本發(fā)明屬于分析化學(xué)及臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及與特發(fā)性男性不育相關(guān)的尿液雌激素代謝物標(biāo)志物及其基于UPLC-Q exactive MS的檢測(cè)方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

目前，全球約有10-15％的育齡夫婦患有生育障礙。我國(guó)由于人口基數(shù)大，新婚夫婦中不孕不育的患者人數(shù)遠(yuǎn)超過百萬，其中男性因素導(dǎo)致的不育高于50％。男性不育中目前仍有約40％～75％找不到原因，稱為特發(fā)性男性不育癥。特發(fā)性男性不育造成了極為嚴(yán)重的疾病負(fù)擔(dān)。

事實(shí)上，特發(fā)性男性不育診斷存在很大難度。男性不育的WHO的診斷標(biāo)準(zhǔn)是夫妻婚后同居1年以上，未采取避孕措施，由于男方原因造成女方不孕者。然而，由于現(xiàn)實(shí)原因很多夫妻并不能保證嚴(yán)格的同居1年，使得最后的男性不育判斷變得非常困難；同居長(zhǎng)達(dá)1年的觀察時(shí)間，大大耽誤了對(duì)男性不育進(jìn)行早期治療和干預(yù)的時(shí)間；為了排除女方原因，女方還需要進(jìn)行詳細(xì)的檢查，帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)和醫(yī)療負(fù)擔(dān)。現(xiàn)有的男性不育相關(guān)檢查依賴的是傳統(tǒng)的精液常規(guī)檢查，它只關(guān)注精子數(shù)量、運(yùn)動(dòng)度、精液量、pH和液化時(shí)間等常規(guī)參數(shù)。因?yàn)槭艿浇麜r(shí)間等因素的影響，常規(guī)精液參數(shù)常規(guī)分析結(jié)果表現(xiàn)為較大的波動(dòng)性。因而，臨床診斷往往需要參考多次精液常規(guī)分析，給醫(yī)生和患者帶來了負(fù)擔(dān)。更為重要的是，傳統(tǒng)的精液參數(shù)檢查不能全面地反應(yīng)精液的全部狀況。因此，男性不育經(jīng)常表現(xiàn)為常規(guī)精液參數(shù)無明顯異常，也使得傳統(tǒng)的精液參數(shù)檢查并不能有效診斷男性不育。因而，臨床上亟需用于特發(fā)性男性不育的新的診斷方法。

代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)、蛋白組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)之后一門新興的組學(xué)技術(shù)，它是通過高通量考察生物體系在遺傳改變和/或環(huán)境改變后代謝產(chǎn)物的變化研究生物體系的一門科學(xué)。代謝組學(xué)研究具有“無偏”、“全局”、“無假設(shè)”、“由數(shù)據(jù)驅(qū)動(dòng)假設(shè)”的特點(diǎn)，因而研究的結(jié)論往往具有較高的可靠性和創(chuàng)新性。代謝組學(xué)可以系統(tǒng)性回顧、分析和探索細(xì)胞、組織和器官產(chǎn)生的小分子生物標(biāo)記物及其變化情況，更加直觀地了解功能表型改變的物質(zhì)基礎(chǔ)，其對(duì)象涉及脂代謝、糖代謝、氨基酸代謝、核酸代謝、輔酶代謝等生物體的代謝網(wǎng)絡(luò)，是比基因組學(xué)、蛋白組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)更接近“表型”的組學(xué)。代謝組學(xué)由于其分析的樣本可以為尿液這些無創(chuàng)的樣本，可大大減少病人采樣的創(chuàng)傷。代謝組學(xué)在復(fù)雜疾病的診斷中表現(xiàn)出極高的應(yīng)用潛力和價(jià)值，具有靈敏度高且穩(wěn)定的特點(diǎn)。代謝組學(xué)通過對(duì)機(jī)體的整體代謝組分進(jìn)行分析研究，從中找出特異性生物標(biāo)志物，可對(duì)臨床疾病進(jìn)行及時(shí)、準(zhǔn)確、高靈敏度和高特異性的診斷。目前代謝組學(xué)在疾病的診斷方面主要應(yīng)用于冠心病、肝臟疾病、糖尿病、高血壓、肥胖和腫瘤。值得注意的是，尿液是臨床上容易獲得的生物樣本，具有無創(chuàng)、體積大的優(yōu)點(diǎn)。特別適合疾病的診斷和篩查。然而，采用代謝組學(xué)分析尿液代謝小分子在特發(fā)性男性不育的診斷監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用還未得到相應(yīng)的關(guān)注。

