本發(fā)明屬于重要分析領(lǐng)域，具體涉及達(dá)原飲組合物的質(zhì)量控制方法。

背景技術(shù)：

中藥湯劑是臨床用藥的主流，但因起煎煮、攜帶不方便，煎煮制備的湯劑質(zhì)量往往因人、因煎煮器具而存在較大差異，而經(jīng)典名方臨床療效確切，因簡(jiǎn)、便、驗(yàn)、廉而深受廣大消費(fèi)者喜愛(ài)，運(yùn)用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)將經(jīng)典名方開(kāi)發(fā)承攜帶方便、便于服用的中藥制劑，不僅是對(duì)中醫(yī)藥的傳承，也是更好的促進(jìn)經(jīng)典名方的臨床應(yīng)用。顆粒劑制備工藝相對(duì)簡(jiǎn)單、易于賦形，服用、攜帶方便，在服用形式上與傳統(tǒng)湯劑最為一致，能較大限度的保持傳統(tǒng)湯劑的特點(diǎn)，因此以湯劑形式服用的經(jīng)典名方選擇顆粒劑最為適宜。顆粒劑的開(kāi)發(fā)應(yīng)遵循“原汁原味”的原則，在現(xiàn)有技術(shù)條件下，首先通過(guò)研究制備明確煎煮參數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)(基準(zhǔn))湯劑，對(duì)基準(zhǔn)湯劑的關(guān)鍵質(zhì)量屬性進(jìn)行研究，主要以單處方標(biāo)準(zhǔn)湯劑的固含量(干膏率)、指紋圖譜、多指標(biāo)成分作為質(zhì)量參比，指導(dǎo)顆粒的研制。研究中為減少不同來(lái)源的飲片存在的質(zhì)量差異對(duì)一致性研究帶來(lái)影響，選擇隨行對(duì)照的方式，采用同一批次的飲片，煎煮至少10份標(biāo)準(zhǔn)湯劑，以其關(guān)鍵質(zhì)量的均值作為顆粒劑制備工藝參數(shù)研制的“基準(zhǔn)”。本發(fā)明采用指紋圖譜技術(shù)，結(jié)合多波長(zhǎng)切換技術(shù)測(cè)定多指標(biāo)成分的方式對(duì)達(dá)原飲標(biāo)準(zhǔn)湯劑(以下稱為達(dá)原飲組合物①)、達(dá)原飲標(biāo)準(zhǔn)顆粒(以下稱為達(dá)原飲組合物②)的質(zhì)量進(jìn)行全面評(píng)價(jià)。

達(dá)原飲出自明代吳有性《瘟疫論》，由檳榔、厚樸、草果仁、知母、芍藥、黃芩、甘草七味中藥組成，主治瘟疫或瘧疾，邪伏膜原證，現(xiàn)代臨床常用瘧疾、流行性感冒、病毒性腦炎，病毒性肝炎等屬溫?zé)嵋叨痉谀ぴ?，濕熱雍盛者等。該方為開(kāi)達(dá)膜原、辟穢化濁之要方，方中厚樸散滿、化痰下氣、破戾氣所結(jié)；草果辛烈辟穢，宣透伏邪；檳榔行氣所結(jié)、使邪速漬。三藥相伍，直達(dá)膜原—瘟疫盤(pán)結(jié)處，逐邪外出。瘟疫之邪內(nèi)郁成熟，最易傷陰，故佐以黃芩清熱，知母滋陰清熱，芍藥斂陰，用甘草可緩前三藥之猛，又可制后三藥之寒，諸藥合用，開(kāi)達(dá)膜原，辟穢化濁，熱邪得清，邪去病解。達(dá)原飲現(xiàn)代臨床應(yīng)用廣泛，在解熱方面比抗菌，抗病毒藥有更好的療效。特別是對(duì)感染型發(fā)熱和濕熱型發(fā)熱具有更重要的作用，且達(dá)原飲加減方在其它疾病治療方面也運(yùn)用廣泛并有著確切的臨床療效，因此該方作為臨床經(jīng)典名方開(kāi)發(fā)臨床意義重大。

