖像(參見，例如，marrinuccid.etal.,2012,phys.biol.9016003)。在一些實施方式中，通過熒光掃描顯微鏡掃描用來自樣品，如未富集的血液樣品的有核細胞單層涂覆的載玻片，并且記錄來自免疫熒光標志物和核染色劑的熒光強度以允許確定每個免疫熒光標志物的存在與否并評價有核細胞的形態(tài)。在一些實施方式中，以自動化方式進行顯微數(shù)據(jù)的采集和分析。

在一些實施方式中，ctc數(shù)據(jù)包括檢測一個或多個生物標志物，例如，ck和cd45。如果在高于所使用的各個檢測方法的背景噪聲之上是可檢測的(例如，比背景高2-倍、3-倍、5-倍或10-倍；例如，在背景之上2σ或3σ)，則認為細胞中“存在”生物標志物。如果在高于所使用的檢測方法的背景噪聲之上是不可檢測的(例如，比背景信號高<1.5倍或<2.0倍；例如，在背景之上<1.5σ或<2.0σ)，則認為“不存在”生物標志物。

在一些實施方式中，通過在熒光掃描過程期間選擇暴露時間來確定有核細胞中免疫熒光標志物的存在與否，從而在視場中所有免疫熒光標志物對wbc實現(xiàn)了預設的熒光水平。在這些條件下，即使在wbc上不存在，ctc-特異性免疫熒光標志物在wbc中作為具有固定高度的背景信號是可見的。此外，在ctc上不存在的wbc-特異性免疫熒光標志物在ctc中作為具有固定高度的背景信號是可見的。如果其對于各個標志物的熒光信號顯著高于固定背景信號(例如，比背景高2-倍、3-倍、5-倍或10-倍；例如，在背景之上2σ或3σ)，則認為細胞對于免疫熒光標志物是陽性的(即認為存在標志物)。例如，如果對于cd45，其熒光信號顯著高于背景信號，則認為有核細胞是cd45陽性的(cd45+)。如果細胞對于各個標志物的熒光信號不顯著高于背景信號(例如，比背景信號高<1.5倍或<2.0倍；例如，在背景之上<1.5σ或<2.0σ)，則認為細胞對于免疫熒光標志物是陰性的(即認為不存在標志物)。

通常，每個顯微鏡視野含有ctc和wbc兩者。在某些實施方式中，顯微鏡視野顯示至少1、5、10、20、50或100個ctc。在某些實施方式中，顯微鏡視野顯示比ctc多至少10、25、50、100、250、500或1000倍的wbc。在某些實施方式中，顯微鏡視野包含被至少10、50、100、150、200、250、500、1000或更多個wbc圍繞的一個或多個ctc或ctc簇。

在本文所述方法的一些實施方式中，ctc數(shù)據(jù)的產(chǎn)生包括存在于血液樣品中的ctc的計數(shù)。在一些實施方式中，本文所述的方法包括至少1.0個ctc/ml血液、1.5個ctc/ml血液、2.0個ctc/ml血液、2.5個ctc/ml血液、3.0個ctc/ml血液、3.5個ctc/ml血液、4.0個ctc/ml血液、4.5個ctc/ml血液、5.0個ctc/ml血液、5.5個ctc/ml血液、6.0個ctc/ml血液、6.5個ctc/ml血液、7.0個ctc/ml血液、7.5個ctc/ml血液、8.0個ctc/ml血液、8.5個ctc/ml血液、9.0個ctc/ml血液、9.5個ctc/ml血液、10個ctc/ml血液或以上的檢測。

在本文所述方法的一些實施方式中，ctc數(shù)據(jù)的產(chǎn)生包括檢測不同的ctc子類型，包括非常規(guī)ctc。在一些實施方式中，本文所述的方法涵蓋了至少0.1個ctc簇/ml血液、0.2個ctc簇/ml血液、0.3個ctc簇/ml血液、0.4個ctc簇/ml血液、0.5個ctc簇/ml血液、0.6個ctc簇/ml血液、0.7個ctc簇/ml血液、0.8個ctc簇/ml血液、0.9個ctc簇/ml血液、1個ctc簇/ml血液、2個ctc簇/ml血液、3個ctc簇/ml血液、4個ctc簇/ml血液、5個ctc簇/ml血液、6個ctc簇/ml血液、7個ctc簇/ml血液、8個ctc簇/ml血液、9個ctc簇/ml血液、10個ctc簇/ml血液或以上的檢測。在具體的實施方式中，本文所述的方法涵蓋了至少1個ctc簇/ml血液的檢測。

