本發(fā)明屬于食品檢測領(lǐng)域，涉及固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)，具體是指一種葡萄酒中雙炔酰菌胺、噻唑菌胺、硅噻菌胺、氟啶酰菌胺等4種酰胺類殺菌劑的檢測方法，尤其適用于葡萄酒。

背景技術(shù)：

隨著人們生活水平的提高和健康意識的增強，葡萄酒這一集營養(yǎng)性、功能性以及文化品位于一體的特殊飲品越來越受到人們的喜愛。浙江作為我國東南沿海經(jīng)濟較發(fā)達的省份，近年來葡萄酒消費量增長迅速，特別是進口葡萄酒。浙江口岸進口葡萄酒貿(mào)易額一直居全國同行業(yè)領(lǐng)先地位。2015年，浙江口岸共進口葡萄酒3.11萬噸，比上年增長10.2%，貨值1.2億美元，市場交易額35億元，進口量排名僅次于上海、深圳、廣州、天津等口岸。葡萄酒消費市場的火爆程度可見一斑。

然而，不論是進口還是國產(chǎn)葡萄酒，葡萄作為其最主要的生產(chǎn)原料在田間管理過程中，為防止病害發(fā)生，通常會噴施一定量的農(nóng)藥，有些農(nóng)藥在葡萄酒生產(chǎn)發(fā)酵過程中不易去除分解，會不同程度地殘留在葡萄酒中，給飲用者健康帶來潛在的威脅。2013年，美國環(huán)境工作組(EWG)發(fā)布的 “最骯臟果蔬”黑名單中，葡萄位列第三，共檢出15種農(nóng)藥殘余成分，而在含有的農(nóng)藥種類方面，葡萄則位居榜首，總共含有64種不同的化學(xué)物質(zhì)。因此，葡萄酒中的農(nóng)藥殘留問題不容小覷。

目前，有些國家已經(jīng)對酰胺類農(nóng)藥在食品中的最大殘留量做了嚴(yán)格規(guī)定，如歐盟法規(guī)規(guī)定：在葡萄中雙炔酰菌胺(Mandipropamid)的最大殘留量為2.0 mg/kg，氟啶酰菌胺(Fluopicolide)的最大殘留量為2.0 mg/kg，硅噻菌胺(Silthiofam)的最大殘留量更是低至0.01 mg/kg。這些法規(guī)在保護消費者健康利益的同時，也是重要的技術(shù)性貿(mào)易壁壘措施。

因此，建立準(zhǔn)確、可靠地測定葡萄酒中雙炔酰菌胺、噻唑菌胺、硅噻菌胺、氟啶酰菌胺等4種酰胺類殺菌劑的含量非常重要。

目前，常規(guī)的分析方法可分為定性分析、定量分析和定性定量分析技術(shù)。定量分析一般采用色譜技術(shù)和色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，色譜技術(shù)有氣相色譜和液相色譜等方法，色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)有液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等方法；定性定量分析則要兼具兩種技術(shù)為一體，檢測結(jié)果要同時提供目標(biāo)物的結(jié)構(gòu)信息和數(shù)量信息，根據(jù)歐盟委員會非強制執(zhí)行法案2002/657/EC的規(guī)定，對禁用藥物進行確證檢測的方法必須能提供結(jié)構(gòu)方面的信息，且要達到該法案規(guī)定的4個確證點。

目前，由于國內(nèi)外無相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)或文獻可循，因此，有必要對葡萄酒中的雙炔酰菌胺、噻唑菌胺、硅噻菌胺、氟啶酰菌胺等4種酰胺類殺菌劑的檢測方法進行研究，從而對葡萄酒中酰胺類殺菌劑進行監(jiān)測，同時為國內(nèi)葡萄酒企業(yè)出口到歐盟等地區(qū)時，能出具符合歐盟委員會非強制執(zhí)行法案2002/657/EC的規(guī)定的檢測數(shù)據(jù)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種葡萄酒中酰胺類殺菌劑的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，該方法結(jié)合固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，能夠?qū)ζ咸丫浦须p炔酰菌胺、噻唑菌胺、硅噻菌胺、氟啶酰菌胺等4種酰胺類殺菌劑同時進行測定，該方法具有準(zhǔn)確、快速、靈敏度高的優(yōu)點，為葡萄酒的快速檢測提供了可靠的檢測方法支持。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種葡萄酒中酰胺類殺菌劑的固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，其特征在于包括以下步驟：

（一）待測樣品的制備：稱取4.7-5.3g葡萄酒樣本，葡萄酒樣本中加入超純水，混勻后得到待檢液；

（二）待檢液的凈化：將固定相萃取柱進行預(yù)處理，將步驟（一）制備的待檢液上固定相萃取柱，經(jīng)水和甲醇/水溶液淋洗除去雜質(zhì)，再用洗脫溶劑洗脫固定相萃取柱上的雙炔酰菌胺、噻唑菌胺、硅噻菌胺、氟啶酰菌胺得到洗脫液，將洗脫液濃縮富集后，用甲醇溶劑稀釋并經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾后得到待測樣品溶液；