臨床上應(yīng)用“達(dá)原飲”治療多種濕熱病，均取得較好效果，該方是臨床上的有效方劑，該方由7味藥組成，其中：檳榔為棕櫚科植物檳梆的干燥成熟種子，主要含有檳榔堿堿、檳榔次堿，及去甲基檳榔堿等生物堿，其水浸液對(duì)皮膚真菌，流感病毒有抑制作用。草果仁為姜科植物草果的干燥成熟果實(shí)，照清炒法炒至焦黃色并微鼓起，去殼，取仁所得，主要含有揮發(fā)油具有躁濕溫中，除痰截瘧的功效。厚樸為木蘭科植物厚樸的干燥皮，根皮及枝皮，具有廣譜的抗菌作用，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、耐酸性菌、肺炎球菌、白喉?xiàng)U菌、溶血性鏈球菌、枯草桿菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏及施氏痢疾桿菌及常見(jiàn)致病性皮膚真菌等均有抑制作用，厚樸酚、和厚樸酚、四氫厚樸酚及四氫和厚樸酚，均有極強(qiáng)的抑制細(xì)菌的作用。木蘭醇、和厚樸酚等對(duì)TPA激活的Epstein-Barr病毒(Ebr)有明顯的抑制作用。知母為百合科植物知母的干燥根莖，具有“滋陰”作用；對(duì)大腸桿菌所致家兔發(fā)熱有解熱作用，其解熱有效成分為芒果苷；芒果苷還可鎮(zhèn)咳、祛痰；知母對(duì)傷寒桿菌、痢疾桿菌、白喉?xiàng)U菌、肺炎雙球菌、葡萄球菌等均有一定抑制作用；異芒果苷還具有顯著的抗單純皰疹病毒作用，芒果苷和異芒果苷均可阻止HSV-I在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制。黃芩為唇形科植物黃芩的干燥根，具有明顯的抗炎作用，黃芩苷、黃芩素均能顯著降低炎癥時(shí)小鼠耳毛細(xì)血管通透性亢進(jìn)及低氣壓所致小鼠試驗(yàn)性肺出血，對(duì)角叉菜膠性大鼠足腫有與阿司匹林相似的抗炎作用，對(duì)酵母、傷寒菌苗所致家兔發(fā)熱有解熱作用；黃芩還具有廣譜的抗菌作用，對(duì)流感病毒、鼻病毒等有抑制作用。白芍為毛茛科植物芍藥的干燥塊莖，主要含有芍藥苷及牡丹酚等，具有免疫調(diào)節(jié)作用，可提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬百分率和吞噬指數(shù)；對(duì)T細(xì)胞功能呈機(jī)能與濃度依賴性雙向調(diào)節(jié)作用，可促進(jìn)特異性及非特異性調(diào)節(jié)細(xì)胞的誘導(dǎo)，具有明顯的抗炎作用；還具有抗菌、抗病毒作用。甘草為豆科植物甘草的干燥根及根莖，含甘草甜素及多種黃酮類成份，具有多種生物活性。甘草酸類化合物通過(guò)對(duì)多種病毒的直接作用和誘生干擾素，增強(qiáng)天然殺傷細(xì)胞和巨噬細(xì)胞活性等活化宿主免疫功能的間接作用而發(fā)揮廣譜的抗病毒作用，對(duì)艾滋病毒(HIV)、單純性皰疹病毒、水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)均有抑制作用，還具有誘導(dǎo)干擾素的作用，剌激細(xì)胞產(chǎn)生γ-干擾素，而γ-干擾素為國(guó)外報(bào)道具有抑制SARS病毒的作用，此外，甘草還有提高免疫功能、抗炎、解毒等作用。

“達(dá)原飲”傳統(tǒng)用藥劑型為水煎劑，為了更好的發(fā)揮達(dá)原飲的臨床療效，醫(yī)藥工作者對(duì)該經(jīng)典方進(jìn)行了大量的研究，主要是對(duì)其臨床藥理作用作了大量工作，對(duì)其質(zhì)量研究報(bào)道較少；作為含七味中藥的復(fù)方制劑，所含藥味多，具有多組分、多靶標(biāo)等特點(diǎn)，目前大部分中藥復(fù)方制劑在含量控制上基本只有一個(gè)或兩個(gè)指標(biāo)性成分，質(zhì)量控制單一，指標(biāo)少，難以全面反映產(chǎn)品的質(zhì)量狀況。鑒于目前質(zhì)量控制方法在全面控制產(chǎn)品質(zhì)量上存在不足，同時(shí)達(dá)原飲中由于含有生物堿、黃酮類等理化性質(zhì)差異較大成分，若針對(duì)每個(gè)指標(biāo)單獨(dú)建立方法測(cè)定，較繁瑣。目前在達(dá)原飲全面質(zhì)量控制方法的研究上未見(jiàn)報(bào)道，因此目前本領(lǐng)域亟需一種較全面的達(dá)原飲組合物的質(zhì)量控制的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

因此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的中藥復(fù)方制劑在含量控制上基本只有一個(gè)或兩個(gè)指標(biāo)性成分，質(zhì)量控制單一，指標(biāo)少，難以全面反映藥味多，組分多、靶標(biāo)多的達(dá)原飲組合物的質(zhì)量狀況的缺陷，從而提供達(dá)原飲組合物的質(zhì)量控制方法。

