本發(fā)明涉及生物傳感器技術領域，特別涉及一種基于雙極電極陣列的可視化膽堿傳感器檢測膽堿的方法。

背景技術：

膽堿是一種有機堿，是乙酰膽堿的前體和卵磷脂的組成成分，也存在于神經(jīng)鞘磷脂中。膽堿在調整動物體內脂肪代謝、控制膽固醇的積蓄、防止脂肪肝、保證體細胞的正常生命活動、促進軟骨發(fā)育以及神經(jīng)系統(tǒng)的正常運行等方面都起著重要作用，其檢測具有重要的生物學意義。

由于膽堿沒有紫外吸收和電化學活性，所以利用酶的催化反應成為測定膽堿的重要方法。多數(shù)膽堿傳感器使用過氧化物酶，同時借助于電子媒介物或納米材料。酶的使用可以使傳感器的選擇性得以保證，但是酶的固定方法和其活性依然是一個需要繼續(xù)研究的問題。此外，引入媒介物可以使傳感器的性能大大提高，但同時也引入了復雜性和局限性。目前用于人體血清中膽堿濃度檢測的生物傳感器已有報道，但是由于抗干擾性差、線性范圍窄、使用壽命短等不足之處，它們在臨床檢測應用上受到限制。

因此，發(fā)展一種選擇性好、電極結構簡便、成本低廉的新型膽堿傳感器將具有重要的研究意義和廣闊的市場價值。

技術實現(xiàn)要素：

為了彌補現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明提供了一種選擇性好、電極結構簡便、成本低廉的膽堿檢測方法，本發(fā)明的方法基于雙極電極陣列-微流控芯片構成的可視化電化學發(fā)光傳感器。

本發(fā)明的技術方案為：

一種基于雙極電極陣列的可視化膽堿傳感器的制備方法，包括步驟：

1)制備蓋片

PDMS單體與固化劑混合而成的PDMS母液脫氣后倒在硅烷化的PDMS陽模上方平衡，然后蓋上保鮮膜，加熱固化；固化后，將PDMS從硅烷化的PDMS陽模上剝離，得含有通道凹槽的PDMS蓋片；在PDMS蓋片通道兩端各加工一個孔道，用于進樣和放置驅動電極；

2)制備基片

A.ITO雙極電極基片的制備

在ITO導電玻璃的導電表面涂5-15微米厚的正光膠膠層，將激光照排機繪制好的光刻掩膜與涂有正光膠膠層的ITO導電玻璃緊密貼合，然后進行汞燈曝光，曝光后將導電玻璃置于0.5-1wt％的NaOH溶液中顯影至電極圖案完全顯現(xiàn)后取出導電玻璃，清洗，干燥；繼續(xù)將導電玻璃置于硝酸與鹽酸的混合水溶液中刻蝕，刻蝕完畢后，清洗，干燥，得表面刻有三根ITO雙極電極的基片；

B.制備膽堿氧化酶/碳納米管/殼聚糖復合物

殼聚糖溶于0.5-2wt％的醋酸水溶液中，得5-15mg/mL的殼聚糖溶液，加入多壁碳納米管并均勻分散于殼聚糖溶液中得黑色懸濁液，碳納米管的加入量為1-3mg/mL；取濃度為3-8mg/mL的膽堿氧化酶溶液與所述黑色懸濁液按照體積比1∶1-3混合，得膽堿氧化酶/碳納米管/殼聚糖復合材料的混合液；

C.ITO雙極電極的表面修飾

用疏水膠帶在所述ITO雙極電極的陽極端上貼一個用于防止修飾材料溶液擴散的矩形區(qū)域，移取10-30微升膽堿氧化酶/碳納米管/殼聚糖溶液滴于矩形區(qū)域表面；將基片置于4℃冰箱內，過夜干燥以形成膽堿氧化酶/碳納米管/殼聚糖復合物薄膜修飾的ITO雙極電極；

3)芯片封合

清洗上述制備的基片和蓋片，將基片上三根ITO雙極電極對準蓋片通道凹槽的中部，然后緊密貼合，得膽堿電化學發(fā)光傳感器芯片。

作為優(yōu)選方案，步驟1)中，PDMS母液中PDMS單體與固化劑的質量比為8∶1-12∶1；PDMS母液脫氣前于4℃環(huán)境下放置5-20min；脫氣時間為20-40min。