目前常見的代謝組學(xué)檢測(cè)平臺(tái)主要包括核磁共振(NMR)、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS)、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS)和毛細(xì)管電泳串聯(lián)質(zhì)譜(CE-MS)。核磁共振雖然是化學(xué)物定性的金標(biāo)準(zhǔn)，但存在靈敏度低的缺點(diǎn)，難以獲得較為完整的代謝譜。串聯(lián)質(zhì)譜具有靈敏度高和定性準(zhǔn)確的優(yōu)勢(shì)。但是，氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜只限于檢測(cè)易揮發(fā)的物質(zhì)，檢測(cè)范圍不能覆蓋代謝譜的要求。為了彌補(bǔ)該缺陷，氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜往往采用衍生化的方法檢測(cè)化學(xué)物，這使得前處理方法變得復(fù)雜，引入更多的誤差。同時(shí)，氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)由于分離技術(shù)的限制，一般檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，延長(zhǎng)了實(shí)驗(yàn)周期，增加了儀器占用率，限制了其在大樣本人群檢測(cè)中的應(yīng)用。毛細(xì)管電泳串聯(lián)質(zhì)譜，對(duì)極性化合物的分離檢測(cè)具有優(yōu)勢(shì)，但儀器穩(wěn)定性的問題較難解決。而液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜具有樣本處理簡(jiǎn)單，靈敏度高，臨床實(shí)用性強(qiáng)的特點(diǎn)，可以很好地解決上述問題。UPLC-Q exactive MS是新一代高分辨質(zhì)譜與超高效液相的組合，具有相比傳統(tǒng)LC-MS更強(qiáng)的靈敏度、特異度和穩(wěn)定性。故而采用UPLC-Q exactive MS進(jìn)行尿液代謝小分子的代謝組學(xué)分析，若能發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定的與特發(fā)性男性不育發(fā)病相關(guān)的特異尿液代謝小分子作為生物標(biāo)志物，并研發(fā)相應(yīng)的代謝小分子標(biāo)志的UPLC-Q exactive MS檢測(cè)方法，不僅在該領(lǐng)域處于國(guó)際領(lǐng)先地位，還可創(chuàng)造令人矚目的經(jīng)濟(jì)效益，對(duì)提高我國(guó)男性生殖健康水平也將是一次強(qiáng)有力的推動(dòng)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種與特發(fā)性男性不育相關(guān)的尿液雌激素代謝物標(biāo)志物。

本發(fā)明另一個(gè)目的是提供上述尿液雌激素代謝物標(biāo)志物的檢測(cè)方法。

本發(fā)明再有一個(gè)目的是提供檢測(cè)上述尿液雌激素代謝物標(biāo)志物的試劑盒。

本發(fā)明的目的是通過下列技術(shù)措施實(shí)現(xiàn)的：

與特發(fā)性男性不育相關(guān)的尿液雌激素代謝物標(biāo)志物，該標(biāo)志物為尿液雌激素代謝物2-甲氧雌二醇和/或雄烯二酮。

所述的尿液雌激素代謝物標(biāo)志物在制備特發(fā)性男性不育診斷或監(jiān)測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。

一種診斷或監(jiān)測(cè)特發(fā)性男性不育的試劑盒，該試劑盒含有檢測(cè)尿液雌激素代謝物2-甲氧雌二醇和/或雄烯二酮的試劑。

所述的試劑盒，該試劑盒含有采用UPLC-Q exactive MS方法檢測(cè)尿液雌激素代謝物2-甲氧雌二醇和/或雄烯二酮的試劑。

所述的試劑盒，該試劑盒含有下列試劑：

2-甲氧雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品；

雄烯二酮標(biāo)準(zhǔn)品；

內(nèi)標(biāo)A：肌酐、纈氨酸、煙酸、胸腺嘧啶、戊二酸、L-苯基丙胺酸、N-乙酰對(duì)氨基酚、馬尿酸一種或多種物質(zhì)的同位素內(nèi)標(biāo)(氘標(biāo)，水溶液)；

內(nèi)標(biāo)B：十五烷酸的同位素內(nèi)標(biāo)(氘標(biāo)，甲醇溶液)；

內(nèi)標(biāo)C：二十四烷酸的同位素內(nèi)標(biāo)(氘標(biāo)，甲醇溶液)；

進(jìn)一步，該試劑盒還含有：

Hypersil GOLD C18色譜柱；

試劑A：100％甲醇(沉淀蛋白用)；

試劑B：含0.1％的甲酸的水(流動(dòng)相用)；

試劑C：含0.1％的甲酸的乙腈(流動(dòng)相用)；

試劑D：100％超純水(復(fù)溶用)。

一種檢測(cè)上述的與特發(fā)性男性不育相關(guān)的尿液雌激素代謝物標(biāo)志物的方法，其特征在于該方法采用UPLC-Q exactive MS方法，檢測(cè)尿液雌激素代謝物2-甲氧雌二醇和/或雄烯二酮的含量。