為此，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

達(dá)原飲組合物的質(zhì)量控制方法包括采用高效液相色譜法建立達(dá)原飲組合物指紋圖譜，色譜條件為：

色譜柱采用十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱；

流速0.8ml/ml；柱溫：25℃～35℃；

檢測(cè)儀器采用紫外-可見(jiàn)分光檢測(cè)器，指紋圖譜的檢測(cè)波長(zhǎng)為215nm～240nm；

理論板數(shù)按參照物黃芩苷峰計(jì)算，應(yīng)不低于3000；

參照物溶液為黃芩苷的甲醇溶液；

流動(dòng)相以乙腈-0.1％磷酸溶液為系統(tǒng)按照如下洗脫順序進(jìn)行梯度洗脫：

指紋圖譜流動(dòng)相梯度程序

所述指紋圖譜包括20個(gè)共有峰，各峰的相對(duì)保留時(shí)間分別為：

1號(hào)峰相對(duì)保留時(shí)間RRT為11.554，2號(hào)峰相對(duì)保留時(shí)間RRT為20.589，3號(hào)峰相對(duì)保留時(shí)間RRT為24.434，4號(hào)峰相對(duì)保留時(shí)間RRT為26.558，5號(hào)峰相對(duì)保留時(shí)間RRT為29.776，6號(hào)峰相對(duì)保留時(shí)間RRT為31.082，7號(hào)峰相對(duì)保留時(shí)間RRT為34.114，8號(hào)峰相對(duì)保留時(shí)間RRT為37.788，9號(hào)峰相對(duì)保留時(shí)間RRT為38.742，10號(hào)峰相對(duì)保留時(shí)間RRT為39.778，11號(hào)峰相對(duì)保留時(shí)間RRT為40.583，S峰相對(duì)保留時(shí)間RRT為50.099，13號(hào)峰相對(duì)保留時(shí)間RRT為53.925，14號(hào)峰相對(duì)保留時(shí)間RRT為54.927，15號(hào)峰相對(duì)保留時(shí)間RRT為57.315，16號(hào)峰相對(duì)保留時(shí)間RRT為61.652，17號(hào)峰相對(duì)保留時(shí)間RRT為68.702，18號(hào)峰相對(duì)保留時(shí)間RRT為72.735，19號(hào)峰相對(duì)保留時(shí)間RRT為84.317，20號(hào)峰相對(duì)保留時(shí)間RRT為86.291，其中，12號(hào)S峰是參照物的色譜峰。

所述達(dá)原飲組合物按如下兩種方法制備：

(1)按重量份計(jì)稱取如下飲片：檳榔6g，厚樸3g，草果仁1.5g，知母3g，白芍3g，黃芩3g，甘草1g，置于2L煎藥砂鍋中，加400ml水，浸泡30分鐘，加蓋，武火加熱煮沸，文火保持微沸至藥材藥液為150-170ml，濾除藥渣，放冷，即得第一達(dá)原飲組合物；

(2)按重量份計(jì)稱取如下飲片：檳榔1200g，厚樸600g，草果仁300g，知母600g，白芍600g，黃芩600g，甘草300g；加8倍量的水，煎煮1.0h；濾過(guò)，得濾液；減壓濃縮至相對(duì)密度1.10-1.30的稠膏，加入麥芽糊精，干燥；混勻，加硬脂酸鎂，干壓顆粒，制成1000g，即得第二達(dá)原飲組合物。

測(cè)定達(dá)原飲組合物指紋圖譜時(shí)的供試品溶液與參照物溶液按如下方法制備：

(1)供試品溶液的制備：取第一達(dá)原飲組合物5ml，離心，取上清液，即得；或取第二達(dá)原飲組合物1.7g，置50ml容量瓶中，加水稀釋，超聲溶解，放冷，再加水定容，搖勻，離心，取上清液，即得；

(2)參照物溶液的制備：取黃芩苷對(duì)照品，加甲醇配制成80μg/ml的參照物溶液，即得。

進(jìn)樣量為10μl。

還包括用高效液相色譜法

測(cè)定達(dá)原飲組合物中檳榔堿含量，色譜條件為：

以強(qiáng)陽(yáng)離子交換鍵合硅膠為填充劑；

流動(dòng)相為乙腈-0.2％磷酸溶液為流動(dòng)相(50:40)洗脫，2→1000，濃氨試液調(diào)節(jié)pH值至3.5-4.0；

流速0.8ml/ml～1.2ml/ml；柱溫：25℃～35℃；

檢測(cè)儀器采用紫外-可見(jiàn)分光檢測(cè)器，檳榔堿含量測(cè)定的檢測(cè)波長(zhǎng)為215nm；

理論板數(shù)按對(duì)照品檳榔堿峰計(jì)算，應(yīng)不低于3000；

對(duì)照品溶液為氫溴酸檳榔堿溶液。

測(cè)定達(dá)原飲組合物檳榔堿含量時(shí)的供試品溶液、對(duì)照品溶液按如下方法制得：

(1)供試品溶液的制備：取第一達(dá)原飲組合物5ml，離心，取上清液，即得；或取第二達(dá)原飲組合物，研細(xì)，取1g，精密稱定，置于100ml容量瓶中，加50％乙腈超聲溶解并定容至刻度，搖勻，離心，取上清液，即得；

