本發(fā)明屬于藥品食品安全及家蠶養(yǎng)殖領(lǐng)域，尤其涉及一種檢測受污染桑葉毒性和安全性的方法。
背景技術(shù)：
桑樹是多年生木本植物，桑葉營養(yǎng)豐富，干物質(zhì)中約含粗蛋白24％-28％、總糖23％-26％、粗脂肪3.5％-6.0％，富含食物纖維、氨基酸、維生素和多種動物和人體必須的微量元素，含生物堿、黃酮等活性成分。桑葉是家蠶的唯一植物飼料，是蠶繭生產(chǎn)的基礎(chǔ)；桑葉也可作為禽畜動物飼料。衛(wèi)生部將桑葉列為既是食品又是藥品。桑葉是中藥材，含1-脫氧野尻霉素(DNJ)等生物堿、黃酮等活性成分，有降血糖、降血脂和降血壓等藥效。桑葉可制作桑葉菜，具有清香、鮮脆、色澤碧綠的特點，是具有較高營養(yǎng)價值和保健功能的綠色蔬菜；桑葉可制作桑葉茶，茶湯清澈明亮，清香甘甜，鮮醇爽口，對降血糖、消瘡祛斑、減肥清脂、降低血粘有一定效果；桑葉粉還可制作桑葉面條、桑葉餅等，作為糖尿病等特殊人群的食品。
桑園及附近農(nóng)作物使用化學(xué)農(nóng)藥，會使桑葉受污染而含有農(nóng)藥殘毒；白僵菌農(nóng)藥、蘇云金桿菌農(nóng)藥、核型多角體病毒等昆蟲病原菌(真菌、細(xì)菌、病毒)制劑等生物農(nóng)藥，桑粉虱、桑螟等桑園害蟲會發(fā)生家蠶同樣的病，患病昆蟲尸體、排泄物、鱗毛等污染桑葉，均會成為蠶病暴發(fā)的傳染來源；桑葉受病原真菌為害，使桑葉受真菌污染，有的真菌及其次生產(chǎn)物含有真菌毒素；工廠廢氣污染大氣，硫化物、氟化物等被桑葉吸附累積，使桑葉受到毒物污染，給桑葉利用帶來不安全因素。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種簡便快速、結(jié)果可靠、綜合全面、靈敏準(zhǔn)確的檢測受污染桑葉毒性和安全性的方法，適用于受污染桑葉作為飼料對家蠶健康危害和養(yǎng)殖風(fēng)險評估。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
檢測受污染桑葉毒性和安全性的方法，通過桑葉養(yǎng)蠶試驗，利用測試桑葉飼養(yǎng)健康家蠶幼蟲，根據(jù)蠶的行動、體態(tài)、食桑、排便、吐絲、化蛹、化蛾、交配、產(chǎn)卵、皮膚、生長發(fā)育方面差異，以及死亡率、幼蟲成蛹率、幼蟲成蛾率、正常產(chǎn)卵蛾率、良卵率指標(biāo)，測試一般毒性、神經(jīng)毒性、器官毒性、發(fā)育毒性、生殖毒性及病原微生物致病性。
上述檢測受污染桑葉毒性和安全性的方法，包括以下步驟：
(1)準(zhǔn)備健康的試驗蠶；(2)采摘測試桑葉分區(qū)養(yǎng)蠶；(3)調(diào)查觀察蠶的健康狀況；
(4)一般毒性測試；(5)神經(jīng)毒性測試；(6)器官毒性測試；(7)發(fā)育毒性測試；
(8)生殖毒性測試；(9)病原微生物致病性測試；(10)測試桑葉作為家蠶飼料的安全性綜合評價。
步驟(1)按以下操作進(jìn)行：選用合格蠶種，按常規(guī)養(yǎng)蠶操作與消毒防病措施，對所用試驗蠶室和用具進(jìn)行消毒、蠶種催青、小蠶飼養(yǎng)；1齡～2齡小蠶用正常桑葉飼養(yǎng)，飼育溫度27℃-28℃，相對濕度85％-90％、長日照；用2齡～4齡任一齡起蠶作為受試蠶，設(shè)置處理區(qū)，包括測試桑葉飼養(yǎng)區(qū)、正常桑葉飼養(yǎng)區(qū)，每處理區(qū)三重復(fù)小區(qū)，每小區(qū)供試蠶為同頭數(shù)20頭以上。
