本專利發(fā)明了一種無核葡萄果實細胞計數(shù)方法，用番紅-固綠染色法，對常規(guī)石蠟切片法處理好的無核葡萄果實切片進行染色，然后在顯微鏡下觀察單位面積內(nèi)的細胞數(shù)目，通過基于果實切面面積基礎(chǔ)上的換算方法，計算出無核葡萄果實細胞數(shù)目，本專利方法能更準(zhǔn)確地計算出無核葡萄果實細胞數(shù)目，能為研究無核葡萄果實細胞體積、果肉細胞數(shù)目與果實大小之間的關(guān)系，能為研究無核葡萄細胞發(fā)育與外源激素、內(nèi)源激素的關(guān)系提供更科學(xué)的計算方法。
背景技術(shù)：
無核葡萄因具有食用方便、口感好的特點而深受消費者喜愛，而且無核葡萄營養(yǎng)價值豐富，以無核白來說，漿果含糖15%~30%，以葡萄糖、果糖和戊糖為主，富含蘋果酸、酒石酸、檸檬酸等24種有機酸，鉀、鈣、鎂等礦質(zhì)元素，以及多種維生素、氨基酸等營養(yǎng)成分。另外，無核白果實中富含白黎蘆醇、兒茶素、黃酮及蹂酸等酚類物質(zhì)，對抗氧化、抗衰老、清除自由基、抗輻射、調(diào)節(jié)心血管及內(nèi)分泌系統(tǒng)、抗癌都具有一定的促進作用。而且無核葡萄也是目前鮮食、制干葡萄的主要類型，也是現(xiàn)在及將來葡萄育種的主要目標(biāo)之一。近年來，在世界鮮食葡萄中無核葡萄消費量有逐年上升的趨勢，美國80%以上的鮮食葡萄、98%以上的制干葡萄都是無核的，澳大利亞、南非及歐洲葡萄生產(chǎn)大國對無核葡萄的研究與開發(fā)也極為重視，在我國無核葡萄也越來越被消費者所青睞，因此葡萄無核性狀研究和無核品種培育已成為科學(xué)研究的重要方面。我國常見栽培的無核葡萄品種主要有無核白、雞心無核白、金星無核、火焰無核、紅臉無核、希姆勞特、京早晶、無核紫等品種。但大部分無核葡萄具有果實偏小，果肉部分相對較小。本特色果樹研究中心在前期研究中發(fā)現(xiàn)，無核葡萄果實大小的個體差異是由控制該器官特異基因表達水平變化而引起的，而且無核葡萄果實大小主要是由細胞體積與細胞數(shù)目共同決定的，在發(fā)育前期由減數(shù)分裂導(dǎo)致的細胞數(shù)目起主導(dǎo)作用；在發(fā)育后期，尤其是無核葡萄進入迅速膨大期之后，細胞體積對果實大小的影響起主導(dǎo)作用。國內(nèi)科研工作者在研究無核葡萄果肉組織細胞體積、數(shù)目時，所采用的方法是縱橫經(jīng)測量法，對取材位置沒有嚴(yán)格的限定，誤差較大，不能滿足科研需要，本發(fā)明專利方法是一種基于果實切面面積基礎(chǔ)上的細胞計數(shù)方法，能較好地減少實驗誤差，可用于不同時期無核葡萄梨果肉組織細胞體積、數(shù)目測定，為研究無核葡萄果肉細胞體積、細胞數(shù)目與梨果實大小之間的關(guān)系提供更科學(xué)的計算方法。也可以用于研究無核葡萄細胞發(fā)育與外源激素、內(nèi)源激素的關(guān)系，以及應(yīng)用于新品種選育過程中。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
針對無核葡萄果實相對較小，限制其鮮食領(lǐng)域、制干領(lǐng)域的發(fā)展，而傳統(tǒng)的細胞縱、橫莖測量法對細胞材料沒有嚴(yán)格要求、誤差較大，不能滿足研究影響無核葡萄果實大小機理，無核葡萄選種、育種的需要。