該方法中：

一、液相條件：

液相色譜柱為Hypersil GOLD C18色譜柱(100mm×2.1mm，粒徑1.9μm Thermo Scientific,Germany)，柱溫為40℃。

流動(dòng)相A為含0.1％甲酸的水，流動(dòng)相B為含0.1％甲酸的乙腈，流速為400μL/min；

儀器梯度為：0-3min 1％B，3-10min 1％到99％B，10-13min 99％B，13-13.1min 99％到1％B，13.1-17min 1％B；(B指流動(dòng)相B，各梯度中流動(dòng)相A的量與對(duì)應(yīng)的流動(dòng)相B的量共100％，下同)

進(jìn)樣方式：體積5μl；

二、質(zhì)譜條件

采用加熱電噴霧電離方式(HESI)，正離子模式噴霧電壓：3.5kV；負(fù)離子模式噴霧電壓：2.5kV；兩種模式下毛細(xì)管溫度：250℃，加熱器溫度：425℃，鞘氣氣流：50AU，輔助氣氣流：13AU，反吹氣氣流：0AU；透鏡電壓：60V。采用全掃模式，掃描范圍：70到1050m/z；分辨率：70000。

本發(fā)明詳細(xì)描述如下：

本發(fā)明人以標(biāo)準(zhǔn)操作程序(SOP)采集符合標(biāo)準(zhǔn)的尿液樣本，系統(tǒng)收集完整的人群基礎(chǔ)信息和臨床資料，并采用了基于UPLC-Q exactive MS的代謝組學(xué)方法進(jìn)行分析。

具體來說研究的實(shí)驗(yàn)方法主要包括以下幾個(gè)部分：

一、研究對(duì)象選擇和分組依據(jù)

第一階段：篩選階段

隨機(jī)納入明確診斷的特發(fā)性男性不育607人和健康對(duì)照430人，共1037人。

A組：健康對(duì)照組(430人)：

1.年齡在19至39歲之間；

2.體質(zhì)指數(shù)在17至31之間；

3.生殖能力健康的男性，而且5-8個(gè)月后有了健康的后代；

4.無全身重大疾病。

B組：特發(fā)性男性不育疾病組(607人)：

1.年齡與對(duì)照組匹配；

2.體質(zhì)指數(shù)與對(duì)照組匹配

3.嘗試懷孕12個(gè)月沒有成功，而配偶沒有不孕疾病的男性；。

4.無明確男性不育病因；

5.吸煙飲酒史與對(duì)照組匹配；

6.民族與對(duì)照組匹配；

7.無全身重大疾病。

第二階段：驗(yàn)證階段

納入明確診斷的特發(fā)性男性不育15人和健康對(duì)照15人，共30人。

A組：健康對(duì)照組(15人)：

1.年齡在24到36歲之間；

2.體質(zhì)指數(shù)在19至24之間；

3.生殖能力健康的男性，而且5-8個(gè)月后有了健康的后代；

4.無全身重大疾病。

B組：特發(fā)性男性不育疾病組(15人)：

1.年齡與對(duì)照組匹配；

2.體質(zhì)指數(shù)與對(duì)照組匹配；

3.嘗試懷孕12個(gè)月沒有成功，而配偶沒有不孕疾病的男性；

4.無明確男性不育病因；

5.吸煙飲酒史與對(duì)照組匹配；

6.民族與對(duì)照組匹配；

7.無全身重大疾病。

二、UPLC-Q exactive MS代謝組學(xué)分析和特發(fā)性男性不育診斷用雌激素代謝物篩選和驗(yàn)證

1.樣本前處理

1.取300μL尿液、加入10μL內(nèi)標(biāo)A，加入10μL內(nèi)標(biāo)B，加入10μL內(nèi)標(biāo)C，加入甲醇900μL(試劑A)，渦旋30s。

2.離心機(jī)中4℃16000g離心15min，將上清液轉(zhuǎn)移至1.5mL進(jìn)口EP管，并將上清液在室溫條件下于離心濃縮干燥儀中濃縮至干。

3.用10μL超純水(試劑D)復(fù)溶，待分析。

2.儀器檢測(cè)

1.分析儀器：UPLC Ultimate 3000system(Dionex)高效液相色譜儀；Q-Exactive高分辨質(zhì)譜儀。

2.液相條件：

2.1.液相色譜柱為Hypersil GOLD C18色譜柱(100mm×2.1mm，粒徑1.9μm，Thermo Scientific，Germany)，柱溫為40℃。