步驟(2)按以下操作進(jìn)行：采摘指定的測試桑葉和正常桑葉用于相應(yīng)的處理區(qū)中試驗蠶的飼養(yǎng)；按同樣環(huán)境條件和養(yǎng)蠶操作，溫度25℃-27℃，相對濕度75％-85％、自然光照，飼養(yǎng)至上蔟結(jié)繭。
步驟(3)按以下操作進(jìn)行：觀察比較測試桑葉飼養(yǎng)區(qū)與正常桑葉飼養(yǎng)區(qū)蠶兒在體態(tài)、行動、食桑、排便、蛻皮、吐絲、化蛹、化蛾、交配、產(chǎn)卵、皮膚、肛門方面的差別，調(diào)查統(tǒng)計死亡率、健蛹率、結(jié)繭率、幼蟲成蛹率、幼蟲成蛾率、正常產(chǎn)卵蛾率、良卵率指標(biāo)。
步驟(4)至(7)按以下操作進(jìn)行：
(4)一般毒性測試
出現(xiàn)吐液、拒食、體縮、擺頭、身體扭曲、呆伏不動、喂葉無反應(yīng)或死亡癥狀的，且死亡率測試桑葉飼養(yǎng)區(qū)顯著高于對照區(qū)的，或健蠶率、幼蟲成蛹率測試桑葉飼養(yǎng)區(qū)顯著低于對照區(qū)的，診斷所測試桑葉有一般毒性；
(5)神經(jīng)毒性測試
出現(xiàn)狂燥、亂爬、吐亂絲、旋蛹行為等神經(jīng)異常癥狀，且死亡率測試桑葉飼養(yǎng)區(qū)顯著高于對照區(qū)的，或健蠶率、幼蟲成蛹率、幼蟲成蛾率測試桑葉飼養(yǎng)區(qū)顯著低于對照區(qū)的，診斷所測試桑葉有神經(jīng)毒性；
(6)器官毒性測試
體壁出現(xiàn)灰黑色斑或燒焦?fàn)畎?、不脫皮蠶、半脫皮蠶、半脫皮蛹體壁損傷；中腸或肛門損傷而出現(xiàn)脫肛、排稀糞、念珠糞等異常，為器官損傷的表現(xiàn)；出現(xiàn)器官損傷癥狀，且死亡率測試桑葉飼養(yǎng)區(qū)顯著高于對照區(qū)的，或健蠶率、幼蟲成蛹率、幼蟲成蛾率測試桑葉飼養(yǎng)區(qū)顯著低于對照區(qū)的，診斷所測試桑葉有器官毒性
(7)發(fā)育毒性測試
出現(xiàn)不眠蠶、不脫皮蠶及不結(jié)繭、不化蛹、不羽化、不產(chǎn)卵等發(fā)育異常，且死亡率測試桑葉飼養(yǎng)區(qū)顯著高于對照區(qū)的，或健蠶率、幼蟲成蛹率、幼蟲成蛾率測試桑葉飼養(yǎng)區(qū)顯著低于對照區(qū)的，診斷所測試桑葉有發(fā)育毒性。
步驟(8)生殖毒性測試，按以下操作進(jìn)行：
(8.1)結(jié)繭后常規(guī)保護(hù)至蠶蛹羽化，化蛾當(dāng)天早上同試驗小區(qū)雌蛾與雄蛾交配，交配時間5h-6h，拆對后振動雌蛾排尿，投入產(chǎn)卵紙袋內(nèi)單蛾產(chǎn)卵制種，次日上午8：00殺蛾終止產(chǎn)卵，蠶種常規(guī)保護(hù)7天至蠶卵成固定色；
(8.2)調(diào)查不產(chǎn)卵蛾、少產(chǎn)卵蛾、受精異常蛾非正常產(chǎn)卵蛾的數(shù)量，計算非正常產(chǎn)卵蛾率；調(diào)查正常產(chǎn)卵蛾的單蛾產(chǎn)卵數(shù)和良卵數(shù)，計算良卵率；
(8.3)非正常產(chǎn)卵蛾率，測試桑葉飼養(yǎng)區(qū)顯著高于對照區(qū)的；或良卵率，測試桑葉飼養(yǎng)區(qū)顯著低于對照區(qū)的的，診斷所測試桑葉有生殖毒性。
