本發(fā)明涉及檢測(cè)方法領(lǐng)域，特別是涉及一種快速測(cè)定多維片中維生素B1和維生素C的方法。
背景技術(shù)：
維生素B1又稱硫胺素或抗神經(jīng)素，是維持心臟、神經(jīng)系統(tǒng)及消化系統(tǒng)正常功能所必需的一種維生素，主要存在于肉類和蔬菜中。在生物體內(nèi)，它是重要生物催化劑——羧化輔酶的主要成分，缺乏時(shí)會(huì)導(dǎo)致一系列病癥，如腳氣病、多發(fā)性神經(jīng)炎等。維生素C，別名L-抗壞血酸，可促進(jìn)酪氨酸和色氨酸的代謝，延長(zhǎng)肌體壽命，是構(gòu)成皮膚細(xì)胞間質(zhì)的必需成分，廣泛分布于各類新鮮蔬果中，缺乏時(shí)易患?jí)难〉燃膊 ?/p>
隨著當(dāng)今社會(huì)節(jié)奏的加快，便捷高效的營(yíng)養(yǎng)素補(bǔ)充劑越來(lái)越受到人們的青睞，多維片就是補(bǔ)充人體必需的B1和C等維生素及微量元素的一種復(fù)方制劑。維生素B1和維生素C屬于人體維持正常生理功能的一類微量有機(jī)物質(zhì)，但服用過(guò)量時(shí)會(huì)產(chǎn)生一系列副作用，如體內(nèi)維生素B1過(guò)量，會(huì)導(dǎo)致身體發(fā)抖、皰疹、浮腫、心跳增快及過(guò)敏等；過(guò)量服用維生素C可產(chǎn)生某些不良反應(yīng)，如下痢、皮膚發(fā)疹及尿酸結(jié)石等。因此，建立一種簡(jiǎn)捷高效、成本低廉的檢測(cè)方法，以更好地監(jiān)控保健食品質(zhì)量安全，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種快速、簡(jiǎn)便、定量準(zhǔn)確地測(cè)定多維片中維生素B1和維生素C的方法。
一種快速測(cè)定多維片中維生素B1和維生素C的方法，包括如下步驟：
(1)樣品處理：樣品經(jīng)溶解、提取、離心、過(guò)濾等前處理步驟處理后得到濾液；
(2)樣品分析：采用原位噴霧電離裝置進(jìn)行分析，吸取體積比為1:1的濾液和甲醇，充注至拉制的硼硅酸鹽玻璃毛細(xì)管，插入微電極，將其放置于離子遷移譜儀進(jìn)樣口前端，施加噴霧電壓，試樣經(jīng)離子化，進(jìn)入遷移管經(jīng)分離后以法拉第杯檢測(cè)器檢測(cè)。
本發(fā)明所述的快速測(cè)定多維片中維生素B1和維生素C的方法，其中，所述離子遷移譜儀的分析條件如下：
電噴霧電壓：正離子模式，維生素B1：2000V；負(fù)離子模式，維生素C：2100V；
遷移管電壓：8000V；
遷移管溫度：180℃；
氣體預(yù)加熱溫度：180℃；
遷移譜寬：26ms；
離子門脈沖寬度：70μs；
離子門電壓：40V；
數(shù)據(jù)采集速率：200,000s-1；
采集時(shí)間：20s；
漂移氣流速：1.5L/min；
排氣泵抽速：0.66L/min。
本發(fā)明所述的快速測(cè)定多維片中維生素B1和維生素C的方法，其中，吸取的所述濾液和甲醇的體積均為5μL。
本發(fā)明所述的快速測(cè)定多維片中維生素B1和維生素C的方法，其中，所述離子遷移譜儀在使用前，將色氨酸和檸檬酸用甲醇配制成濃度為10μg/mL的溶液，并用于儀器校正，其中，正離子模式下用色氨酸溶液校正，負(fù)離子模式下用檸檬酸溶液校正。
本發(fā)明所述的快速測(cè)定多維片中維生素B1和維生素C的方法，其中，步驟(1)具體包括如下過(guò)程：
樣品處理：將樣品充分研磨至粉末狀，精密稱取0.1g至10mL容量瓶中，加入2mL水，渦旋1min，然后用水定容至10mL刻度；再次渦旋1min，將試樣全部轉(zhuǎn)移至離心管中，8000rpm離心5min，取上清液過(guò)0.45μm微孔濾膜，得到濾液。
本發(fā)明所述的快速測(cè)定多維片中維生素B1和維生素C的方法，其中，對(duì)于采用原位噴霧電離裝置檢出的陽(yáng)性樣品，進(jìn)一步采用液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜法進(jìn)行確證。
本發(fā)明所述的快速測(cè)定多維片中維生素B1和維生素C的方法，其中，所述液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜法的條件如下：
液相色譜條件：
色譜柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3，100mm×2.1mm,1.8μm；
流動(dòng)相A：01％甲酸水溶液，流動(dòng)相B：01％甲酸甲醇溶液，梯度洗脫，梯度洗脫程序見表1。
表1梯度洗脫程序
流速：0.3mL/min；
柱溫：30℃；
進(jìn)樣量：5μL；
質(zhì)譜條件：
離子源：電噴霧離子源；
離子化模式：正離子模式；