在一些實施方式中，所公開的用于預期鑒別mcrpc患者中ar靶向療法的新生抵抗性的方法涵蓋了預測模型的使用。在其他實施方式中，所公開的用于預期鑒別mcrpc患者中ar靶向療法的新生抵抗性的方法涵蓋將可測量特征與參考特征相比較。如本領域技術人員可以理解的，這種比較可以是與參考特征的直接比較或者是其中已將參考特征引入預測模型的間接比較。在其他實施方式中，分析可測量特征來預期鑒別mcrpc患者中ar靶向療法的新生抵抗性包括以下中的一種或多種：線性差別分析模型、支持向量機分類算法、回歸特征消去模型、微陣列預測分析模型、邏輯回歸模型、cart算法、flextree算法、lart算法、隨機森林算法、mart算法、機器學習算法、懲罰回歸方法及其組合。在具體的實施方式中，所述分析包括邏輯回歸。在其他實施方式中，mcrpc患者中ar靶向療法的新生抵抗性的鑒別表示為風險得分。

分析分類法可以使用多種統(tǒng)計分析方法中的任一種以調(diào)控定量數(shù)據(jù)并為樣品分類做準備。有用的方法的實例包括線性差別分析、回歸特征消去、微陣列預測分析、邏輯回歸、cart算法、flextree算法、lart算法、隨機森林算法、mart算法、機器學習算法以及本領域技術人員所知的其他方法。

可以根據(jù)設置確定樣品屬于給定分類的概率的閾值的預測模型方法來進行分類。所述概率優(yōu)選地為至少50％，或至少60％，或至少70％，或至少80％，或至少90％或更高。還可以通過確定所獲得的數(shù)據(jù)集和參考數(shù)據(jù)集之間的比較是否產(chǎn)生統(tǒng)計學顯著差異來進行分類。如果產(chǎn)生，則將獲得該數(shù)據(jù)集的樣品分為不屬于參考數(shù)據(jù)集類。相反地，如果該比較不統(tǒng)計學顯著地不同于參考數(shù)據(jù)集，則將獲得該數(shù)據(jù)集的樣品分為屬于參考數(shù)據(jù)集類。

可以根據(jù)提供具體值或數(shù)值范圍的質(zhì)量度量，例如，auroc(roc曲線下面積)或準確度來評價模型的預測能力。曲線下面積量度對于比較整個數(shù)據(jù)范圍內(nèi)分類器的精確性是有用的。具有較大auc的分類器將具有較大的將未知在兩關心組之間正確分類的能力。在多種臨床情況下，roc分析可以用于選擇最佳閾值，從而平衡了特異性和靈敏度之間存在的固有折衷方案。在一些實施方式中，所期望的質(zhì)量閾值為將樣品以至少約0.7、至少約0.75、至少約0.8、至少約0.85、至少約0.9、至少約0.95或更高的準確度分類的預測模型。作為替代量度，所需質(zhì)量閾值可以表示至少約0.7、至少約0.75、至少約0.8、至少約0.85、至少約0.9或更高的auc將樣品分類的預測模型。

如本領域中已知的，可以調(diào)整預測模型的相對靈敏度和特異性以有利于特異性度量或靈敏度度量，其中兩種度量具有反比關系。根據(jù)所進行的測試的具體要求，可以調(diào)整上述模型中的限度以提供選擇的靈敏度或特異性水平。靈敏度和特異性中的一者或二者可以為至少約0.7、至少約0.75、至少約0.8、至少約0.85、至少約0.9或更高。

開始，可以通過測量每個可測量特征或生物標志物的值來分析原始數(shù)據(jù)，通常重復三次或多次重復三次。可以調(diào)控數(shù)據(jù)，例如，可以使用標準曲線轉化原始數(shù)據(jù)，并使用三次測量的平均值來計算每位患者的平均值和標準偏差?？梢栽谀Ｐ椭惺褂们稗D化這些值，例如，log-轉化，box-cox轉化(box和cox,royalstat.soc.,seriesb,26:211-246(1964))。然后，將數(shù)據(jù)輸入到預測模型中，所述模型將根據(jù)狀況對樣品分類?？梢詫⑺眯畔鬟_給患者或保健供應商。