2.2采用的流動(dòng)相為(A)含0.1％甲酸的水(試劑B)和(B)含0.1％甲酸的乙腈(試劑C)，流速為400μL/min。

2.3儀器梯度為：儀器梯度為：0-3min 1％B，3-10min 1％到99％B，10-13min 99％B，13-13.1min 99％到1％B，13.1-17min 1％B。

2.4進(jìn)樣方式：體積5μl。

3.質(zhì)譜條件

3.1加熱電噴霧電離方式(HESI)進(jìn)行分析。

3.2采用加熱電噴霧電離方式(HESI)，正離子模式噴霧電壓：3.5kV；負(fù)離子模式噴霧電壓：2.5kV；兩種模式下毛細(xì)管溫度：250℃，加熱器溫度：425℃，鞘氣氣流：50AU，輔助氣氣流：13AU，反吹氣氣流：0AU；透鏡電壓：60V。采用全掃模式，掃描范圍：70到1050m/z；分辨率：70000。

3.物質(zhì)定性

雌激素代謝物定性采用與標(biāo)準(zhǔn)品2-甲氧雌二醇和雄烯二酮比對(duì)色譜信息(保留時(shí)間)和質(zhì)譜信息(精確分子量)，并實(shí)時(shí)比對(duì)樣本中同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品系列的色譜信息以校正保留時(shí)間。

4.數(shù)據(jù)分析：

生物標(biāo)志物篩選采用多元Logistic回歸確認(rèn)關(guān)鍵代謝物。

5.健康對(duì)照組、特發(fā)性男性不育組尿液樣本中雌激素代謝物的差異和診斷意義。

經(jīng)過校正年齡、體質(zhì)指數(shù)、吸煙和飲酒史的信息，多元Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)尿液2-甲氧雌二醇和雄烯二酮的含量增加顯著提高了特發(fā)性男性不育的發(fā)生。采用隨機(jī)人群應(yīng)用上述雌激素代謝物組合診斷特發(fā)性男性不育，靈敏度為93.33％，特異度為93.33％，ROC曲線下面積為0.9867，具有較高的輔助診斷價(jià)值。

三、診斷試劑盒制備方法

根據(jù)上述一系列實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本發(fā)明人還制備了一種診斷或監(jiān)測(cè)特發(fā)性男性不育的試劑盒，所述診斷試劑盒包含測(cè)定受試者尿液中穩(wěn)定存在且可檢測(cè)的2-甲氧雌二醇和雄烯二酮的標(biāo)準(zhǔn)品以及輔助分析的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品系列。診斷試劑盒還可以包括一套尿液雌激素代謝物提取及色譜分離用試劑及器材。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明人通過采用UPLC-Q exactive MS比較正常對(duì)照和特發(fā)性男性不育尿液中的代謝小分子，發(fā)現(xiàn)了尿液中存在可用于評(píng)估是否患有特發(fā)性男性不育，具有輔助診斷價(jià)值的尿液雌激素代謝物標(biāo)志物組合，以及該雌激素代謝物標(biāo)志物檢測(cè)的UPLC-Q exactive MS的應(yīng)用，研制出可便于臨床應(yīng)用的特發(fā)性男性不育診斷、監(jiān)測(cè)試劑盒。

本發(fā)明采用尿液代謝小分子作為特發(fā)性男性不育評(píng)價(jià)的標(biāo)志物的優(yōu)越性在于：

(1)尿液代謝小分子是一種新型生物標(biāo)志物，其與疾病結(jié)局關(guān)聯(lián)強(qiáng)，不僅穩(wěn)定、無創(chuàng)、易于檢測(cè)，且定量精確，將大大提高特發(fā)性男性不育診斷的敏感性和特異性，該類小分子生物標(biāo)志物的成功開發(fā)將為特發(fā)性男性不育的防治開創(chuàng)全新局面，為其他疾病生物標(biāo)志物的研制提供借鑒。

(2)本發(fā)明提供的尿液代謝小分子標(biāo)志物可用作特發(fā)性男性不育的診斷標(biāo)志物，可在體檢人群中明確特發(fā)性男性不育的患病情況，從而為臨床醫(yī)生進(jìn)一步深入檢查提供依據(jù)，為快速準(zhǔn)確掌握患者的疾病狀態(tài)和病情嚴(yán)重程度、及時(shí)采取更具個(gè)性化的防治方案提供支持，延緩和阻止疾病進(jìn)展。

(3)本發(fā)明采用特發(fā)性男性不育和健康對(duì)照隨機(jī)人群的尿液樣本進(jìn)行驗(yàn)證，證明了尿液中2-甲氧雌二醇和雄烯二酮水平在診斷特發(fā)性男性不育中具有較高靈敏度和特異度，可作為標(biāo)志物使用。