作為優(yōu)選方案，步驟1)中，PDMS母液在硅烷化的PDMS陽模上方平衡時間為5-15min。

作為優(yōu)選方案，步驟1)中，PDMS蓋片通道兩端的孔道均為圓形孔道。

作為優(yōu)選方案，步驟2)中，在ITO導電玻璃表面涂正光膠之前，對ITO導電玻璃進行預處理；所述預處理具體為將ITO導電玻璃置于0.8-1.2M NaOH的乙醇溶液中浸泡過夜，之后分別在丙酮、無水乙醇和去離子水中超聲清洗10-20min，將干凈的ITO導電玻璃用氮氣吹干。

作為優(yōu)選方案，步驟2)A中，用膠頭滴管吸取正光膠后均勻滴涂在ITO導電玻璃的導電表面，采用甩膠機在400-600rpm轉速下勻膠，然后在2500-3500rpm轉速下轉動30-50s甩膠；之后將ITO導電玻璃置于105-115℃環(huán)境下烘干，然后于25-30℃的熱板上緩慢冷卻至室溫，形成厚度均勻的正光膠膠層。

作為優(yōu)選方案，步驟2)A中，汞燈曝光的時間為2-6min；將導電玻璃置于硝酸與鹽酸的混合水溶液中刻蝕6-15min，其中，硝酸與鹽酸的混合水溶液中，硝酸、鹽酸與水的質量比為2-3∶4-6∶4-6。

采用所述基于雙極電極陣列的可視化膽堿傳感器檢測膽堿的方法，在蓋片兩端的孔道上分別放置一根鉑絲，作為驅動電極；驅動電極通過直流穩(wěn)壓電源提供驅動電壓；向通道凹槽內注入含有待測膽堿溶液和魯米諾的緩沖溶液；雙極電極表面修飾的膽堿氧化酶催化溶解氧與膽堿反應生成H₂O₂，并在外加電壓的驅動下，與魯米諾發(fā)生電化學發(fā)光，產(chǎn)生的電化學發(fā)光信號通過膽堿電化學發(fā)光傳感器芯片上方的CCD圖像傳感器捕獲；根據(jù)CCD圖像傳感器捕獲的發(fā)光信號強度確定待測膽堿溶液中的膽堿濃度。

作為優(yōu)選方案，向通道凹槽內注入15-30微升含有待測膽堿溶液和魯米諾的緩沖溶液；所述緩沖溶液為PBS緩沖溶液；含有待測膽堿溶液和魯米諾的緩沖溶液中PBS的濃度為0.05-0.15mol/L，pH為7.2-7.5；膽堿的濃度為0.01mM-1mM；魯米諾的濃度為1.2-1.4mmol/L。本發(fā)明檢測所用溶液體積僅為15-30微升，可實現(xiàn)微量檢測，極大的提高了檢測靈敏度，并降低了檢測成本。

作為優(yōu)選方案，所述驅動電壓為4.0-9.0V。電壓過高可能ITO膜會被破壞，因此電壓選擇該范圍。

本發(fā)明的構思是：

以膽堿氧化酶/碳納米管/殼聚糖復合膜修飾的ITO雙極電極為傳感界面，通過微流控芯片系統(tǒng)、鉑絲驅動電極、直流穩(wěn)壓電源和CCD圖像傳感器實現(xiàn)膽堿的可視化電化學發(fā)光檢測。驅動電極通過直流穩(wěn)壓電源提供驅動電壓。向膽堿電化學發(fā)光傳感器芯片通道凹槽內注入待測膽堿溶液和含有魯米諾的緩沖溶液，雙極電極表面修飾的膽堿氧化酶可催化溶解氧與膽堿反應生成H₂O₂，并在外加電壓的驅動下，與魯米諾發(fā)生電化學發(fā)光。產(chǎn)生的電化學發(fā)光信號由傳感芯片上方的CCD圖像傳感器捕獲。在一定范圍內，膽堿濃度越高，酶促反應生成的過氧化氫越多，相應的發(fā)光信號也越強，由此可以實現(xiàn)膽堿的可視化檢測。

本發(fā)明可視化電化學發(fā)光傳感器檢測膽堿的測定原理為：

雙極電極陽極端修飾膜上的催化反應：

膽堿與氧氣在膽堿氧化酶的作用下生成三甲基甘氨酸與雙氧水；

雙極電極陽極端的電化學反應：

Luminol+H₂O₂→3-Aminophthalate+hv

魯米諾與雙氧水反應生成3-氨基-鄰苯二甲酸二甲酯并伴隨發(fā)光；

雙極電極陰極端的電化學反應：

4H₂O+4e^-→2H₂+4OH^-

本發(fā)明基于膽堿氧化酶/碳納米管/殼聚糖修飾電極、雙極電極及微流控芯片技術，利用電化學發(fā)光成像來實現(xiàn)膽堿的可視化檢測。由于雙極電極是一種不需要外部電接觸即可在其末端發(fā)生電化學反應的導電材料，這種特性使其便于進行大量陣列分析，利于大批量生產(chǎn)，從而降低檢測成本。