毛細(xì)管電壓：3.0kV；
萃取錐孔電壓：4.0V；
離子源溫度：150℃；
脫溶劑氣溫度：500℃；
數(shù)據(jù)采集方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式；
表2維生素B1和維生素C的質(zhì)譜分析參數(shù)
進(jìn)行試樣測(cè)定時(shí)，將樣液適當(dāng)稀釋，按所述液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜法的條件測(cè)定樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，如果所選擇的離子均出現(xiàn)，而且所選擇的離子比與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的相對(duì)豐度一致，允許偏差不超過(guò)表2規(guī)定的范圍，則判斷樣品中含有維生素B1和維生素C。
本發(fā)明快速測(cè)定多維片中維生素B1和維生素C的方法與現(xiàn)有技術(shù)不同之處在于：
本發(fā)明快速測(cè)定多維片中維生素B1和維生素C的方法采用原位電離-便攜式離子遷移譜技術(shù)建立了多維片中維生素B1和維生素C的快速測(cè)定方法，解決了常規(guī)檢測(cè)方法操作繁瑣、耗時(shí)冗長(zhǎng)的問題。實(shí)驗(yàn)中以不同加標(biāo)濃度的樣品進(jìn)行測(cè)定和方法學(xué)考察，結(jié)果顯示該方法操作簡(jiǎn)便、成本低廉、分析速度快、專屬性好且定量準(zhǔn)確，可用于多維片中維生素B1和維生素C的定量檢測(cè)，而且由于離子遷移譜體積小，可移動(dòng)，機(jī)動(dòng)性強(qiáng)，將有望實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品的現(xiàn)場(chǎng)快速分析測(cè)定，具有較為廣闊的應(yīng)用前景。
本發(fā)明采用萃取納升噴霧結(jié)合離子遷移譜技術(shù)，建立了多維片中維生素B1和維生素C的快速測(cè)定方法。試樣經(jīng)水渦旋振蕩及離心等前處理后，樣液以甲醇1︰1(體積比)稀釋后直接進(jìn)行測(cè)定。實(shí)驗(yàn)中分別對(duì)原位電離中噴霧離子化條件、試樣溶劑和離子遷移譜中遷移管溫度、漂移氣流速等關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行了重點(diǎn)優(yōu)化。結(jié)果表明，維生素B1和維生素C的檢出限為0.1mg/g，定量限為0.2mg/g；在1～10μg/mL和1～100μg/mL濃度范圍內(nèi)，維生素B1和維生素C分別呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)大于0.99；遷移時(shí)間的重復(fù)性(平行測(cè)定6次)為0.6％～2.9％；單例樣品的儀器分析時(shí)間不超過(guò)20ms。本方法快速，前處理過(guò)程簡(jiǎn)便且結(jié)果穩(wěn)定可靠，可用于多維片中維生素B1和維生素C的快速分析測(cè)定。
下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的快速測(cè)定多維片中維生素B1和維生素C的方法作進(jìn)一步說(shuō)明。
附圖說(shuō)明
圖1為本發(fā)明實(shí)施例中維生素B1和維生素C的離子遷移譜圖。
本發(fā)明附圖中出現(xiàn)的所有英文的中英文對(duì)照如下：
Intensity:信號(hào)強(qiáng)度；Drift time:遷移時(shí)間；ms:毫秒。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
一、儀器與試劑
采用原位噴霧電離裝置，其具體結(jié)構(gòu)見申請(qǐng)?zhí)枮?01510514854.6的專利文件。
GA2100離子遷移譜系統(tǒng)(美國(guó)Excellims公司)：配電噴霧離子源、離子?xùn)砰T控制器、空氣過(guò)濾裝置(含硫酸鈣和分子篩)、高分辨率離子遷移分析器、法拉第杯檢測(cè)器、VisIon儀器控制與數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，使用前在正、負(fù)離子模式下分別用色氨酸和檸檬酸校正儀器；Milli-Q超純水器(美國(guó)Millipore公司)；MS2型渦旋振蕩器(德國(guó)IKA公司)；P-1000型微電極拉制儀、硼硅酸鹽玻璃毛細(xì)管(外徑1.50mm，內(nèi)徑0.86mm，長(zhǎng)度10cm)(美國(guó)Sutter公司)；Axio Scope A1顯微鏡(德國(guó)Zeiss公司)；ESW-M15P型電極夾持器(美國(guó)Warner Instruments公司)；移液器吸頭(美國(guó)Bio-Rad公司)。