(4)本發(fā)明采用嚴(yán)密、多階段的驗(yàn)證和評(píng)價(jià)體系，初期通過預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選多種尿液代謝小分子，應(yīng)用UPLC-Q exactive MS進(jìn)行獨(dú)立人群驗(yàn)證，保證了該尿液代謝生物標(biāo)志物和診斷方法的可靠性。

(5)UPLC-Q exactive MS技術(shù)樣本處理簡(jiǎn)單，儀器分析迅速準(zhǔn)確，具有較高的臨床診斷實(shí)用價(jià)值。

附圖說明

圖1篩選階段，經(jīng)過校正年齡、體質(zhì)指數(shù)、吸煙和飲酒史的信息，多元Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)尿液2-甲氧雌二醇和雄烯二酮的含量增加顯著提高了特發(fā)性男性不育的發(fā)生。^a未調(diào)整混雜因素的單因素Logistic回歸結(jié)果。^b調(diào)整年齡、體質(zhì)指數(shù)、吸煙和飲酒史后的多元Logistic回歸結(jié)果。

圖2雌激素代謝物檢測(cè)水平波動(dòng)性(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)。

圖3驗(yàn)證階段，采用尿液2-甲氧雌二醇含量信息制作的正常對(duì)照組和特發(fā)性男性不育組之間的ROC曲線。

圖4驗(yàn)證階段，采用尿液雄烯二酮含量信息制作的正常對(duì)照組和特發(fā)性男性不育組之間的ROC曲線。

圖5驗(yàn)證階段，采用尿液2-甲氧雌二醇和雄烯二酮含量信息制作的正常對(duì)照組和特發(fā)性男性不育組之間的ROC曲線。

具體實(shí)施方式

以下通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述。

實(shí)施例1研究對(duì)象選擇和分組依據(jù)

本部分研究對(duì)象來自南京醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院的首診特發(fā)性男性不育病例及健康生育對(duì)照。研究?jī)?nèi)容和知情同意書均得到南京醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，符合相關(guān)法規(guī)的要求。病例和對(duì)照在了解內(nèi)容后簽署了知情同意書。所有研究對(duì)象均進(jìn)行了完整的體格檢查，并完成了一份包括個(gè)人基礎(chǔ)資料、生活習(xí)慣、職業(yè)和環(huán)境暴露、遺傳危險(xiǎn)因素、性功能與生殖功能、疾病史和體力活動(dòng)的調(diào)查問卷。第一階段納入了符合要求的607例特發(fā)性男性不育病例和430例健康對(duì)照；第二階段符合要求的15例特發(fā)性男性不育病例和15例健康對(duì)照作為特發(fā)性男性不育尿液代謝小分子生物標(biāo)志物的篩選實(shí)驗(yàn)對(duì)象。具體的樣品歸類標(biāo)準(zhǔn)如下：

第一階段 篩選階段

隨機(jī)納入明確診斷的特發(fā)性男性不育607人和健康對(duì)照430人，共1037人。

A組：健康對(duì)照組(430人)：

1.年齡在19至39歲之間；

2.體質(zhì)指數(shù)在17至31之間；

3.生殖能力健康的男性，而且5-8個(gè)月后有了健康的后代；

4.無全身重大疾病。

B組：特發(fā)性男性不育疾病組(607人)：

1.年齡與對(duì)照組匹配；

2.體質(zhì)指數(shù)與對(duì)照組匹配

3.嘗試懷孕12個(gè)月沒有成功，而配偶沒有不孕疾病的男性；。

4.無明確男性不育病因；

5.吸煙飲酒史與對(duì)照組匹配；

6.民族與對(duì)照組匹配；

7.無全身重大疾病。

第二階段 驗(yàn)證階段

納入明確診斷的特發(fā)性男性不育15人和健康對(duì)照15人，共30人。

A組：健康對(duì)照組(15人)：

1.年齡在24到36歲之間；

2.體質(zhì)指數(shù)在19至24之間；

3.生殖能力健康的男性，而且5-8個(gè)月后有了健康的后代；

4.無全身重大疾病。

B組：特發(fā)性男性不育疾病組(15人)：

1.年齡與對(duì)照組匹配；

2.體質(zhì)指數(shù)與對(duì)照組匹配；

3.嘗試懷孕12個(gè)月沒有成功，而配偶沒有不孕疾病的男性；

4.無明確男性不育病因；

5.吸煙飲酒史與對(duì)照組匹配；

6.民族與對(duì)照組匹配；

7.無全身重大疾病。

實(shí)施例2：UPLC-MS代謝組學(xué)特發(fā)性男性不育生物標(biāo)志物篩選

1.樣本前處理

1.取300μL尿液、加入10μL內(nèi)標(biāo)A，加入10μL內(nèi)標(biāo)B，加入10μL內(nèi)標(biāo)C，加入甲醇900μL(試劑A)，渦旋30s。