(2)對(duì)照品溶液的制備：取氫溴酸檳榔堿，精密稱定，加乙腈-0.2％磷酸溶液為流動(dòng)相按50:50制成每1ml含40μg的溶液，即得，2→1000，濃氨試液調(diào)節(jié)pH值至約3.8，檳榔堿重量＝氫溴酸檳榔堿重量/1.5214。

測(cè)定檳榔堿含量時(shí)的進(jìn)樣量為20μl～40μl。

還包括用高效液相色譜法

測(cè)定達(dá)原飲組合物中芒果苷、芍藥苷、黃芩苷、甘草酸的含量，色譜條件為：

色譜柱采用十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱；

流速0.9ml/min～1.1ml/min；柱溫：25℃～35℃；

檢測(cè)儀器采用二極管陣列檢測(cè)器，四指標(biāo)成分檢測(cè)波長(zhǎng)為230nm～254nm；

理論板數(shù)按對(duì)照品黃芩苷峰計(jì)算，應(yīng)不低于5000；

對(duì)照品溶液為：芒果苷、芍藥苷、黃芩苷、甘草酸銨的混合對(duì)照品溶液

流動(dòng)相為乙腈-0.1％磷酸溶液為流動(dòng)相按照如下洗脫順序進(jìn)行梯度洗脫：

流動(dòng)相梯度程序

測(cè)定達(dá)原飲組合物中芒果苷、芍藥苷、黃芩苷、甘草酸銨含量時(shí)供試品溶液和對(duì)照品溶液按如下方法制得：

(1)供試品溶液的制備：量取第一達(dá)原飲組合物5ml置于10ml的容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，取適量離心，取上清液，即得；

或取第二達(dá)原飲組合物，研細(xì)，取0.5g，精密稱定，置于100ml容量瓶中，加50％甲醇超聲溶解并定容至刻度，搖勻，離心，取上清液，即得；

(2)對(duì)照品溶液的制備：取芒果苷對(duì)照品、芍藥苷對(duì)照品、黃芩苷對(duì)照品、甘草酸銨對(duì)照品，稱定，加70％甲醇分別制成每1ml含芒果苷20μg、芍藥苷36μg、黃芩苷0.15mg、甘草酸銨20μl的溶液，即得，甘草酸重量＝甘草酸銨重量/1.0207；

測(cè)定芒果苷、芍藥苷、黃芩苷、甘草酸的含量時(shí)的進(jìn)樣量為10μl。

本發(fā)明提供的達(dá)原飲組合物的質(zhì)量控制方法具有如下優(yōu)點(diǎn)：

1、本發(fā)明提供的達(dá)原飲組合物的質(zhì)量控制方法中的指紋圖譜，全面反映出達(dá)原飲質(zhì)量信息，從而能夠達(dá)到更加全面、有效地控制達(dá)原飲組合物制劑產(chǎn)品質(zhì)量的目的。

2、本發(fā)明提供的達(dá)原飲組合物的質(zhì)量控制方法通過(guò)采用國(guó)家藥典委員會(huì)提供的中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)對(duì)所測(cè)指紋圖譜的辨認(rèn)，操作方便、快捷；而且，以此得出的相以度結(jié)果對(duì)制劑指紋圖譜進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)論較為客觀、準(zhǔn)確。

3、本發(fā)明提供的達(dá)原飲組合物的質(zhì)量控制方法經(jīng)過(guò)對(duì)供試品制備方法的考察及測(cè)定指紋圖譜的儀器，色譜柱、流動(dòng)相、檢測(cè)波長(zhǎng)等條件進(jìn)行系統(tǒng)的優(yōu)選，建立了指紋圖譜測(cè)定條件并進(jìn)行了方法學(xué)考察，在對(duì)多批本組合物指紋圖譜檢測(cè)結(jié)果的基礎(chǔ)上，逐漸積累數(shù)據(jù)，提出了對(duì)照指紋圖譜，作為本品指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)，從而達(dá)到能夠更全面、有效地控制制劑質(zhì)量的目的。

4、本發(fā)明提供的達(dá)原飲組合物的質(zhì)量控制方法采用國(guó)家藥典委員會(huì)提供中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)計(jì)算本組合物相似度，經(jīng)多次試驗(yàn)研究，通過(guò)與計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的方法相比較，所得出的評(píng)價(jià)結(jié)論基本一致，使用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)評(píng)價(jià)指紋圖譜的相似度，操作方便、快捷，以其得出的相似度結(jié)果，對(duì)制劑指紋圖譜進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)論較為客觀、準(zhǔn)確。