本發(fā)明創(chuàng)造發(fā)明了一種無核葡萄果實細胞計數(shù)方法，先用游標(biāo)卡尺測量無核葡萄的縱莖、橫莖和側(cè)莖，之后用超薄刮胡刀片切取無核葡萄橫切組織（包含無核葡萄核心部分），迅速固定在FAA固定液中（65%酒精：40%甲醛溶液：冰醋酸=89:6:5），換3次固定液之后經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、半自動切片機切片、展片、梯度二甲苯脫臘、梯度酒精復(fù)水、番紅-固綠染色、脫水、封片、烘片等操作之后制作成永久切片，再將永久切片放在顯微鏡下拍片，利用軟件對細胞大小進行分析。本專利方法具有以下優(yōu)點:1.本發(fā)明方法是在無核葡萄果實切面面積基礎(chǔ)上進行的細胞計數(shù)方法，能更準(zhǔn)確地定位果肉層細胞，選取經(jīng)過無核細胞果心的切片進行測量，比傳統(tǒng)的細胞縱橫徑測量方法更科學(xué)。2.本發(fā)明方法避免了流式細胞法的取樣不均勻、不易分離細胞的繁瑣操作步驟，具有操作簡便，對染色時間要求不嚴(yán)格的特點。3.本發(fā)明方法能將果肉細胞染成藍色，疏導(dǎo)組織細胞染成紅色，具有立體染色效果。4.本發(fā)明方法節(jié)約時間和材料，不需要載玻片即可直接觀察，也可制作成永久切片，用于教學(xué)、科學(xué)研究中。
具體實施方法
1 將無核葡萄果實沿中心部分橫向切開，并用游標(biāo)卡尺測出無核葡萄果實縱徑Z、橫莖H、側(cè)莖C。2 樣品固定：用超薄刮胡刀片，在果心上方0.3~0.4 cm處將無核葡萄沿橫切方向切開，再在果心下方0.3~0.4 cm處將無核葡萄沿橫切方向切開，最后將包含果心的部分四等分，固定在FAA固定液中（65%酒精：40甲醛溶液：冰醋酸=89:6:5）（組織材料質(zhì)量和固定液體積比在1:5~10），第2天后更換一次固定液，第7天后更換一次固定液，第15天后固定完成，可保存在4±0.5℃冷藏柜中備用。3 試劑：番紅溶液，提前2個月將5.0 g番紅溶入500 ml 50%乙醇溶液中，過濾后保存在棕色瓶中，每7天搖勻一次；固綠溶液，提前2個月將2.5 g固綠溶入500 ml 95%乙醇溶液中，過濾后保存在棕色瓶中避光保存，每7天搖勻一次。4 操作步驟：（1）石蠟切片制作：取FAA固定液中固定好的樣品3~5塊于潔凈的青霉素瓶中，用5 mL 50%乙醇溶液浸洗固定好的無核葡萄果肉組織1h→依次用5 mL 的65%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、乙醇浸泡2h→新的乙醇浸泡1h→分別在乙醇和二甲苯體積比例依次為2∶1，1∶1，1∶2的混合溶液中各浸泡2h→純二甲苯中浸泡2h→新的5 mL純二甲苯中浸泡1h→將無核葡萄材料連同二甲苯倒入小蠟杯中，加入4 g碎蠟→放在42℃烘箱中，浸泡12 h→再往小蠟杯中加入1 g石蠟，將烘箱調(diào)成50℃，浸泡12h→將烘箱調(diào)成64℃，倒掉小蠟杯中的液體，往小蠟杯中倒入過濾干凈的熔點為60~62℃的蠟液，每12 h更換一次過濾干凈的熔點為60~62℃的蠟液，一共更換3次→用常規(guī)石蠟切片法將無核葡萄果肉切成16μm厚→展片→梯度二甲苯脫臘→梯度酒精復(fù)水→番紅-固綠染色→脫水→封片→烘片→制作成永久切片。（2）果肉細胞數(shù)目計算:在顯微鏡下選取無核葡萄果肉部分，計數(shù)一定面積S（10倍目鏡×20倍物鏡的視野面積約是0.26 mm2）內(nèi)的果肉細胞數(shù)目N（單位面積邊界處的細胞運用四舍五入計數(shù)法計數(shù)，大部分在單位面積內(nèi)的記作1，小部分在單位面積內(nèi)的記作0)。則單個細胞的平均面積S（均）=S/N，已知無核葡萄果實縱徑為Z、橫莖H、側(cè)莖C，則所測庫爾勒果實細胞數(shù)目為：
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