在一些實施方式中，本文所公開的用于預期鑒別mcrpc患者中對ar靶向療法的新生抵抗性的方法具有>60％、>70％、>80％、>90％或更高的特異性。在其他實施方式中，用于預期鑒別mcrpc患者中對ar靶向療法的新生抵抗性的方法在分類閾值為7.5個ctc/ml血液時具有>90％的特異性。

如本領域技術人員將理解的，分析分類法可以使用多種統(tǒng)計分析方法中的任一種以調(diào)控定量數(shù)據(jù)并為樣品分類做準備。有用的方法的實例無限制地包括線性差別分析、回歸特征消去、微陣列預測分析、邏輯回歸、cart算法、flextree算法、lart算法、隨機森林算法、mart算法和機器學習算法。

根據(jù)上述說明，顯而易見的是可以對本文所述的本發(fā)明做出改變和變化以使其適合于多種用途和條件。這些實施方式也在以下權利要求的范圍內(nèi)。

在本文中，對變量的任何定義中的元素列表的列舉包括該變量作為任何單個元素或所列元素組合(或子組合)的定義。在本文中，對實施方式的列舉包括作為任何單個實施方式或者與任何其他實施方式或其部分組合的實施方式。

在本說明書中提及的所有專利和專利公開以每個單獨的專利和專利公開具體并且單獨表明作為參考并入本文的相同程度作為參考并入本文。

通過非限制性說明提供了以下實施例。

實施例

實施例1.轉移性去勢抵抗性前列腺癌(mcrpc)患者中通過循環(huán)腫瘤細胞(ctc)分析的雄激素靶向治療(artx)的新生抵抗性的特征

本實施例顯示與對ar靶向療法起反應的患者相比，對ar靶向療法不起反應的患者顯示出ctc亞群更大的異質(zhì)性。

如先前所報告的，使用epicsciences平臺對ctc進行樣本評價。marrinuccietal.physbiol9:016003,2012。圖2顯示了epic的ctc采集和檢測過程的示意圖，其如下所示進行：(1)血液裂解，將來自血液樣品的有核細胞置于載玻片上；(2)將載玻片保存在-80℃生物儲備庫中；(3)用ck、cd45、dapi和ar對載玻片染色；(4)掃描載玻片；(5)運行多參數(shù)數(shù)字病理算法，和(6)ctc的軟件和人讀取器確認和生物標志物表達的定量。在用乙酸阿比特龍+潑尼松(a)、恩雜魯胺(e)或紫杉烷(t)治療前，立即從mcrpc患者采集85份血液樣品，并檢驗總ctc、特異性ctc亞群和ctcar蛋白表達。結果與通過psa變化測量的對ar信號指導的療法的反應模式有關(圖1)。根據(jù)圖1，將使用a、e或t的患者分為：起反應者(n＝39)，其包括：真正應答(n＝15)、獲得性抵抗(n＝24)。無應答者(n＝46)：新生抵抗性。

圖1-圖7和圖15描述了其他實驗細節(jié)。

血液樣品經(jīng)歷溶血、離心、再懸浮和鋪板到載玻片上，然后在-80℃儲存。在分析之前，將載玻片融化，通過免疫熒光標記(廣譜細胞角蛋白、cd45、dapi和ar)并通過自動熒光檢查法成像，然后通過經(jīng)病理學訓練的技術人員(msl)進行手動驗證。marrinuccietal.physbiol9:016003,2012。如前所述，在hd-ctc計數(shù)期間，根據(jù)特征將dapi(+)、ck(+)和cd45(-)強度分類。

本實施例中描述的研究顯示，ar療法或紫杉烷結果之間患者血液的ctc數(shù)目/7.5ml或者非常規(guī)ctc數(shù)目/7.5ml無顯著性差異。因此，ctc/7.5ml或非常規(guī)ctc/7.5ml頻率不能預測阿比特龍、恩雜魯胺或紫杉烷抵抗性。

本研究還顯示通過下列的單細胞ctc測量，根據(jù)基線血液，對阿比特龍或恩雜魯胺的敏感性是可獲得的：

1.ctc異質(zhì)性

2.具有明顯核仁形態(tài)的細胞角蛋白陽性、arn-末端陽性ctc的頻率

3.arc-末端缺失

本實施例中所述的研究表明對阿比特龍和恩雜魯胺抵抗疾病的敏感性ctc譜不能預測對紫杉烷療法的敏感性，從而確認所公開的方法使得能夠基于本文所述的預測特征進行治療選擇。