（三）標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置：分別配制雙炔酰菌胺、噻唑菌胺、硅噻菌胺、氟啶酰菌胺溶液階梯濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液1.0 ng/mL，2.0 ng/mL，5.0 ng/mL，10.0 ng/mL，20.0 ng/mL，內(nèi)標(biāo)物噻唑菌胺-D5濃度為10.0 ng/mL，

（四）待測樣品溶液的檢測：將步驟（二）中的待測樣品溶液和混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液在液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀上分別進樣，獲得以標(biāo)準(zhǔn)溶液中雙炔酰菌胺、噻唑菌胺、硅噻菌胺、氟啶酰菌胺、噻唑菌胺-D5的濃度為橫坐標(biāo)，再以混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中雙炔酰菌胺、噻唑菌胺、硅噻菌胺、氟啶酰菌胺、噻唑菌胺-D5的峰面積為縱坐標(biāo)的工作曲線，還有獲得可以確定母離子的雙炔酰菌胺、噻唑菌胺、硅噻菌胺、氟啶酰菌胺、噻唑菌胺-D5的一級質(zhì)譜圖，確定母離子后，采用子離子掃描獲得二級質(zhì)譜圖，然后從二級質(zhì)譜圖中選取定量離子和定性離子，然后用工作曲線對定量離子進行定量計算，內(nèi)標(biāo)法定量(內(nèi)標(biāo)物為噻唑菌胺-D5)，獲得待測樣品溶液中雙炔酰菌胺、噻唑菌胺、硅噻菌胺、氟啶酰菌胺的濃度。

進一步的，所述步驟（二）中的固定相萃取柱為Waters Oasis HLB SPE柱，并通過甲醇、水對SPE柱進行活化處理。

進一步的，所述步驟（二）中的淋洗溶劑為水和體積比為1/3的甲醇水混合溶液，洗脫溶劑為甲醇。

進一步的，所述的步驟（三）中液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀的檢測參數(shù)為：

色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C₁₈反相柱；

流速：0.25 mL/min；

流動相：A為0.15%甲酸水溶液；B為乙腈；

進樣量：5μL；

色譜柱溫度：30 oC；

電噴霧離子源：正離子掃描，電壓為5000V；

離子源溫度：450 oC；

霧化氣壓力：50 psi；

輔助氣流速：40 psi ；

氣簾氣壓力：20 psi ；

碰撞氣壓力：20 psi。

采用上述方案，本發(fā)明通過加入超純水對葡萄酒樣品進行稀釋，并對由超純水稀釋得到的待檢液進行凈化處理，該凈化處理包括純化和富集的過程。第一步純化：先將待檢液通過固相萃取小柱，依次經(jīng)過經(jīng)水和甲醇/水溶液淋洗、甲醇洗脫；第二步富集：將第一步中純化的待檢液氮氣濃縮近干，然后加入甲醇溶液溶解、經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾，得到凈化的待檢液。該凈化后的待檢液則不會對檢測儀器造成污染。本發(fā)明中固相萃取的SPE柱為Waters Oasis HLB SPE柱，由于4種酰胺類殺菌劑和其他雜質(zhì)的極性大小存在差異，在固相萃取柱上吸附產(chǎn)生保留差異，然后通過優(yōu)選的淋洗條件和洗脫條件，達到凈化富集殺菌劑的目的。

其次，本發(fā)明對于葡萄酒中的雙炔酰菌胺、噻唑菌胺、硅噻菌胺、氟啶酰菌胺等4種酰胺類殺菌劑成分的定性定量檢測分析是通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(LC-MS/MS)分析。先配置一組階梯形的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，然后將標(biāo)準(zhǔn)工作液和待檢液在液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀上分別進樣。待檢液中出現(xiàn)的色譜峰保留時間與標(biāo)準(zhǔn)工作溶液一致，允許偏差小于±2.5 %，該色譜峰所對應(yīng)的質(zhì)譜定性離子的相對豐度與濃度相當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)工作溶液的相對豐度一致，而且相對豐度偏差不超過規(guī)定，則可確定該待檢液中含有酰胺類殺菌劑。

最后，本方法采用同位素內(nèi)標(biāo)法進行定量，對定量結(jié)果更加準(zhǔn)確。

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步描述。

附圖說明

附圖1為本發(fā)明具體實施例中的噻唑菌胺化學(xué)結(jié)構(gòu)式；

附圖2為本發(fā)明具體實施例中的雙炔酰菌胺化學(xué)結(jié)構(gòu)式；

附圖3為本發(fā)明具體實施例中的氟啶酰菌胺化學(xué)結(jié)構(gòu)式；

附圖4為本發(fā)明具體實施例中的硅噻菌胺化學(xué)結(jié)構(gòu)式；

附圖5為本發(fā)明具體實施例中的噻唑菌胺-D5化學(xué)結(jié)構(gòu)式；

附圖6為本發(fā)明具體實施例中噻唑菌胺殺菌劑標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.0 ng/mL) MRM色譜圖；

附圖7為本發(fā)明具體實施例中雙炔酰菌胺殺菌劑標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.0 ng/mL) MRM色譜圖；