5、本發(fā)明提供的達(dá)原飲組合物的質(zhì)量控制方法采用指紋圖譜較全面的表征組合物的質(zhì)量信息，從整體上反映產(chǎn)品質(zhì)量，同時(shí)針對(duì)處方七味藥材，采用多波長(zhǎng)切換技術(shù)建立其中五味(約占71％)的含量控制指標(biāo)，針對(duì)在普通C18柱上難以保留的檳榔堿，采用強(qiáng)性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂柱進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)改進(jìn)供試品溶液的制備方法，以簡(jiǎn)單、便捷的方式快速制備供試品溶液，且測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、可靠；本發(fā)明考慮目前現(xiàn)有技術(shù)在控制復(fù)方中成藥上往往只有一個(gè)或兩個(gè)指標(biāo)性成分，且缺乏指紋圖譜整體表征產(chǎn)品質(zhì)量信息，因此提出以指紋圖譜結(jié)合多指標(biāo)成分含量控制的方式全面的控制達(dá)原飲組合物質(zhì)量。

6、本發(fā)明提供的達(dá)原飲組合物的質(zhì)量控制方法提出采用指紋圖譜，結(jié)合多波長(zhǎng)切換技術(shù)測(cè)定達(dá)原飲組合物種多個(gè)指標(biāo)成分。

7、本發(fā)明提供的達(dá)原飲組合物的質(zhì)量控制方法可以為達(dá)原飲組合物提供一種較全面的質(zhì)量控制方法。

附圖說(shuō)明

為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明具體實(shí)施方式或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)具體實(shí)施方式或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見(jiàn)地，下面描述中的附圖是本發(fā)明的一些實(shí)施方式，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1檳榔堿測(cè)量中對(duì)照品溶液色譜圖；

圖2檳榔堿測(cè)量中供試品溶液色譜圖；

圖3芒果苷、芍藥苷、黃芩苷、甘草酸的測(cè)量中對(duì)照品溶液圖

圖4芒果苷、芍藥苷、黃芩苷、甘草酸的測(cè)量中供試品溶液色譜圖

圖5指紋圖譜測(cè)定中200～400nm掃描光譜3D圖；

圖6指紋圖譜測(cè)定中的黃芩苷參照物溶液色譜圖

圖7指紋圖譜測(cè)定中的對(duì)照指紋圖譜

圖8連續(xù)三批樣品指紋圖譜對(duì)比色譜圖

具體實(shí)施方式

提供下述實(shí)施例是為了更好地進(jìn)一步理解本發(fā)明，并不局限于所述最佳實(shí)施方式，不對(duì)本發(fā)明的內(nèi)容和保護(hù)范圍構(gòu)成限制，任何人在本發(fā)明的啟示下或是將本發(fā)明與其他現(xiàn)有技術(shù)的特征進(jìn)行組合而得出的任何與本發(fā)明相同或相近似的產(chǎn)品，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

實(shí)施例中未注明具體實(shí)驗(yàn)步驟或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的常規(guī)實(shí)驗(yàn)步驟的操作或條件即可進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)市購(gòu)獲得的常規(guī)試劑產(chǎn)品。

