基因多態(tài)性變異位點早期評估乳腺癌風險的診斷試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基因多態(tài)性變異位點早期評估乳腺癌風險的診斷試劑盒，所述的試劑盒包括七個單核苷酸多態(tài)性位點基因型的特異性引物與七個DNA測序引物，針對的檢測基因為五個雌激素代謝通路相關基因：ESR1，GSTP1，COMT，SHBG和CYP19A1基因。常見的對乳腺癌進行發(fā)病風險估計多用單個或幾個SNP位點進行分析，存在實用性差，敏感性和特異性都不行，很少能用于實際檢測和應用。本發(fā)明所用的檢測位點都與乳腺癌易感性相關，選擇的位點有一定的代表性，通過檢測，能夠有效預測乳腺癌的發(fā)病風險。
【專利說明】基因多態(tài)性變異位點早期評估乳腺癌風險的診斷試劑盒

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學領域，涉及醫(yī)學和生物技術，具體涉及一種女性乳腺癌發(fā) 病風險的基因檢測試劑盒，根據(jù)檢測結(jié)果從基因?qū)用嬖u估女性乳腺癌發(fā)病的風險，并作為 預防女性乳腺癌的建議指導。

【背景技術】
[0002] 乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率占全身各種惡性腫瘤的7-10%，位居 女性惡性腫瘤發(fā)病率的第一位。近年隨著環(huán)境和人口老齡化的影響，乳腺癌的發(fā)病率有明 顯增高的趨勢。早期發(fā)現(xiàn)并及時治療是乳腺癌防治的關鍵。
[0003] 人類基因組計劃的完成使我們對癌癥發(fā)生的分子機制認識進入了新的階段?；?多態(tài)性（single nucleotide polymorphism, SNP)普遍存在于機體DNA序列中，是第三代 遺傳標記。SNP研究是人類基因組計劃走向應用的重要步驟。因為SNP可作為一個強有力 的工具，用于高危群體的發(fā)現(xiàn)、疾病相關基因的鑒定、藥物的設計和測試以及生物學的基礎 研究等。通過病例對照研究不僅對于發(fā)現(xiàn)癌癥相關基因及闡明其作用機制起著重要作用， 而且對于癌癥易感性早期風險診斷和個體化醫(yī)療具有重要意義。
[0004] 與乳腺癌的發(fā)病直接或間接相關的基因眾多，其多態(tài)性位點變異可影響乳腺癌的 發(fā)病風險，因此建立簡單、可靠、快速的乳腺癌遺傳易感性的無創(chuàng)檢測方法，能夠檢測出乳 腺癌發(fā)生相關的基因單核苷酸位點基因型，及時篩查出乳腺癌易感高危人群，從而根據(jù)檢 測結(jié)果盡早采取預防措施，這對于提高乳腺癌的早診早治有重要意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明基于 ESRl(rs2046210, rs9383951)、C0MT(rs4680) SHBG(rs6259) GSTPl(rsl695) CYP19Al(rsl0046,rs700519)的7個單核苷酸多態(tài)性位點基因型可用于評 估乳腺癌風險基礎上，本發(fā)明提供一種女性乳腺癌遺傳易感性基因檢測試劑盒。
[0006] -種基因多態(tài)性變異位點早期評估乳腺癌風險的診斷試劑盒，所述的試劑盒包括 七個單核苷酸多態(tài)性位點基因型的特異性引物與七個DNA測序引物，針對的檢測基因為五 個雌激素代謝通路相關基因：ESR1，GSTP1，COMT，SHBG和CYP19A1基因。
[0007] 所述的特異性引物是指針 ESR1 (rs2046210, rs9383951)、C0MT(rs4680)、 SHBG (rs6259)、GSTP1 (rsl695)、CYP19A1 (rsl0046, rs700519)七個單核苷酸多態(tài)性位點， 能特異性擴增出包含這七個SNPs位點的DNA片段的引物對。
[0008] 所述的 DNA 測序引物是針對 ESR1 (rs2046210, rs9383951)、C0MT(rs4680)、 SHBG (rs6259)、GSTP1 (rsl695)、CYP19A1 (rsl0046, rs700519)七個單核苷酸多態(tài)性位點而 設計，能通過DNA測序技術特異性檢測出上述七個SNPs位點基因型的DNA測序引物。