采用的電化學發(fā)光成像技術具有靈敏度高、光路簡單等優(yōu)點，用于膽堿的可視化檢測，方法簡便、結果直觀。

本發(fā)明中電極修飾材料膽堿氧化酶/碳納米管/殼聚糖，膽堿氧化酶膽堿氧化酶、碳納米管、殼聚糖缺一不可，有膽堿氧化酶才能有催化反應產(chǎn)生過氧化氫，進而和魯米諾發(fā)生發(fā)光反應；碳納米管是為了促進電化學反應，沒有碳納米管電化學反應受阻，所以也沒有光產(chǎn)生；殼聚糖為成膜材料，如果沒有殼聚糖，膽堿氧化酶、碳納米管溶液無法穩(wěn)定地貼在電極表面。

本發(fā)明的有益效果為：

本發(fā)明制備方法簡單方便，膽堿氧化酶/碳納米管/殼聚糖復合膜能使膽堿氧化酶固定在電極表面，有較好成膜性和生物相容性；碳納米管促進電子傳遞作用，殼聚糖促進成膜；該傳感器具有特異性好、靈敏度高、選擇性的優(yōu)點，且所用的材料廉價易得。

開放式雙極電極由于沒有外部電接觸，位于一個微通道中，發(fā)光試劑和被檢測物可混合在一個溶液里，可進行大規(guī)模陣列分析，快速高通量檢測膽堿。

微流控芯片結構簡單，制備簡單，成本低廉，集成微型，利于大批量生產(chǎn)，大大降低檢測成本，有望應用于膽堿試紙的開發(fā)。

電化學發(fā)光成像技術的高靈敏度，時間空間分辨，簡化的光學器件，和視覺成像能力可視化，為檢測膽堿的含量提供了一項靈敏、簡便且直觀的微量檢測方法。

該制備方法可以推廣到其他類型酶，用于其他生化分子的檢測，可開發(fā)出多成分檢測的雙極電極傳感器。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術中的技術方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為本發(fā)明基于雙極電極陣列的可視化膽堿傳感器的裝置及反應原理示意圖；

圖2為本發(fā)明ITO雙電極陣列的結構示意圖；

圖3為本發(fā)明ITO雙電極陣列芯片的加工示意圖

圖4是本發(fā)明膽堿檢測的電化學發(fā)光圖；其中，a對應濃度0mM；b對應濃度0.02mM；c對應濃度0.05mM；d對應濃度0.1mM；e對應濃度0.5mM；f對應濃度1.0mM；g對應濃度2.0mM；h對應濃度5.0mM。

圖5是本發(fā)明膽堿檢測的線性圖。

具體實施方式

實施例1基于雙極電極陣列的可視化膽堿傳感器的制備

如圖1、圖2、圖3所示，一種基于雙極電極陣列的可視化膽堿傳感器的制備方法，包括步驟：

1)制備蓋片

將PDMS單體與固化劑以8∶1-12∶1的質量比混合并攪拌均勻得PDMS母液，將PDMS母液于4℃環(huán)境下放置5-20min，然后脫氣2040min；脫氣后倒在硅烷化的PDMS陽模上方平衡5-15min，然后蓋上保鮮膜，70-80℃加熱固化1-2小時；固化后，將PDMS從硅烷化的PDMS陽模上剝離，剪成3.0cm*1.2cm的蓋片，該蓋片上含有通道凹槽；用14G的平口針頭在PDMS蓋片通道兩端各加工一個直徑為0.5cm的圓形孔道，用于進樣和放置驅動電極；