本發(fā)明試藥及儀器：

試藥：

氫溴酸檳榔堿(批號(hào)：111684-200401，中國(guó)藥品生物制品檢定研究院)，

厚樸酚(批號(hào)：1100729-201513，中國(guó)藥品生物制品檢定研究院)，

和厚樸酚(批號(hào)：110730-200402，中國(guó)藥品生物制品檢定研究院)，

黃芩苷(批號(hào)：110715-201318，中國(guó)藥品生物制品檢定研究院)，

芍藥苷(批號(hào)：110736-201136，中國(guó)藥品生物制品檢定研究院)，

芒果苷(批號(hào)：110607-200402，中國(guó)藥品生物制品檢定研究院)，

甘草酸銨(批號(hào)：110731-201116，中國(guó)藥品生物制品檢定研究院)；

檳榔(批號(hào)：20160210，產(chǎn)地：廣西)，

草果仁(批號(hào)：160127，產(chǎn)地：廣西)，

厚樸(批號(hào)：D1603007，產(chǎn)地：四川)，

黃芩(批號(hào)：20160121，產(chǎn)地：山東)，

白芍(批號(hào)：A160044001，產(chǎn)地：安徽)，

知母(批號(hào)：A160059001，產(chǎn)地：河北)，

甘草(批號(hào)：A160052001，產(chǎn)地：內(nèi)蒙古)。

達(dá)原飲組合物①、達(dá)原飲組合物②(均自制，制備方法見(jiàn)實(shí)施例1)，

乙睛，磷酸等，試驗(yàn)用水為超純水；

儀器：Waters E2695高效液相色譜儀，Agilent 1260高效液相色譜儀

實(shí)施例1.達(dá)原飲組合物的制備

第一達(dá)原飲組合物：按重量份計(jì)稱取如下飲片檳榔6g，厚樸3g，草果仁1.5g，知母3g，白芍3g，黃芩3g，甘草1g，置于2L煎藥砂鍋中，加400ml水，浸泡30分鐘，加蓋，砂鍋置于電加熱板上，武火(電壓值220V)加熱煮沸(約13分鐘)，文火(電壓值約170V)保持微沸至藥材藥液約160ml(約40分鐘)，采用兩層醫(yī)用紗布濾除藥渣，放冷，即得。

第二達(dá)原飲組合物：按重量份計(jì)稱取如下飲片檳榔1200g，厚樸600g，草果仁300g，知母600g，白芍600g，黃芩600g，甘草300g；加8倍量的水，煎煮1.0h；濾過(guò)，得濾液；減壓濃縮至相對(duì)密度為1.10-1.30優(yōu)選1.20(60℃～70℃)的稠膏，加入適量麥芽糊精，干燥；混勻，加適量硬脂酸鎂，干壓顆粒，制成1000g，即得。第二達(dá)原飲組合物②采用聚酯鍍鋁/聚乙烯復(fù)合膜，包裝規(guī)格為5.0g/袋。

實(shí)施例2.HPLC法測(cè)定達(dá)原飲組合物中檳榔堿含量

(1)色譜條件

以強(qiáng)陽(yáng)離子交換鍵合硅膠為填充劑，色譜柱：Phenomenex Luna SCX，4.6*250mm，5um，以乙腈-磷酸溶液(2→1000，濃氨試液調(diào)節(jié)pH值至3.8)(50：50)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為215nm，流速1.0ml/min，柱溫30℃。理論板數(shù)按檳榔堿峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。

(2)對(duì)照品溶液的制備

取氫溴酸檳榔堿適量，精密稱定，加乙腈-0.2％磷酸溶液(2→1000，濃氨試液調(diào)節(jié)pH值至約3.8)為流動(dòng)相(50:50)制成每1ml含40μg的溶液，即得。(檳榔堿重量＝氫溴酸檳榔堿重量/1.5214)。見(jiàn)附圖1。

(3)供試品溶液的制備

第一達(dá)原飲組合物供試品溶液制備：取第一達(dá)原飲組合物5ml，12000r/min離心10min，取上清液，即得。見(jiàn)附圖2。

第二達(dá)原飲組合物供試品溶液制備：取第二達(dá)原飲組合物1.0g，精密稱定，置100ml容量瓶中，加50％乙腈超聲溶解并定容至刻度，搖勻，離心，取上清液，即得。

(4)測(cè)定法精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液20μl～40μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。

(5)檳榔堿標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密移取一定量的對(duì)照品儲(chǔ)備液，稀釋，配制成濃度為0.81、4.06、6.50、8.12、9.75、20.30、40.61μg/ml的對(duì)照品溶液。分別進(jìn)樣20μl，按色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖。以濃度(C)為橫坐標(biāo)，峰面積(A)為縱坐標(biāo)，以濃度對(duì)平均峰面積進(jìn)行回歸分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性回歸方程為：A＝141585C+16958，r＝1，線性關(guān)系良好。

(6)方法學(xué)驗(yàn)證及樣品測(cè)定該測(cè)定方法經(jīng)過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證，陰性樣品對(duì)測(cè)定結(jié)果無(wú)干擾，樣品在90h的穩(wěn)定性良好，RSD值0.38％；重復(fù)性測(cè)定結(jié)果為RSD值為0.39％；平均加樣回收率99.63％(n＝9)，RSD％為0.87％，表明方法準(zhǔn)確度高，重復(fù)性良好。用本方法測(cè)定10份第一達(dá)原飲組合物與連續(xù)三批次第二達(dá)原飲組合物的檳榔堿含量，結(jié)果如下：

(7)第一達(dá)原飲組合物要求每份煎煮液、第二達(dá)原飲組合物要求檳榔堿含量每5g，兩者均不得少于1.5mg。

實(shí)施例3.HPLC法測(cè)定達(dá)原飲組合物中芒果苷、芍藥苷、黃芩苷、甘草酸的含量

(1)色譜條件：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18，4.6*250mm，5μm，以乙腈為流動(dòng)相A，以0.2％磷酸溶液為流動(dòng)相B，按下表中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；流速0.8ml/min，柱溫：30℃。理論板數(shù)按黃芩苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。