[0009] 所述的七對特異性引物序列如下： (l)ESRlrs2046210 正向引物：5' CCATTTCTCCCTTCTTGTTGTGA 3,（SEQ ID N0:1);反 向引物 5'AAGGCATGCTGGAAGAGTGT 3'（SEQ ID N0:2); (2) ESRlrs9383951 正向引物：5'AGTGGCGCCAACTCTTATTGA 3'（SEQ ID N0:3);反向引 物 5' CTAAGGTTGGGAGGGCAAGT 3' （SEQ ID N0:4); (3) C0MT(rs4680)正向引物：5'CGAGGCTCATCACCATCGAG3'（SEQ ID N0:5);反向引物 5，ACTGAGGGGCCTGGTGATAG 3，（SEQ ID N0:6); (4) SHBG(rs6259)正向引物：5'TTGAGGGGAAGGAAACCTCTG3'（SEQ ID N0:7);反向引物 5，GTGGAGCTTTAATGGGAAGCG3，（SEQ ID N0:8); (5) GSTPl(rsl695)正向引物：5'TCATCCTTCCACGCACATCC3'（SEQ ID N0:9);反向引物 5' TTCTTTGTTCAGCCCCCAGT3' （SEQ ID N0:10); (6) CYP19A1 rsl0046 正向引物：5'ACAGTGTTCTGACTGACCCAT3'（SEQ ID N0:11);反向 引物 5' CATGGGCCACTGAGTGTTCA3'（SEQ ID N0:12); (7) CYP19A1 rs700519 正向引物：5'ACAGGCTTGATTTCGCTACCA3'（SEQ ID N0:13);反 向引物 5' TCAACTCAGTGGCAAAGTCCA3'（SEQ ID N0:14)。
[0010] 所述的七對DNA測序引物序列如下： (a) ESRlrs2046210 測序引物：5'GATGGAGGTACAGAAAGGCAT3'（SEQ ID N0:15); (b) ESRlrs9383%l 測序引物：5'TTGGGAGGGCAAGTCCTAGT3'（SEQ ID N0:16); (c) C0MT(rs4680)測序引物：5'GTGGGTTTTCAGTGAACGTGG3'（SEQ ID N0:17); (d) SHBG(rs6259)測序引物：5'GGAGGAGTGGAAAAGTGGGG3'（SEQ ID N0:18); (e) GSTPl(rsl695)測序引物：5'CCCCAGGGCTCTATGGGAAG3'（SEQ ID N0:19); (f) CYP19Al rsl0046 測序引物：5，TCTGGCTAACTGTCTGATCATTTTC3'（SEQ ID N0:20); (g) CYP19Al rs700519 測序引物：5'AGGCTTGATTTCGCTACCAGT 3'（SEQ ID N0:21)。 toon] 所述的試劑盒的每一人份包括： (i) PCR 反應體系：10XPCR 反應緩沖液 2. 5ul ;25mM dNTP 混合液(λ 2ul ;5U/ul Taq DNA聚合酶0. 125ul ;20uM特異性引物對，每條引物各0. 25ul ;ddH20 19. 175ul ; (ii) PCR 產(chǎn)物純化體系：lU/ul SAP 酶 0· 75ul ;10U/ul Exol 酶 0· 375ul ;ddH20 3. 875ul ； (iii) 測序反應體系：25% Big Dye mix lul ;3. 2uM DNA 測序引物 lul ;125Mm EDTA 溶 液 lul ;無水乙醇 15ul ;70% 乙醇溶液 30ul ;HIDI 溶液 8ul ;ddH20 2ul。
[0012] 本發(fā)明的有益效果： 常見的對乳腺癌進行發(fā)病風險估計多用單個或幾個SNP位點進行分析，存在實用性 差，敏感性和特異性都不行，很少能用于實際檢測和應用。本發(fā)明所用的檢測位點都與乳腺 癌易感性相關，選擇的位點有一定的代表性，通過檢測，能夠有效預測乳腺癌的發(fā)病風險。

【具體實施方式】