維生素B1(美國(guó)Sigma-Alarich公司)和維生素C(美國(guó)ChemService公司)純度均大于95％，先以水配制成濃度為1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，分析時(shí)用90％甲醇/水稀釋至適宜濃度；甲醇(色譜純)購(gòu)自美國(guó)Fisher公司；色氨酸和檸檬酸購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司，以甲醇配成10μg/mL進(jìn)行儀器校正。
二、樣品處理及分析
將樣品充分研磨至粉末狀，精密稱取0.1g(精確至0.01g)至10mL容量瓶中，加入2mL水，渦旋1min，然后用水定容至10mL刻度；再次渦旋1min，將試樣全部轉(zhuǎn)移至離心管中，8000rpm離心5min，取上清液過(guò)0.45μm微孔濾膜。
吸取5μL濾液和5μL甲醇，充注至拉制的硼硅酸鹽玻璃毛細(xì)管，插入微電極，將其放置于離子遷移譜儀進(jìn)樣口前端，施加噴霧電壓，試樣經(jīng)離子化，進(jìn)入遷移管經(jīng)分離后以法拉第杯檢測(cè)器檢測(cè)。
所述離子遷移譜儀的分析條件如下：
電噴霧電壓：正離子模式，維生素B1：2000V；負(fù)離子模式，維生素C：2100V；
遷移管電壓：8000V；
遷移管溫度：180℃；
氣體預(yù)加熱溫度：180℃；
遷移譜寬：26ms；
離子門脈沖寬度：70μs；
離子門電壓：40V；
數(shù)據(jù)采集速率：200,000s-1；
采集時(shí)間：20s；
漂移氣流速：1.5L/min；
排氣泵抽速：0.66L/min。
對(duì)于采用原位噴霧電離裝置檢出的陽(yáng)性樣品，進(jìn)一步采用液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜法進(jìn)行確證，具體條件如下：
液相色譜條件：
色譜柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3，100mm×2.1mm,1.8μm；
流動(dòng)相A：0.1％甲酸水溶液，流動(dòng)相B：0.1％甲酸甲醇溶液，梯度洗脫；梯度洗脫程序見表1。
表1梯度洗脫程序
流速：0.3mL/min；
柱溫：30℃；
進(jìn)樣量：5μL；
質(zhì)譜條件：
離子源：電噴霧離子源；
離子化模式：正離子模式；
毛細(xì)管電壓：3.0kV；
萃取錐孔電壓：4.0V；
離子源溫度：150℃；
脫溶劑氣溫度：500℃；
數(shù)據(jù)采集方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式；
表2維生素B1和維生素C的質(zhì)譜分析參數(shù)
進(jìn)行試樣測(cè)定時(shí)，將樣液適當(dāng)稀釋，按所述液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜法的條件測(cè)定樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，如果所選擇的離子均出現(xiàn)，而且所選擇的離子比與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的相對(duì)豐度一致，允許偏差不超過(guò)表2規(guī)定的范圍，則判斷樣品中含有維生素B1和維生素C。
三、分析條件優(yōu)化
1、萃取納升噴霧離子化條件的優(yōu)化
維生素B1和維生素C屬于水溶性維生素，因此，本實(shí)驗(yàn)以水為溶劑配制其標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。為增強(qiáng)其在電噴霧模式下的響應(yīng)，同時(shí)設(shè)置了不同體積濃度的甲醇-水、乙醇-水、乙腈-水進(jìn)行比較測(cè)試。結(jié)果表明，維生素B1和維生素C分別在正離子模式和負(fù)離子模式下獲得較高響應(yīng)；相同體積濃度的乙腈-水與甲醇-水作為溶劑響應(yīng)強(qiáng)度相差無(wú)幾，但前者的基質(zhì)噪音稍高于后者；當(dāng)使用50％甲醇-水作為溶劑時(shí)，目標(biāo)分析物響應(yīng)強(qiáng)度最高，且基質(zhì)噪音相對(duì)較低；另外，對(duì)離子化影響較大的噴霧電壓也進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明維生素B1和維生素C分別在2000V(正離子模式)和2100V(負(fù)離子模式)下均獲得了較高的響應(yīng)強(qiáng)度。