流動(dòng)相梯度程序

檢測(cè)波長(zhǎng)表

(2)對(duì)照品溶液的制備

取芒果苷對(duì)照品、芍藥苷對(duì)照品、黃芩苷對(duì)照品、甘草酸銨對(duì)照品適量，精密稱定，加70％甲醇制成每1ml含芒果苷20μg、芍藥苷36μg、黃芩苷0.15mg、甘草酸銨20μl的混合對(duì)照溶液，即得(甘草酸重量＝甘草酸銨重量/1.0207)。見(jiàn)附圖3。

(3)供試品溶液的制備

第一達(dá)原飲組合物供試品溶液制備：精密量取第一達(dá)原飲組合物5ml置于10ml的容量瓶中，加甲醇混勻并定容至刻度，取適量12000r/min離心10min，取上清液，即得第一達(dá)原飲組合物供試品溶液。見(jiàn)附圖4。

第二達(dá)原飲組合物供試品溶液制備：取第二達(dá)原飲組合物0.5g，精密稱定，置于100ml容量瓶中，加50％甲醇超聲溶解并定容至刻度，搖勻，取適量12000r/min離心10min，取上清液，即得第二達(dá)原飲組合物供試品溶液。

(4)測(cè)定法 精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液10μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。

(5)芒果苷、芍藥苷、黃芩苷、甘草酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密移取一定量的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，稀釋，配制成含線性點(diǎn)1(芒果苷2.10、芍藥苷1.73、黃芩苷23.97、甘草酸3.69μg/ml)，線性點(diǎn)2(芒果苷10.52、芍藥苷8.63、黃芩苷119.86、甘草酸18.47μg/ml)，線性點(diǎn)3(芒果苷16.83、芍藥苷13.81、黃芩苷191.78、甘草酸29.54μg/ml)，線性點(diǎn)4(芒果苷21.04、芍藥苷17.26、黃芩苷239.73、甘草酸36.93μg/ml)，線性點(diǎn)5(芒果苷25.25、芍藥苷20.72、黃芩苷287.67、甘草酸44.32μg/ml)，線性點(diǎn)6(芒果苷52.60、芍藥苷43.16、黃芩苷599.31、甘草酸92.33μg/ml)，線性點(diǎn)7(芒果苷105.20、芍藥苷86.32、黃芩苷1198.63、甘草酸184.65μg/ml)。分別進(jìn)樣10μl，按色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明芒果苷線性回歸方程為：A＝2880112C+1777371，r＝0.9999，線性關(guān)系良好；芍藥苷線性回歸方程為：A＝2028361C-158727，r＝1，線性關(guān)系良好；黃芩苷線性回歸方程為：A＝1214683C+6425261，r＝1，線性關(guān)系良好；甘草酸線性回歸方程為：A＝1341078C+744191，r＝0.9999，線性關(guān)系良好。其芒果苷濃度的線性范圍為2.10～105.20μg·ml^-1，芍藥苷濃度的線性范圍為3.69～184.65μg·ml^-1，黃芩苷濃度的線性范圍為23.97～1198.63μg·ml^-1，甘草酸濃度的線性范圍為1.73～86.32μg·ml^-1。

(6)方法學(xué)考察及樣品測(cè)定

該測(cè)定方法經(jīng)過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證，陰性樣品對(duì)測(cè)定結(jié)果無(wú)干擾，樣品在80h的穩(wěn)定性良好，四個(gè)指標(biāo)RSD值依次分別為：0.37％，0.76％，0.34％，0.28％；重復(fù)性測(cè)定結(jié)果四個(gè)指標(biāo)RSD值分別為0.38％，0.47％，0.47％，0.56％；四個(gè)指標(biāo)平均加樣回收率分別為：芒果苷101.18％(n＝9)，RSD％為0.66％；芍藥苷99.47％(n＝9)，RSD％為0.72％；黃芩苷100.02％(n＝9)，RSD％為0.69％；甘草酸103.29％(n＝9)，RSD％為0.63％，表明方法準(zhǔn)確度高，重復(fù)性良好。用本方法測(cè)定10批次第一達(dá)原飲組合物與連續(xù)三批次第二達(dá)原飲組合物的四者含量，結(jié)果如下：

(7)第一達(dá)原飲組合物要求每份煎煮液、第二達(dá)原飲組合物要求每5g含量，兩者芒果苷均不得少于4.4mg；芍藥苷均不得少于13.3mg；黃芩苷均不得少于101.2mg；甘草酸均不得少于7.0mg。

實(shí)施例4.HPLC法建立達(dá)原飲組合物中指紋圖譜的檢測(cè)方法

(1)色譜條件及系統(tǒng)適用性以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，色譜柱：waters symmetry C18 250mm*4.6mm，5μm；以乙腈為流動(dòng)相A，0.1％磷酸溶液為流動(dòng)相B；流速0.8ml/min，柱溫30℃。理論板數(shù)按黃芩苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。