[0013] 。ESR1基因編碼雌激素受體。C0MT編碼兒茶酚-0-甲基轉(zhuǎn)移酶，與雌激素的滅活 相關。C0MT第4號外顯子上一個G>A多態(tài)性位點突變，導致其第158位密碼子編碼的氨基 酸有Val變?yōu)镸et。C0MT基因的Val和Met等位基因與兒茶酚-0-甲基轉(zhuǎn)移酶活性高低相 關，Val/Val基因型酶具有高活性，Val/Met基因型酶活性中等，Met/Met基因型酶活性最 低。研究表明該多態(tài)性位點與乳腺癌發(fā)病相關。CYP19A1基因編碼細胞色素 P450芳香化酶 是雌激素合成酶，rsl0046位于CYP19A1基因的3'UTR區(qū)，rs700519多態(tài)性位點導致R264C 變異。SHBG編碼雌激素結(jié)合球蛋白，GSTP1編碼II相代謝酶谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶。
[0014] 下面結(jié)合具體實施例，進一步闡釋本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，或按照制造廠商 所建議的條件。
[0015] 實施例1. 通過對330例乳腺癌患者和400例正常對照進行基因分型，分析由七個位點組成的單 體型在病例組和正常組的頻率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)單體型TGGGGTC顯著提高乳腺癌發(fā)病風險，與常 見單體型相比，乳腺癌發(fā)病風險提高20倍，P〈0. 0001，具有顯著性差異。
[0016] 實施例2 .檢測試劑盒的應用 1、DNA抽提 抽取靜脈血或刮取受撿者口腔黏膜上皮細胞，用酚氯仿法抽提基因組DNA。
[0017] 2、PCR 反應 使用檢測試劑盒中PCR反應組件，其中含下列引物對： (1) ESRlrs2046210 正向引物：5' CCATTTCTCCCTTCTTGTTGTGA 3,（SEQ ID N0:1);反 向引物 5'AAGGCATGCTGGAAGAGTGT 3'（SEQ ID N0:2); (2) ESRlrs9383951 正向引物：5'AGTGGCGCCAACTCTTATTGA 3'（SEQ ID N0:3);反向引 物 5' CTAAGGTTGGGAGGGCAAGT 3' （SEQ ID N0:4); (3) C0MT(rs4680)正向引物：5'CGAGGCTCATCACCATCGAG3'（SEQ ID N0:5);反向引物 5，ACTGAGGGGCCTGGTGATAG 3，（SEQ ID N0:6); (4) SHBG(rs6259)正向引物：5'TTGAGGGGAAGGAAACCTCTG3'（SEQ ID N0:7);反向引物 5'GTGGAGCTTTAATGGGAAGCG3'（SEQ ID N0:8); (5) GSTPl(rsl695)正向引物：5'TCATCCTTCCACGCACATCC3'（SEQ ID N0:9);反向引物 5' TTCTTTGTTCAGCCCCCAGT3' （SEQ ID N0:10); (6) CYP19A1 rsl0046 正向引物：5'ACAGTGTTCTGACTGACCCAT3'（SEQ ID N0:11);反向 引物 5' CATGGGCCACTGAGTGTTCA3'（SEQ ID N0:12); (7) CYP19A1 rs700519 正向引物：5'ACAGGCTTGATTTCGCTACCA3'（SEQ ID N0:13);反 向引物 5' TCAACTCAGTGGCAAAGTCCA3'（SEQ ID N0:14)。
[0018] PCR擴增的反應體系為：10X反應緩沖液2. 5ul ;25mM的dNTP混合液0. 2ul ;5U/ul Taq DNA聚合酶0. 125ul ;DNA模板lul ;20uM特異性引物對(每條引物各0. 25ul) ;ddH20 19.175ul ； 反應條件為：94°C 4min變性酶激活，94°C 30sec變性，55°C 30sec退火，72°C lmin 延伸，25個循環(huán)，最后72 °C延長5分鐘。
[0019] 3、PCR產(chǎn)物純化 使用試劑盒中的PCR產(chǎn)物純化組件，反應體系為總體積25ul，包含PCR產(chǎn)物20ul， lU/ul SAP 酶 0· 75ul ;10U/ul ΕχοΙ 酶 0·375ul ;ddH20 3.875ul。
[0020] 在ABI2720型PCR擴增儀上進行反應，反應條件為37°C、15min，72°C、20min。