附圖8為本發(fā)明具體實施例中氟啶酰菌胺殺菌劑標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.0 ng/mL) MRM色譜圖；

附圖9為本發(fā)明具體實施例中硅噻菌胺殺菌劑標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.0 ng/mL) MRM色譜圖；

附圖10為本發(fā)明具體實施例中噻唑菌胺-D5殺菌劑標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.0 ng/mL) MRM色譜圖

附圖11為本發(fā)明具體實施例中噻唑菌胺殺菌劑掃描二級質(zhì)譜圖；

附圖12為本發(fā)明具體實施例中雙炔酰菌胺殺菌劑掃描二級質(zhì)譜圖；

附圖13為本發(fā)明具體實施例中氟啶酰菌胺殺菌劑掃描二級質(zhì)譜圖；

附圖14為本發(fā)明具體實施例中硅噻菌胺殺菌劑掃描二級質(zhì)譜圖；

附圖15為本發(fā)明具體實施例中噻唑菌胺-D5殺菌劑掃描二級質(zhì)譜圖；

附圖16為本發(fā)明具體實施例中噻唑菌胺標(biāo)準(zhǔn)工作曲線；

附圖17為本發(fā)明具體實施例中雙炔酰菌胺標(biāo)準(zhǔn)工作曲線；

附圖18為本發(fā)明具體實施例中氟啶酰菌胺標(biāo)準(zhǔn)工作曲線；

附圖19為本發(fā)明具體實施例中硅噻菌胺標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

具體實施方式

本發(fā)明的具體實施例如圖1-19所示是葡萄酒中酰胺類殺菌劑的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，其包括以下步驟：

待測樣品的制備：稱取葡萄酒樣品5.0g，加入3 mL超純水混勻得到待檢液；

固相萃取凈化：取HLB SPE柱，依次用甲醇和水活化SPE柱，取全部待檢液至SPE柱，再依次用4～6mL水和4～6mL甲醇/水混合溶液(v/v, 1/3)淋洗SPE柱，將SPE柱真空抽干，用6～8mL的甲醇對SPE柱進行洗脫，得到洗脫液，將洗脫液濃縮后，用2 mL甲醇稀釋過微孔濾膜后得到待測樣品溶液；

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置：取雙炔酰菌胺、噻唑菌胺、硅噻菌胺、氟啶酰菌胺、噻唑菌胺-D5標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇分別配制成質(zhì)量濃度為400 mg/L的單標(biāo)儲備液，進行測定使用時，用甲醇稀釋上述標(biāo)準(zhǔn)儲備液，將雙炔酰菌胺、噻唑菌胺、硅噻菌胺、氟啶酰菌胺分別配制成1.0ng/mL，2.0 ng/mL，5.0 ng/mL，10.0 ng/mL，20.0 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，內(nèi)標(biāo)物噻唑菌胺-D5濃度為10.0 ng/mL；

待測樣品的檢測：將步驟（二）（三）中的待測樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)工作溶液在液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀上分別進樣，獲得以標(biāo)準(zhǔn)溶液中雙炔酰菌胺、噻唑菌胺、硅噻菌胺、氟啶酰菌胺等4種酰胺類殺菌劑的濃度為橫坐標(biāo)，再以標(biāo)準(zhǔn)溶液中雙炔酰菌胺、噻唑菌胺、硅噻菌胺、氟啶酰菌胺等4種酰胺類殺菌劑的的峰面積為縱坐標(biāo)的工作曲線，結(jié)果表明，4種酰胺類殺菌劑在1.0-20.0 ng/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，R²≥0.99，以10倍信噪比(S/N)為方法定量限即LOQ，經(jīng)樣品添加試驗確定4種酰胺類殺菌劑的定量限均為0.5 ng/g。還有獲得可以確定母離子的雙炔酰菌胺、噻唑菌胺、硅噻菌胺、氟啶酰菌胺等4種酰胺類殺菌劑的一級質(zhì)譜圖，確定母離子后，采用子離子掃描獲得二級質(zhì)譜圖，然后從二級質(zhì)譜圖中選取定量離子和定性離子，然后用工作曲線對定量離子進行定量計算，內(nèi)標(biāo)法定量(內(nèi)標(biāo)物為噻唑菌胺-D5)，獲得待測樣品溶液中雙炔酰菌胺、噻唑菌胺、硅噻菌胺、氟啶酰菌胺等4種酰胺類殺菌劑的濃度。

表1 - 4種酰胺類殺菌劑LC-MS/MS檢測條件

^*MS/MS定量離子對

表2 - 4種酰胺類殺菌劑的線性方程、相關(guān)系數(shù)、定量限

表 -4種酰胺類殺菌劑添加回收率、精密度 (n=6)

本發(fā)明不局限于上述具體實施方式，本領(lǐng)域一般技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明公開的內(nèi)容，可以采用其他多種具體實施方式實施本發(fā)明的，或者凡是采用本發(fā)明的設(shè)計結(jié)構(gòu)和思路，做簡單變化或更改的，都落入本發(fā)明的保護范圍。