步驟(9)病原微生物致病性測試，按以下操作進(jìn)行：
(9.1)測試桑葉飼養(yǎng)區(qū)與對照區(qū)分室隔離飼養(yǎng)，分別由不同飼養(yǎng)員采葉飼養(yǎng)，防止交叉?zhèn)魅拘Q?。?/p>
(9.2)每4h～6h觀察一次，發(fā)現(xiàn)有病蠶、死蠶及時拾到另外的飼養(yǎng)框隔離，防止二次感染；
(9.3)對病蠶、死蠶進(jìn)行傳染性蠶病種類的診斷，統(tǒng)計記錄各類蠶病的病死頭數(shù)，統(tǒng)計各類蠶病的發(fā)病率；
(9.4)出現(xiàn)某蠶病癥狀，且發(fā)病率測試桑葉飼養(yǎng)區(qū)顯著高于對照區(qū)的，診斷所測試桑葉有病原微生物致病性。
步驟(10)測試桑葉作為家蠶飼料的安全性綜合評價，按以下操作進(jìn)行：
(10.1)經(jīng)測試一般毒性、神經(jīng)毒性、器官毒性、發(fā)育毒性、病原微生物致病性，如沒有1項有毒性，則測試桑葉用于養(yǎng)蠶產(chǎn)繭是安全的；如有1項或多項有毒性，則測試桑葉用于養(yǎng)蠶產(chǎn)繭是不安全的；
(10.2)經(jīng)測試一般毒性、神經(jīng)毒性、器官毒性、發(fā)育毒性、病原微生物致病性、生殖毒性，如沒有1項有毒性，則測試桑葉用于種繭育養(yǎng)蠶和制種是安全的；如有1項或多項有毒性，則測試桑葉用于種繭育養(yǎng)蠶和制種是不安全的。
針對利用受污染桑葉存在的安全性問題，發(fā)明人建立了一種檢測受污染桑葉毒性和安全性的方法，通過桑葉養(yǎng)蠶試驗，利用測試桑葉飼養(yǎng)健康家蠶幼蟲，根據(jù)蠶的行動、體態(tài)、食桑、排便、吐絲、化蛹、化蛾、交配、產(chǎn)卵、皮膚、生長發(fā)育方面差異，以及死亡率、幼蟲成蛹率、幼蟲成蛾率、正常產(chǎn)卵蛾率、良卵率指標(biāo)，測試一般毒性、神經(jīng)毒性、器官毒性、發(fā)育毒性、生殖毒性及病原微生物致病性。與一般的檢測方法相比，本發(fā)明更為簡便快速、結(jié)果可靠、綜合全面、靈敏準(zhǔn)確，具有較高的實用價值。應(yīng)用本發(fā)明獲得的毒性和安全性評價結(jié)果，可供桑葉作為禽畜飼料安全性評價參考，和供桑葉作為食用、藥用品的安全性評價參考，用于受污染桑葉作為飼料對家蠶健康危害和養(yǎng)殖風(fēng)險評估。因此，本發(fā)明利用桑葉養(yǎng)蠶生物試驗，測定毒性和評價安全性，技術(shù)路線可行，應(yīng)用前景廣闊。
具體實施方式
一、本發(fā)明檢測受污染桑葉毒性和安全性的方法的基本步驟和操作方法
(1)準(zhǔn)備健康的試驗蠶
選用當(dāng)?shù)赝茝V應(yīng)用的合格蠶種，按常規(guī)養(yǎng)蠶操作與消毒防病措施，對所用試驗蠶室和用具進(jìn)行消毒、蠶種催青、小蠶飼養(yǎng)；1齡～2齡小蠶用正常桑葉飼養(yǎng)，飼育溫度27℃-28℃，相對濕度85％-90％、長日照(每天光照時間16h)；用2齡～4齡任一齡起蠶作為受試蠶，設(shè)置處理區(qū)，包括測試桑葉飼養(yǎng)區(qū)、正常桑葉飼養(yǎng)區(qū)(對照區(qū))，每處理區(qū)三重復(fù)小區(qū)，每小區(qū)供試蠶為同等頭數(shù)20頭以上。