指紋圖譜流動(dòng)相梯度程序

檢測(cè)波長(zhǎng)表

(2)參照物溶液的制備 取黃芩苷對(duì)照品適量，加甲醇配制成250μg/ml的參照物溶液，即得。

(3)供試品溶液的制備

第一達(dá)原飲組合物供試品溶液：取第一達(dá)原飲組合物5ml，12000r/min離心10min，取上清液，即得第一達(dá)原飲組合物供試品溶液。

第二達(dá)原飲組合物供試品溶液：取第二達(dá)原飲組合物1.7g，精密稱定，置于50ml量瓶中，加水超聲溶解并定容至刻度，取適量12000r/min離心10min，取上清液，即得供試品溶液。

(4)測(cè)定法精密量取參照物溶液和供試品溶液10μl，注入高效液相色譜儀，測(cè)定，即得。

(5)達(dá)原飲組合物對(duì)照指紋圖譜的確定及相似度分析

采用同一批次飲片，制備第一達(dá)原飲組合物10份，分別第一達(dá)原飲組合物供試品溶液，按指紋圖譜測(cè)定法測(cè)定，記錄圖譜。通過(guò)分析，確定其共有特征峰為20個(gè)(見(jiàn)附圖5-6)，所述的20個(gè)共有特征峰的相對(duì)保留時(shí)間偏差RSD均小于2％，即：

1號(hào)峰平均保留時(shí)間RRT為11.554，RSD％為0.18％；

2號(hào)峰平均保留時(shí)間RRT為20.589，RSD％為0.03％；

3號(hào)峰平均保留時(shí)間RRT為24.434，RSD％為0.15％；

4號(hào)峰平均保留時(shí)間RRT為26.558，RSD％為0.14％；

5號(hào)峰平均保留時(shí)間RRT為29.776，RSD％為0.12％；

6號(hào)峰平均保留時(shí)間RRT為31.082，RSD％為0.10％；

7號(hào)峰平均保留時(shí)間RRT為34.114，RSD％為0.08％；

8號(hào)峰平均保留時(shí)間RRT為37.788，RSD％為0.11％；

9號(hào)峰平均保留時(shí)間RRT為38.742，RSD％為0.07％；

10號(hào)峰平均保留時(shí)間RRT為39.778，RSD％為0.07％；

11號(hào)峰平均保留時(shí)間RRT為40.583，RSD％為0.08％；

12(S)峰平均保留時(shí)間RRT為50.099，RSD％為0.07％；

13號(hào)峰平均保留時(shí)間RRT為53.925，RSD％為0.09％；

14號(hào)峰平均保留時(shí)間RRT為54.927，RSD％為0.11％；

15號(hào)峰平均保留時(shí)間RRT為57.315，RSD％為0.17％；

16號(hào)峰平均保留時(shí)間RRT為61.652，RSD％為0.18％；

17號(hào)峰平均保留時(shí)間RRT為68.702，RSD％為0.14％；

18號(hào)峰平均保留時(shí)間RRT為72.735，RSD％為0.05％；

19號(hào)峰平均保留時(shí)間RRT為84.317，RSD％為0.01％；

20號(hào)峰平均保留時(shí)間RRT為86.291，RSD％為0.01％；

運(yùn)用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件(2012年版)處理圖譜，以150914-1作為參照?qǐng)D譜，得到第一達(dá)原飲組合物對(duì)照指紋圖譜。采用夾角余弦法計(jì)算樣品相似度，結(jié)果表明，煎煮的10份第一達(dá)原飲組合物相似度在0.983～1.000之間，相似度較高。

10份第一達(dá)原飲組合物相似度評(píng)價(jià)結(jié)果

取第一達(dá)原飲組合物所對(duì)應(yīng)的飲片，制備連續(xù)三批次第二達(dá)原飲組合物樣品，按指紋圖譜測(cè)定方法測(cè)定，記錄色譜圖(見(jiàn)附圖7)，以第一達(dá)原飲組合物生成的對(duì)照指紋圖譜作為隨行對(duì)照?qǐng)D譜，計(jì)算3批次第二達(dá)原飲組合物的相似度。結(jié)果見(jiàn)下表。

達(dá)原飲組合物②相似度計(jì)算結(jié)果

(6)按中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)計(jì)算，以mark峰計(jì)，供試品指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜的相似度不得低于0.90。

顯然，上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說(shuō)明所作的舉例，而并非對(duì)實(shí)施方式的限定。對(duì)于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在上述說(shuō)明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)。這里無(wú)需也無(wú)法對(duì)所有的實(shí)施方式予以窮舉。而由此所引伸出的顯而易見(jiàn)的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明創(chuàng)造的保護(hù)范圍之中。