本研究還顯示與對ar靶向療法起反應的患者相比，對ar靶向療法不起反應的患者顯示出ctc亞群更大的異質(zhì)性。

本研究還顯示可以使用測量ctc亞群異質(zhì)性的單個ctc鑒定來預測對ar靶向療法的抵抗性。

本研究還證明可以使用ctc的上皮細胞表達、雄激素n-末端染色和形態(tài)學評價來預測對ar靶向療法的反應。

本研究還顯示盡管對ar療法抵抗性的特征與對紫杉烷的抵抗性不相關，但是可以實現(xiàn)對ar療法抵抗性和紫杉烷反應的特征的優(yōu)化。

實施例2.一線、二線和三線全身療法中轉移性去勢抵抗性前列腺癌(mcrpc)患者中循環(huán)腫瘤細胞(ctc)的鑒定

新批準的雄激素信號指導療法(ar療法)，包括乙酸阿比特龍+潑尼松(a)和恩雜魯胺(e)延長mcrpc患者(pts)的存活。本實施例顯示順序使用時，對在a之后施用的e的反應歷時較短且不太頻繁。更可能受益于新型特異性療法的靶向患者對開發(fā)更有效的治療是必需的。本實施例還顯示了接受用于mcrpc的一線、二線和三線全身療法的pts中ctc表型的發(fā)展以及ar表達和ar定位。

如先前所報告的，使用epicsciences平臺對ctc進行樣本評價。marrinuccietal.physbiol9:016003,2012。圖2顯示了epic的ctc采集和檢測過程的示意圖，其如下所示進行：(1)血液裂解，將來自血液樣品的有核細胞置于載玻片上；(2)將載玻片保存在-80℃生物儲備庫中；(3)用ck、cd45、dapi和ar對載玻片染色；(4)掃描載玻片；(5)運行多參數(shù)數(shù)字病理算法，和(6)ctc的軟件和人工讀取器確認和生物標志物表達的定量分析。使用epicsciences平臺，從112位獨特患者(58位患者先前無治療，33位患者先前1次治療失敗，27位患者先前2+次治療失敗)中采集117份血液樣品用于ctc分析。epic分析包括如下所述的ctc子類型鑒別：另外，評價ctcar表達、ar亞細胞定位和所觀察的細胞形態(tài)(尺寸、核、ck斑點)。在代表具體臨床編組的處理組(未經(jīng)治療、一線治療失敗或一線和二線治療均失敗)和亞組之間比較來自所有患者樣品的ctc和患者數(shù)據(jù)。

圖8-圖14和圖16描述了其他實驗細節(jié)。

本實施例中所述的研究顯示隨著所施用的全身療法數(shù)目的增加，常規(guī)和非常規(guī)ctc的整體數(shù)目增加。(未經(jīng)治療、一線療法失敗或一線和二線療法失敗)。

結果還顯示在所研究的每個治療決策點，ctc、ctc子類型型和ctc表型的數(shù)目劇烈變化。(未經(jīng)治療、一線療法失敗或一線和二線療法失敗)。

結果還顯示非常規(guī)ctc亞群的異質(zhì)性隨著一線、二線或三線全身療法而升高。(未經(jīng)治療、一線療法失敗或一線和二線療法失敗)。

結果還顯示隨著連續(xù)療法的提供，觀察到更獨特的ctc表型：(a)增加的ctc表型包括：核ctc、ctc簇、ck-ctc、ck斑點型ctc、小ctc、ar核仁ctc、ar細胞質(zhì)ctc。表型的增加與更異質(zhì)的腫瘤一致。結果還表明追蹤表型發(fā)展和指導表型鑒定使得本文所公開的方法能夠更有效地進行治療管理。

結果還顯示隨著所施用的全身療法的數(shù)目的增加，具有與新生抵抗性有關的ctc表型的患者的百分比增加。

結果還顯示在a或e之后，ar核ctc發(fā)生率的提高可以鑒別具有組成活性的雄激素信號的患者。

在本文中，對變量的任何定義中的元素列表的列舉包括該變量作為任何單個元素或所列元素組合(或子組合)的定義。在本文中，對實施方式的列舉包括作為任意單個實施方式或者與任意其他實施方式或其部分組合的實施方式。

在本說明書中提及的所有專利和專利公開以每個單獨的專利和專利公開具體并且以單獨表明作為參考并入本文的相同程度作為參考并入本文。