(2)采摘測試桑葉分區(qū)養(yǎng)蠶
采摘指定的測試桑葉和正常桑葉(對照)用于相應(yīng)的處理區(qū)中試驗蠶的飼養(yǎng)；按同樣環(huán)境條件和養(yǎng)蠶操作，溫度25℃-27℃，相對濕度75％-85％、自然光照，飼養(yǎng)至上蔟結(jié)繭。(3)調(diào)查觀察蠶的健康狀況
觀察比較測試桑葉飼養(yǎng)區(qū)與正常桑葉飼養(yǎng)區(qū)蠶兒在體態(tài)、行動、食桑、排便、蛻皮、吐絲、化蛹、化蛾、交配、產(chǎn)卵、皮膚、肛門等方面的差別，調(diào)查統(tǒng)計死亡率、健蛹率、結(jié)繭率、幼蟲成蛹率、幼蟲成蛾率、正常產(chǎn)卵蛾率、良卵率等指標(biāo)。
(4)一般毒性測試
出現(xiàn)吐液、拒食、體縮、擺頭、身體扭曲、呆伏不動、喂葉無反應(yīng)或死亡癥狀的，且死亡率測試桑葉飼養(yǎng)區(qū)顯著高于對照區(qū)的(p＜0.05)，或健蠶率、幼蟲成蛹率測試桑葉飼養(yǎng)區(qū)顯著低于對照區(qū)的(p＜0.05)，診斷所測試桑葉有一般毒性；
(5)神經(jīng)毒性測試
出現(xiàn)狂燥、亂爬、吐亂絲、旋蛹等行為的神經(jīng)異常癥狀，且死亡率測試桑葉飼養(yǎng)區(qū)顯著高于對照區(qū)的(p＜0.05)，或健蠶率、幼蟲成蛹率、幼蟲成蛾率測試桑葉飼養(yǎng)區(qū)顯著低于對照區(qū)的(p＜0.05)，診斷所測試桑葉有神經(jīng)毒性；
(6)器官毒性測試
體壁出現(xiàn)灰黑色斑或燒焦?fàn)畎?、不脫皮蠶、半脫皮蠶、半脫皮蛹等體壁損傷；中腸或肛門損傷而出現(xiàn)脫肛、排稀糞、念珠糞等異常，為器官損傷的表現(xiàn)；出現(xiàn)器官損傷癥狀，且死亡率測試桑葉飼養(yǎng)區(qū)顯著高于對照區(qū)的(p＜0.05)，或健蠶率、幼蟲成蛹率、幼蟲成蛾率測試桑葉飼養(yǎng)區(qū)顯著低于對照區(qū)的(p＜0.05)，診斷所測試桑葉有器官毒性
(7)發(fā)育毒性測試
出現(xiàn)不眠蠶、不脫皮蠶及不結(jié)繭、不化蛹、不羽化、不產(chǎn)卵等發(fā)育異常，且死亡率測試桑葉飼養(yǎng)區(qū)顯著高于對照區(qū)的(p＜0.05)，或健蠶率、幼蟲成蛹率、幼蟲成蛾率測試桑葉飼養(yǎng)區(qū)顯著低于對照區(qū)的(p＜0.05)，診斷所測試桑葉有發(fā)育毒性。
(8)生殖毒性測試
(8.1)結(jié)繭后常規(guī)保護(hù)至蠶蛹羽化，化蛾當(dāng)天早上同試驗小區(qū)雌蛾與雄蛾交配，交配時間5h-6h，拆對后振動雌蛾排尿，投入產(chǎn)卵紙袋內(nèi)單蛾產(chǎn)卵制種，次日上午8：00殺蛾終止產(chǎn)卵，蠶種常規(guī)保護(hù)7天至蠶卵成固定色；
(8.2)調(diào)查不產(chǎn)卵蛾、少產(chǎn)卵蛾(產(chǎn)卵數(shù)少于120粒的蠶蛾或少于該品種正常產(chǎn)卵數(shù)30％的蠶蛾)、受精異常蛾(所產(chǎn)蠶卵80％以上是不受精卵等)等非正常產(chǎn)卵蛾的數(shù)量，計算非正常產(chǎn)卵蛾率(即非正常產(chǎn)卵蛾數(shù)占總參試雌蛾數(shù)的比率)；調(diào)查正常產(chǎn)卵蛾的單蛾產(chǎn)卵數(shù)和良卵數(shù)，計算良卵率；