2.離心機(jī)中4℃16000g離心15min，將上清液轉(zhuǎn)移至1.5mL進(jìn)口EP管，并將上清液在室溫條件下于離心濃縮干燥儀中濃縮至干。

3.用10μL超純水(試劑D)復(fù)溶，待分析。

2.儀器檢測(cè)

1.分析儀器：UPLC Ultimate 3000system(Dionex)高效液相色譜儀；Q-Exactive高分辨質(zhì)譜儀。

2.液相條件：

2.1.液相色譜柱為Hypersil GOLD C18色譜柱(100mm×2.1mm，粒徑1.9μm，Thermo Scientific，Germany)，柱溫為40℃。

2.2采用的流動(dòng)相為(A)含0.1％甲酸的水(試劑B)和(B)含0.1％甲酸的乙腈(試劑C)，流速為400μL/min。

2.3儀器梯度為：儀器梯度為：0-3min 1％B，3-10min 1％到99％B，10-13min 99％B，13-13.1min 99％到1％B，13.1-17min 1％B。

2.4進(jìn)樣方式：體積5μl。

3.質(zhì)譜條件

3.1加熱電噴霧電離方式(HESI)進(jìn)行分析。

3.2采用加熱電噴霧電離方式(HESI)，正離子模式噴霧電壓：3.5kV；負(fù)離子模式噴霧電壓：2.5kV；兩種模式下毛細(xì)管溫度：250℃，加熱器溫度：425℃，鞘氣氣流：50AU，輔助氣氣流：13AU，反吹氣氣流：0AU；透鏡電壓：60V。采用全掃模式，掃描范圍：70到1050m/z；分辨率：70000。

3.物質(zhì)定性

雌激素代謝物定性采用與標(biāo)準(zhǔn)品2-甲氧雌二醇和雄烯二酮比對(duì)色譜信息(保留時(shí)間)和質(zhì)譜信息(精確分子量)，并實(shí)時(shí)比對(duì)樣本中同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品系列的色譜信息以校正保留時(shí)間。

4.數(shù)據(jù)分析：

生物標(biāo)志物篩選采用多元Logistic回歸確認(rèn)關(guān)鍵代謝物。

5.健康對(duì)照組、特發(fā)性男性不育組尿液樣本中雌激素代謝物的差異和診斷意義。

經(jīng)過校正年齡、體質(zhì)指數(shù)、吸煙和飲酒史的信息，多元Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)尿液2-甲氧雌二醇和雄烯二酮的含量增加顯著提高了特發(fā)性男性不育的發(fā)生(圖1)。

實(shí)施例3尿液雌激素代謝物的穩(wěn)定性分析

采用實(shí)施例2的方法對(duì)尿液2-甲氧雌二醇和雄烯二酮水平的穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)(間隔時(shí)間為2周)。結(jié)果顯示，尿液中2-甲氧雌二醇和雄烯二酮測(cè)定水平穩(wěn)定(圖2)，具備作為診斷/監(jiān)測(cè)標(biāo)志物的特性。

實(shí)施例4雌激素代謝物組合對(duì)特發(fā)性男性不育的診斷

根據(jù)上述UPLC-Q exactive MS代謝組學(xué)方法，本發(fā)明人通過對(duì)隨機(jī)人群15病例和15對(duì)照的尿液樣品檢測(cè)2-甲氧雌二醇和雄烯二酮，以此繪制ROC曲線并評(píng)估診斷的靈敏性和特異性，進(jìn)而評(píng)估檢測(cè)尿液中這2個(gè)雌激素代謝物水平對(duì)特發(fā)性男性不育的評(píng)估能力。