[0021] 4、DNA測序反應 使用檢測試劑盒中的測序反應組件，其中，含有下列DNA測序引物： (a)ESRlrs2046210 測序引物：5'GATGGAGGTACAGAAAGGCAT3'（SEQIDN0:15); (b) ESRlrs938395l測序引物：5'TTGGGAGGGCAAGTCCTAGT 3'（SEQIDNO:l6); (c) C0MT(rs4680)測序引物：5'GTGGGTTTTCAGTGAACGTGG3'（SEQIDN0:17) ; (d) SHBG(rs6259)測序引物：5'GGAGGAGTGGAAAAGTGGGG3'（SEQIDN0:18) ; (e) GSTPl(rsl695)測序引物：5'CCCCAGGGCTCTATGGGAAG3'（SEQIDN0:19) ; (f) CYP19Alrsl0046 測序引物：5，TCTGGCTAACTGTCTGATCATTTTC3'（SEQIDN0:20); (g) CYP19Al rs700519 測序引物：5'AGGCTTGATTTCGCTACCAGT 3'（SEQ ID N0:21)。
[0022] 反應的總體系為5ul，包括PCR純化產(chǎn)物lul，25% Big Dye mix lul ;3. 2uM DNA測 序引物 lul ;ddH20 2ul。
[0023] 在ABI2720型PCR擴增儀上進行反應，反應條件為98°C 2min，后25個循環(huán)的96°C 30s，55°C 30s， 60°C 4min。
[0024] 反應結(jié)束后加入125mM EDTA溶液lul和無水乙醇15ul，室溫下沉淀15min，4°C， 3600rpm/min離心30min，去除上清液，加入70%乙醇溶液30ul，3600rpm/min離心15min，去 除上清液，室溫放置20min后加入HIDI溶液8ul，放入測序儀。
[0025] 5、基因型分析 對測序圖譜進行分析辨認所檢測的SNP位點的基因型。
[0026] 實施例3 .提供女性乳腺癌發(fā)病風險基因檢測服務 1、采樣機抽提DNA 由醫(yī)院檢驗科醫(yī)師對受檢者進行血樣或口腔上皮細胞采樣，采用酚氯仿法對標本進行 DNA抽提。
[0027] 2、基因型檢測 使用本發(fā)明提供的試劑盒，對受檢者基因組的ESR1 (rs2046210，rs9383951)、 C0MT(rs4680) SHBG(rs6259) GSTPl(rsl695) CYP19Al(rsl0046，rs700519)的 7 個單核苷 酸多態(tài)性位點分別進行DNA測序，確定這7個SNP位點的基因型。
[0028] 3、乳腺癌發(fā)病風險的評估 通過對受檢者SNPs基因型的分析，出具乳腺癌發(fā)病風險的評估分析報告。報告詳細說 明了受檢者 ESRl(rs2046210, rs9383951)、C0MT(rs4680) SHBG(rs6259) GSTPl(rsl695) CYP19A1 (rsl0046, rs700519)的7個單核苷酸多態(tài)性位點的基因型信息及發(fā)病風險評估結(jié) 果。
【權利要求】
1. 一種基因多態(tài)性變異位點早期評估乳腺癌風險的診斷試劑盒，其特征在于，所述的 試劑盒包括七個單核苷酸多態(tài)性位點基因型的特異性引物與七個DNA測序引物，針對的檢 測基因為五個雌激素代謝通路相關基因：ESR1，GSTP1，COMT，SHBG和CYP19A1基因。
2. 根據(jù)權利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述的特異性引物是指針 ESR1(rs2046210， rs9383951)、 C0MT(rs4680)、 SHBG(rs6259)、 GSTP1(rsl695)、 CYP19A1 (rsl0046, rs700519)七個單核苷酸多態(tài)性位點，能特異性擴增出包含這七個SNPs 位點的DNA片段的引物對。
3. 根據(jù)權利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述的DNA測序引物是針 對 ESRl(rs2046210, rs9383951)、C0MT(rs4680)、SHBG(rs6259)、GSTPl(rsl695)、 CYP19A1 (rsl0046, rs700519)七個單核苷酸多態(tài)性位點而設計，能通過DNA測序技術特異 性檢測出上述七個SNPs位點基因型的DNA測序引物。