(8.3)非正常產(chǎn)卵蛾率，測試桑葉飼養(yǎng)區(qū)顯著高于對照區(qū)的(p＜0.05)；或良卵率，測試桑葉飼養(yǎng)區(qū)顯著低于對照區(qū)的(p＜0.05)的，診斷所測試桑葉有生殖毒性。
(9)病原微生物致病性測試
(9.1)測試桑葉飼養(yǎng)區(qū)與對照區(qū)分室隔離飼養(yǎng)，分別由不同飼養(yǎng)員采葉飼養(yǎng)，防止交叉?zhèn)魅拘Q?。?/p>
(9.2)每4h～6h觀察一次，發(fā)現(xiàn)有病蠶、死蠶及時拾到另外的飼養(yǎng)框(盤)隔離，防止二次感染；
(9.3)對病蠶、死蠶進(jìn)行傳染性蠶病種類的診斷，統(tǒng)計記錄各類蠶病的病死頭數(shù)，統(tǒng)計各類蠶病的發(fā)病率；
(9.4)出現(xiàn)某蠶病癥狀，且發(fā)病率測試桑葉飼養(yǎng)區(qū)顯著高于對照區(qū)的(p＜0.05)，診斷所測試桑葉有病原微生物致病性。
(10)測試桑葉作為家蠶飼料的安全性綜合評價
(10.1)經(jīng)測試一般毒性、神經(jīng)毒性、器官毒性、發(fā)育毒性、病原微生物致病性，如沒有1項有毒性，則測試桑葉用于養(yǎng)蠶產(chǎn)繭是安全的；如有1項或多項有毒性，則測試桑葉用于養(yǎng)蠶產(chǎn)繭是不安全的；
(10.2)經(jīng)測試一般毒性、神經(jīng)毒性、器官毒性、發(fā)育毒性、病原微生物致病性、生殖毒性，如沒有1項有毒性，則測試桑葉用于種繭育養(yǎng)蠶和制種是安全的；如有1項或多項有毒性，則測試桑葉用于種繭育養(yǎng)蠶和制種是不安全的。
二、本發(fā)明檢測受污染桑葉毒性和安全性的方法的應(yīng)用實例
以下各例基本步驟和操作方法參考一進(jìn)行。
應(yīng)用例1帶毒復(fù)混肥施用桑園的桑葉的毒性和安全性評價
某養(yǎng)蠶村新推某品牌復(fù)混肥(簡稱A肥料)，A肥料為合格產(chǎn)品，有“肥料登記證”、“生產(chǎn)許可證”、“產(chǎn)品合格證”等證件，肥料廠宣傳A肥料營養(yǎng)齊全、肥效穩(wěn)定，增產(chǎn)明顯，抗蟲力強(qiáng)。上半年5月中旬該村50％桑園施用該肥料。該村5月下旬至7月下旬飼養(yǎng)的3批蠶，部分養(yǎng)蠶戶的蠶發(fā)生中毒，生產(chǎn)受到損失。養(yǎng)蠶戶懷疑A肥料可能是藥肥，肥料中可能含有毒物(殺蟲劑)，施到桑園使桑葉污染帶毒。但肥料廠否認(rèn)A肥料含有毒物。抽樣A肥料進(jìn)行農(nóng)藥殘留檢測，沒有檢出常用農(nóng)藥成分。
該村桑園7月下旬全部夏伐，統(tǒng)一在距地面10cm～20cm處剪伐，并進(jìn)行桑園除草、清園和施肥，停止使用A肥料。