2-甲氧雌二醇的靈敏度為86.67％，特異度為80.00％，ROC曲線下面積為0.9022(圖3)；

雄烯二酮靈敏度為86.67％，特異度為86.67％，ROC曲線下面積為0.93333(圖4)；

組合2-甲氧雌二醇和雄烯二酮的靈敏度為93.33％，特異度為93.33％，ROC曲線下面積為0.9867(圖5)。

故而組合2-甲氧雌二醇和雄烯二酮具有較好地診斷特發(fā)性男性不育的能力。

實(shí)施例5用于特發(fā)性男性不育尿液雌激素代謝物檢測(cè)和診斷試劑盒的制作

首先通過UPLC-Q exactive MS的方法確定正常對(duì)照和特發(fā)性男性不育尿液中具有較高豐度的代謝小分子。然后，在其中通過基于UPLC-Q exactive MS的代謝組學(xué)技術(shù)篩選與特發(fā)性男性不育相關(guān)的雌激素代謝物，作為是否為特發(fā)性男性不育的診斷指標(biāo)。最后將篩選出的對(duì)應(yīng)尿液雌激素代謝物的數(shù)量控制在2個(gè)，這是在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上做出的最優(yōu)化的精簡(jiǎn)。采用這2個(gè)雌激素代謝物，既可以保障較好的靈敏度與特異度，又能節(jié)省成本，減輕患者的負(fù)擔(dān)，還能減少檢測(cè)時(shí)間，具有快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)的優(yōu)點(diǎn)，便于臨床推廣使用，當(dāng)然采用其中1個(gè)標(biāo)志物也可以，采用2個(gè)標(biāo)志物效果更好。此試劑盒包括一批尿液雌激素代謝物檢測(cè)用試劑和耗材，其中雌激素代謝物的定性和定量采用2-甲氧雌二醇和雄烯二酮的標(biāo)準(zhǔn)品，輔助分析采用內(nèi)標(biāo)A：肌酐、纈氨酸、煙酸、胸腺嘧啶、戊二酸、L-苯基丙胺酸、N-乙酰對(duì)氨基酚、馬尿酸八種物質(zhì)的氘標(biāo)同位素內(nèi)標(biāo)。內(nèi)標(biāo)B：十五烷酸的氘標(biāo)同位素內(nèi)標(biāo)。內(nèi)標(biāo)C：二十四烷酸的氘標(biāo)同位素內(nèi)標(biāo)。其它還有用于UPLC色譜分離的配套反向色譜柱(Hypersil GOLD C18色譜柱，100mm×2.1mm，粒徑1.9μm)、用于流動(dòng)相的試劑(含0.1％的甲酸的水和含0.1％的甲酸的乙腈)，用于提取雌激素代謝物的試劑(100％超純水)。此試劑盒的價(jià)值在于只需要300μl尿液，即可檢測(cè)尿液雌激素代謝物標(biāo)志物的含量，再通過含量診斷特發(fā)性男性不育，并易于進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)和觀察治療效果。

具體試劑盒組成如下：

2-甲氧雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品

雄烯二酮標(biāo)準(zhǔn)品

內(nèi)標(biāo)A：肌酐、纈氨酸、煙酸、胸腺嘧啶、戊二酸、L-苯基丙胺酸、N-乙酰對(duì)氨基酚、馬尿酸八種物質(zhì)的氘標(biāo)同位素內(nèi)標(biāo)

內(nèi)標(biāo)B：十五烷酸的氘標(biāo)同位素內(nèi)標(biāo)

內(nèi)標(biāo)C：二十四烷酸的氘標(biāo)同位素內(nèi)標(biāo)

進(jìn)一步，還可以含有：

色譜柱(Thermo 100mm×2.1mm，粒徑1.9μm，Hypersil GOLD C18色譜柱)

試劑A(含100％甲醇)

試劑B(含0.1％的甲酸的水)

試劑C(含0.1％的甲酸的乙腈)

試劑D(100％超純水)。

主要參考文獻(xiàn)

Asiago,V.M.,L.Z.Alvarado,N.Shanaiah,G.A.Gowda,K.Owusu-Sarfo,R.A.Ballas,and D.Raftery.2010.Early detection of recurrent breast cancer using metabolite profiling.Cancer Res 70:8309-8318.

Brindle,J.T.,H.Antti,E.Holmes,G.Tranter,J.K.Nicholson,H.W.Bethell,S.Clarke,P.M.Schofield,E.McKilligin,D.E.Mosedale,and D.J.Grainger.2002.Rapid and noninvasive diagnosis of the presence and severity of coronary heart disease using 1H-NMR-based metabonomics.Nat Med 8:1439-1444.

Dunn,W.B.,D.I.Broadhurst,H.J.Atherton,R.Goodacre,and J.L.Griffin.2011.Systems level studies of mammalian metabolomes:the roles of mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy.Chemical Society reviews 40:387-426.

Glinski,M.,and W.Weckwerth.2006.The role of mass spectrometry in plant systems biology.Mass spectrometry reviews 25:173-214.

Godin,J.P.,L.B.Fay,and G.Hopfgartner.2007.Liquid chromatography combined with mass spectrometry for 13C isotopic analysis in life science research.Mass spectrometry reviews 26:751-774.