2)制備基片

A.有三根ITO雙極電極基片的制備

將ITO導電玻璃切割成3.0cm*1.2cm的小片；將切割好的ITO導電玻璃置于0.8-1.2M NaOH的乙醇溶液中浸泡過夜，之后分別在丙酮、無水乙醇和去離子水中超聲清洗10-20min，將干凈的ITO導電玻璃用氮氣吹干；用萬用表確定導電面，導電面朝上置于甩膠機圓盤上；用膠頭滴管吸取AZP4620正光膠后均勻滴涂在ITO導電玻璃的導電表面，在400-600rpm轉速下勻膠，然后在2500-3500rpm轉速下轉動30-50s甩膠；待在ITO導電玻璃的導電表面涂5-15微米厚的紅色光膠層后，將ITO導電玻璃置于105-115℃環(huán)境下烘干，然后于25-30℃的熱板上緩慢冷卻至室溫，形成厚度均勻的正光膠膠層。

將激光照排機繪制好的光刻掩膜與涂有正光膠膠層的ITO導電玻璃緊密貼合，然后進行選擇性汞燈曝光2-6min，曝光后將導電玻璃置于0.5-1wt％的NaOH溶液中顯影至電極圖案完全顯現(xiàn)后取出導電玻璃；在去離子水中清洗除去殘余的顯影液，隨后用吹風機吹干導電玻璃，然后在110℃熱板下烘30min，烘烤結束將熱板溫度調至20-25℃，在熱板上緩慢降至室溫。

繼續(xù)將導電玻璃置于硝酸與鹽酸的混合水溶液(硝酸、鹽酸與水的質量比為2-3∶4-6∶4-6)中刻蝕6-15min，刻蝕完畢后，依次用去離子水、丙酮、去離子水超聲清洗各10min，干燥，得表面刻有三根ITO雙極電極的基片；

B.制備膽堿氧化酶/碳納米管/殼聚糖復合物

殼聚糖溶于0.5-2wt％的醋酸水溶液中，超聲溶解，得5-15mg/mL的殼聚糖溶液，加入多壁碳納米管并超聲分散于殼聚糖溶液中得黑色懸濁液，碳納米管的加入量為1-3mg/mL；取濃度為3-8mg/mL的膽堿氧化酶溶液與所述黑色懸濁液按照體積比1∶1-3混合，超聲溶解，得膽堿氧化酶/碳納米管/殼聚糖復合材料的混合液，4℃保存；

C.ITO雙極電極的表面修飾

用疏水膠帶在所述ITO雙極電極的陽極端上貼一個用于防止修飾材料溶液擴散的矩形區(qū)域，移取10-30微升膽堿氧化酶/碳納米管/殼聚糖溶液滴于矩形區(qū)域表面；將芯片置于4℃冰箱內，過夜干燥以形成膽堿氧化酶/碳納米管/殼聚糖復合物薄膜修飾的ITO雙極電極；

3)芯片封合

將修飾好的蓋片和基片分別置于等離子體清洗室內，各處理90秒和25秒。將基片上三根ITO雙極電極對準蓋片通道凹槽的中部，然后緊密貼合，得膽堿電化學發(fā)光傳感器芯片。

實施例2基于雙極電極陣列的可視化膽堿傳感器用于膽堿的檢測

采用基于雙極電極陣列的可視化膽堿傳感器檢測膽堿的方法，在蓋片兩端的孔道上分別放置一根鉑絲，作為驅動電極；驅動電極通過直流穩(wěn)壓電源提供8V的驅動電壓；向通道凹槽內注入20微升含有待測膽堿溶液和魯米諾的緩沖溶液，其中，PBS的濃度為0.01mol/L，pH為7.4，膽堿的濃度為0.02mM-5mM，魯米諾的濃度為1.3mmol/L；雙極電極表面修飾的膽堿氧化酶催化溶解氧與膽堿反應生成H₂O₂，并在外加電壓的驅動下，與魯米諾發(fā)生電化學發(fā)光，產(chǎn)生的電化學發(fā)光信號通過膽堿電化學發(fā)光傳感器芯片上方的CCD圖像傳感器捕獲；根據(jù)CCD圖像傳感器捕獲的發(fā)光信號強度確定待測膽堿溶液中的膽堿濃度。

分別對0mM、0.02mM、0.05mM、0.1mM、0.5mM、1.0mM、2.0mM和5.0mM系列濃度的膽堿進行檢測，檢測結果如圖4和圖5所示；本發(fā)明方法檢測膽堿的最低檢出限為43.19μM；隨著膽堿濃度的升高，發(fā)光圖像的灰度值也逐漸增大。通過線性擬合可知，灰度值與膽堿濃度在0.02-5.0mM范圍內有著良好的線性關系。所得擬合方程為：

G＝1022+212.2[choline](mM)(R＝0.9924)。

以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，對于本領域的技術人員倆說，其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內，所做的任何修改、等同替換。改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。