材料與方法：為測試下半年桑葉是否有毒，9月中下旬對該村3地塊桑園的桑葉測試毒性。3地塊桑園代號為：A1桑園、A2桑園、CK桑園。其中，A1桑園、A2桑園上半年使用A肥料，發(fā)生過養(yǎng)蠶中毒；CK桑園上半年沒有使用A肥料，養(yǎng)蠶沒有出現(xiàn)中毒現(xiàn)象。設(shè)置處理區(qū)：A1桑園桑葉飼養(yǎng)區(qū)、A2桑園桑葉飼養(yǎng)區(qū)、CK桑園桑葉飼養(yǎng)區(qū)，每處理區(qū)養(yǎng)蠶3小區(qū)(即重復(fù)3區(qū))，每個小區(qū)50頭蠶。供試蠶為：家蠶“7532”品種的原蠶3齡起蠶，蠶室溫度25℃-27℃，相對溫度75％-85％，自然光照。連續(xù)用測試桑葉飼養(yǎng)13天至五齡熟蠶期，分小區(qū)上蔟結(jié)繭，調(diào)查記錄各齡期死亡頭數(shù)，上蔟后第7天調(diào)查繭中死亡頭數(shù)。
結(jié)果(表1)：A1桑園桑葉飼養(yǎng)區(qū)從第2天開始陸續(xù)出現(xiàn)中毒癥狀，A2桑園桑葉飼養(yǎng)區(qū)從第5天起出現(xiàn)中毒癥狀。中毒癥狀表現(xiàn)：吐液、拒食、體縮、擺頭、身體扭曲、死亡、痙攣、亂爬，死后尸體呈C形、扭曲、直線形、S形多種形狀。3齡起蠶至上蔟后第7天累計死亡率，A1桑園桑葉飼養(yǎng)區(qū)達(dá)55.33％，極顯著高于正常桑園桑葉飼養(yǎng)區(qū)；A2桑園桑葉飼養(yǎng)區(qū)達(dá)18.67％，極顯著高于正常桑園桑葉飼養(yǎng)區(qū)。
結(jié)論：到9月中下旬，A1桑園、A2桑園的桑葉有一般毒性和神經(jīng)毒性，用于養(yǎng)蠶是不安全的。
表1用測試桑葉養(yǎng)蠶的死亡情況
應(yīng)用例2桑粉虱重度為害桑葉的毒性和安全性評價。
某年6月，有一桑園受到桑粉虱嚴(yán)重為害，葉背密密麻麻布滿桑粉虱的若蟲(幼蟲)。為測定桑粉虱危害桑葉的毒性與致病性，測試如下：
材料與方法：采摘桑粉虱為害較重、葉背灰白點較多的第9葉位葉片(重度為害葉，每cm2有8個以上桑粉虱若蟲或尸體)來測試；供試蠶：蠶品種“7532×932”，常規(guī)飼養(yǎng)致3齡起蠶。處理區(qū)設(shè)置：桑粉虱重度為害葉區(qū)和正常桑葉區(qū)(對照區(qū))，各在一間蠶室飼養(yǎng)，防止相互傳染。各處理區(qū)養(yǎng)蠶3小區(qū)(重復(fù)3小區(qū))，每小區(qū)30頭蠶。3齡起蠶后喂桑粉虱為害桑葉至4齡末期(共8天)。
結(jié)果：桑粉虱重度為害葉區(qū)喂葉后經(jīng)36h后蠶體即有病斑出現(xiàn)，48h后幾乎100％蠶的身體有病斑，其中80％的蠶的足部有黑斑點。當(dāng)齡有90％蠶不能入眠而死亡，少數(shù)入眠能蛻皮的，繼續(xù)喂粉虱為害葉又會重新長出病斑，于4齡末死亡。累計死亡率100％。正常桑葉區(qū)(對照區(qū))死亡率為0。桑粉虱為害葉區(qū)的蠶尸體，拾在墊有濕濾紙的培養(yǎng)皿，繼續(xù)觀察：在死后5h，100％的尸體僵硬，2天后尸體表面布滿白色菌絲，死后4d-5d尸體表面布滿灰色的粉末。經(jīng)診斷，死蠶為家蠶灰僵病而致死。
結(jié)論：桑粉虱為害葉具有器官毒性，蠶體接觸后會出現(xiàn)黑色病斑，影響眠蠶蛻皮；具有家蠶灰僵病的致病性；用桑粉虱為害葉養(yǎng)蠶是不安全的。
應(yīng)用例3桑樹赤銹病為害桑葉的毒性與安全性評價
桑樹赤銹病(Aecidium mori Barclay)，又稱赤粉病、金桑、金葉，是桑樹常見的真菌病害，主要為害桑樹新梢的嫩芽、葉片及?；?、椹。桑葉染病后，會出現(xiàn)點狀分布的壺狀銹孢子器，從銹孢子器中噴出鮮橙黃色粉狀的銹孢子布滿桑葉。