Locasale,J.W.,A.R.Grassian,T.Melman,C.A.Lyssiotis,K.R.Mattaini,A.J.Bass,G.Heffron,C.M.Metallo,T.Muranen,H.Sharfi,A.T.Sasaki,D.Anastasiou,E.Mullarky,N.I.Vokes,M.Sasaki,R.Beroukhim,G.Stephanopoulos,A.H.Ligon,M.Meyerson,A.L.Richardson,L.Chin,G.Wagner,J.M.Asara,J.S.Brugge,L.C.Cantley,and M.G.Vander Heiden.2011.Phosphoglycerate dehydrogenase diverts glycolytic flux and contributes to oncogenesis.Nat Genet 43:869-874.

Munger,J.,B.D.Bennett,A.Parikh,X.J.Feng,J.McArdle,H.A.Rabitz,T.Shenk,and J.D.Rabinowitz.2008.Systems-level metabolic flux profiling identifies fatty acid synthesis as a target for antiviral therapy.Nat Biotechnol 26:1179-1186.

Nicholson,J.K.,J.Connelly,J.C.Lindon,and E.Holmes.2002.Metabonomics:a platform for studying drug toxicity and gene function.Nat Rev Drug Discov 1:153-161.

Soga,T.,M.Sugimoto,M.Honma,M.Mori,K.Igarashi,K.Kashikura,S.Ikeda,A.Hirayama,T.Yamamoto,H.Yoshida,M.Otsuka,S.Tsuji,Y.Yatomi,T.Sakuragawa,H.Watanabe,K.Nihei,T.Saito,S.Kawata,H.Suzuki,M.Tomita,and M.Suematsu.2011.Serum metabolomics reveals gamma-glutamyl dipeptides as biomarkers for discrimination among different forms of liver disease.Journal of hepatology 55:896-905.

Sreekumar,A.,L.M.Poisson,T.M.Rajendiran,A.P.Khan,Q.Cao,J.Yu,B.Laxman,R.Mehra,R.J.Lonigro,Y.Li,M.K.Nyati,A.Ahsan,S.Kalyana-Sundaram,B.Han,X.Cao,J.Byun,G.S.Omenn,D.Ghosh,S.Pennathur,D.C.Alexander,A.Berger,J.R.Shuster,J.T.Wei,S.Varambally,C.Beecher,and A.M.Chinnaiyan.2009.Metabolomic profiles delineate potential role for sarcosine in prostate cancer progression.Nature 457:910-914.

Suhre,K.,S.Y.Shin,A.K.Petersen,R.P.Mohney,D.Meredith,B.Wagele,E.Altmaier,P.Deloukas,J.Erdmann,E.Grundberg,C.J.Hammond,M.H.de Angelis,G.Kastenmuller,A.Kottgen,F.Kronenberg,M.Mangino,C.Meisinger,T.Meitinger,H.W.Mewes,M.V.Milburn,C.Prehn,J.Raffler,J.S.Ried,W.Romisch-Margl,N.J.Samani,K.S.Small,H.E.Wichmann,G.Zhai,T.Illig,T.D.Spector,J.Adamski,N.Soranzo,and C.Gieger.2011.Human metabolic individuality in biomedical and pharmaceutical research.Nature 477:54-60.

Wang,J.,P.Alexander,L.Wu,R.Hammer,O.Cleaver,and S.L.McKnight.2009.Dependence of mouse embryonic stem cells on threonine catabolism.Science 325:435-439.

Wang,T.J.,M.G.Larson,R.S.Vasan,S.Cheng,E.P.Rhee,E.McCabe,G.D.Lewis,C.S.Fox,P.F.Jacques,C.Fernandez,C.J.O'Donnell,S.A.Carr,V.K.Mootha,J.C.Florez,A.Souza,O.Melander,C.B.Clish,and R.E.Gerszten.2011a.Metabolite profiles and the risk of developing diabetes.Nat Med 17:448-453.

Wang,Z.,E.Klipfell,B.J.Bennett,R.Koeth,B.S.Levison,B.Dugar,A.E.Feldstein,E.B.Britt,X.Fu,Y.M.Chung,Y.Wu,P.Schauer,J.D.Smith,H.Allayee,W.H.Tang,J.A.DiDonato,A.J.Lusis,and S.L.Hazen.2011b.Gut flora metabolism of phosphatidylcholine promotes cardiovascular disease.Nature 472:57-63.

Zhang,Y.,Y.Dai,J.Wen,W.Zhang,A.Grenz,H.Sun,L.Tao,G.Lu,D.C.Alexander,M.V.Milburn,L.Carter-Dawson,D.E.Lewis,H.K.Eltzschig,R.E.Kellems,M.R.Blackburn,H.S.Juneja,and Y.Xia.2011.Detrimental effects of adenosine signaling in sickle cell disease.Nat Med 17:79-86.