4. 根據(jù)權利要求2所述的試劑盒，其特征在于：所述的七對特異性引物序列如下： (1) ESRlrs2046210 正向引物：5' CCATTTCTCCCTTCTTGTTGTGA 3,（SEQ ID N0:1);反 向引物 5'AAGGCATGCTGGAAGAGTGT 3'（SEQ ID N0:2); (2) ESRlrs9383951 正向引物：5'AGTGGCGCCAACTCTTATTGA 3'（SEQ ID N0:3);反向引 物 5' CTAAGGTTGGGAGGGCAAGT 3' （SEQ ID N0:4); (3) C0MT(rs4680)正向引物：5'CGAGGCTCATCACCATCGAG3'（SEQ ID N0:5);反向引物 5，ACTGAGGGGCCTGGTGATAG 3，（SEQ ID N0:6); (4) SHBG(rs6259)正向引物：5'TTGAGGGGAAGGAAACCTCTG3'（SEQ ID N0:7);反向引物 5，GTGGAGCTTTAATGGGAAGCG3，（SEQ ID N0:8); (5) GSTPl(rsl695)正向引物：5'TCATCCTTCCACGCACATCC3'（SEQ ID N0:9);反向引物 5' TTCTTTGTTCAGCCCCCAGT3' （SEQ ID N0:10); (6) CYP19A1 rsl0046 正向引物：5'ACAGTGTTCTGACTGACCCAT3'（SEQ ID N0:11);反向 引物 5' CATGGGCCACTGAGTGTTCA3'（SEQ ID N0:12); (7) CYP19A1 rs700519 正向引物：5'ACAGGCTTGATTTCGCTACCA3'（SEQ ID N0:13);反 向引物 5' TCAACTCAGTGGCAAAGTCCA3'（SEQ ID N0:14)。
5. 根據(jù)權利要求3所述的試劑盒，其特征在于：所述的七對DNA測序引物序列如下： (a) ESRlrs2046210 測序引物：5'GATGGAGGTACAGAAAGGCAT3'（SEQIDN0:15); (b) ESRlrs938395l測序引物：5'TTGGGAGGGCAAGTCCTAGT 3'（SEQIDNO:l6); (c) C0MT(rs4680)測序引物：5'GTGGGTTTTCAGTGAACGTGG3'（SEQIDN0:17) ; (d) SHBG(rs6259)測序引物：5'GGAGGAGTGGAAAAGTGGGG3'（SEQIDN0:18) ; (e) GSTPl(rsl695)測序引物：5'CCCCAGGGCTCTATGGGAAG3'（SEQIDN0:19) ; (f) CYP19Alrsl0046 測序引物：5，TCTGGCTAACTGTCTGATCATTTTC3'（SEQIDN0:20); (g) CYP19Al rs700519 測序引物：5'AGGCTTGATTTCGCTACCAGT 3'（SEQ ID N0:21)。
6. 根據(jù)權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒的每一人份包括： (i) PCR 反應體系：10XPCR 反應緩沖液 2. 5ul ;25mM dNTP 混合液 0· 2ul ;5U/ul Taq DNA聚合酶0. 125ul ;20uM特異性引物對，每條引物各0. 25ul ;ddH20 19. 175ul ; (ii) PCR 產(chǎn)物純化體系：lU/ul SAP 酶 0· 75ul ;10U/ul Exol 酶（λ 375ul ;ddH20 3. 875ul ； (iii)測序反應體系：25% Big Dye mix lul ;3· 2uM DNA 測序引物 lul ;125Mm EDTA 溶 液 lul ;無水乙醇 15ul ;70% 乙醇溶液 30ul ;HIDI 溶液 8ul ;ddH20 2ul。
【文檔編號】C12Q1/68GK104152557SQ201410388121
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年8月8日 優(yōu)先權日:2014年8月8日
【發(fā)明者】潘志文, 付志璇, 徐笑紅 申請人:浙江省腫瘤醫(yī)院