為評價被赤銹病菌物及其次生產(chǎn)物污染的桑葉的毒性和安全性，進(jìn)行測試如下：
材料與方法：供試蠶：蠶品種為兩廣二號，按常規(guī)飼養(yǎng)至3齡起蠶。設(shè)處理區(qū)：赤銹病重度為害葉飼養(yǎng)區(qū)、正常葉飼養(yǎng)區(qū)(對照區(qū))，各處理區(qū)飼養(yǎng)3小區(qū)(3重復(fù)小區(qū))，每小區(qū)50頭蠶。從3齡起蠶開始，連續(xù)用測試葉飼養(yǎng)至結(jié)繭。按《桑蠶絲繭育養(yǎng)蠶技術(shù)規(guī)程》(DB45/T87-2003)的環(huán)境條件和要求進(jìn)行養(yǎng)蠶和蠶繭保護(hù)，蛹期、蛾期、卵期的保護(hù)溫度為24℃-26℃、相對濕度75％-85％。
調(diào)查項目：(1)蠶食桑、爬行、吐絲結(jié)繭活動情況；(2)蠶體壁、中腸、口器等器官情況；(3)蠶生長發(fā)育、眠蠶、熟蠶、結(jié)繭、化蛹、化蛾情況；(4)調(diào)查不眠蠶、不脫皮蠶、不吐絲結(jié)繭蠶、不化蛹蠶等發(fā)育異常蠶；(5)調(diào)查不產(chǎn)卵蛾、少產(chǎn)卵蛾(產(chǎn)卵數(shù)＜120粒的蠶蛾，或產(chǎn)卵數(shù)＜該品種正常產(chǎn)卵數(shù)30％的蠶蛾)、受精異常蛾(所產(chǎn)蠶卵20％以上是不受精卵)等非正常產(chǎn)卵蛾的數(shù)量，計算非正常產(chǎn)卵蛾率(即非正常產(chǎn)卵蛾數(shù)占總參試雌蛾數(shù)的比率)；調(diào)查正常產(chǎn)卵蛾的單蛾產(chǎn)卵數(shù)和良卵數(shù)，計算良卵率；(6)調(diào)查傳染性蠶病發(fā)生情況
結(jié)果(表2)與評價：
(1)赤銹病重度為害葉區(qū)沒有出現(xiàn)吐液、拒食、體縮、擺頭、身體扭曲等家蠶急性中毒癥狀，健蠶率為100％、結(jié)繭率100％、死籠率為0，3齡蠶蟲蛹率100％、3齡蠶成蛾率極高97.33％，且高于對照區(qū)(正常葉)，診斷：赤銹病重度為害葉區(qū)沒有一般毒性；
(2)赤銹病重度為害葉區(qū)蠶兒沒有出現(xiàn)呆伏不動、喂葉無反應(yīng)或狂燥、亂爬、亂吐絲、旋蛹等神經(jīng)異常蠶，診斷：赤銹病重度為害葉區(qū)沒有神經(jīng)毒性；
(3)赤銹病重度為害葉區(qū)蠶體壁沒有異常病斑、排便正常、吐絲正常、眠起脫皮正常、化蛹正常，表明赤銹病重度為害葉區(qū)沒有器官毒性；
(4)赤銹病重度為害葉區(qū)沒有出現(xiàn)不眠蠶、不脫皮蠶、不吐絲結(jié)繭蠶、不化蛹蠶等發(fā)育異常蠶，3齡蠶成蛹率100％，3齡蠶成蛾率高達(dá)97.33％，且高于對照區(qū)，診斷：赤銹病重度為害葉沒有發(fā)育毒性；
(5)赤銹病重度為害葉區(qū)非正常產(chǎn)卵蛾率僅為6.67％，且低于對照區(qū)；單蛾良卵率高達(dá)99.66％，高于對照區(qū)，診斷：赤銹病重度為害葉沒有生殖毒性；
(6)赤銹病重度為害葉區(qū)健蠶率、3齡蠶成蛹率100％，沒有出現(xiàn)病死蠶，診斷：赤銹病重度為害葉沒有病原微生物致病性。
結(jié)論：赤銹病重度為害葉養(yǎng)蠶沒有毒性和病原微生物的致病性，是安全的。
表2赤銹病重度為害葉養(yǎng)蠶的生命力和生殖力