2、遷移管溫度的優(yōu)化
在離子遷移譜分析中，遷移管溫度的設(shè)置往往對(duì)目標(biāo)分析物的響應(yīng)強(qiáng)度有較大影響。在一定范圍內(nèi)，提高遷移管溫度，可有效減少管內(nèi)記憶效應(yīng)，從而提高靈敏度；但遷移管溫度過(guò)高，會(huì)產(chǎn)生一系列不穩(wěn)定因素，如熱交換加速、目標(biāo)物分解等。本實(shí)驗(yàn)中分別設(shè)置150℃、160℃、170℃、180℃、190℃作為遷移管溫度，結(jié)果表明，維生素B1和維生素C在180℃和190℃時(shí)響應(yīng)強(qiáng)度較高且基本相同，因此，選擇180℃作為離子遷移譜分析時(shí)遷移管的溫度。
3、漂移氣流速的選擇
在優(yōu)化的噴霧電壓和遷移管溫度條件下，對(duì)漂移氣(氮?dú)?的流量也進(jìn)行了優(yōu)化。分別選取0.5、1.0、1.5、2.0L/min作為漂移氣流速，進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，漂移氣流速對(duì)兩種目標(biāo)分析物的分離度影響不大，但在1.5mL/min時(shí)，二者響應(yīng)強(qiáng)度較其他流速下稍高，且在該漂移氣流速下，維生素B1和維生素C的遷移時(shí)間分別為11.5ms和8.3ms，峰形較好，且能與干擾峰獲得良好分離。維生素B1和維生素C的特征離子遷移譜圖見圖1。
4、遷移時(shí)間重復(fù)性的考察
離子遷移譜主要以遷移時(shí)間的差別進(jìn)行離子的分離及定性，因此，遷移時(shí)間的重復(fù)性在離子遷移譜分析方法中的重要性不言而喻。按本發(fā)明的處理?xiàng)l件得到樣品基質(zhì)溶液，然后添加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液(每個(gè)加標(biāo)濃度樣品制備2份，平行測(cè)試6次)，分別考察維生素B1和維生素C在不同加標(biāo)濃度下遷移時(shí)間的重復(fù)性。按照本發(fā)明的分析條件進(jìn)行測(cè)定，維生素B1和維生素C的遷移時(shí)間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.6％～2.9％之間，表明兩種物質(zhì)的遷移時(shí)間在建立的分析條件下重復(fù)性較好。
5、線性關(guān)系及檢出限、定量限
將一系列不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液依次進(jìn)樣，以峰面積(y)對(duì)質(zhì)量濃度(x)進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，維生素B1和維生素C分別在1～10μg/mL和1～100μg/mL范圍內(nèi)線性良好，線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限、定量限見表3。
表3線性關(guān)系、檢出限及定量限
7、加標(biāo)樣品的測(cè)定
為驗(yàn)證分析方法定量的準(zhǔn)確性，本實(shí)驗(yàn)分別設(shè)置定量限濃度(0.2mg/g)、0.4mg/g、1.0mg/g三個(gè)添加水平，每個(gè)濃度平行制備3份(表4)，以標(biāo)準(zhǔn)曲線外標(biāo)法進(jìn)行定量。結(jié)果顯示，維生素B1和維生素C在三個(gè)添加濃度水平下的準(zhǔn)確度(％，平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差)介于98.6±1.4與103.4±1.3之間，表明方法準(zhǔn)確度較好，可滿足樣品中維生素B1和維生素C的準(zhǔn)確測(cè)定。
表4方法準(zhǔn)確度考察結(jié)果(％，平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，平行測(cè)試3次)
以上所述的實(shí)施例僅僅是對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行描述，并非對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn)行限定，在不脫離本發(fā)明設(shè)計(jì)精神的前提下，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作出的各種變形和改進(jìn)，均應(yīng)落入本發(fā)明權(quán)利要求書確定的保護(hù)范圍內(nèi)。