本發(fā)明涉及一種利用擬糖蛋白快速構(gòu)建糖芯片的技術(shù)，屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

糖類化合物是一切生物體維持生命活動(dòng)所需能量的主要來(lái)源。它不僅是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而且還具有特殊的生理活性。例如：肝臟中的肝素有抗凝血作用；血型糖蛋白與免疫活性有關(guān)；核酸的組成成分中含有糖類化合物——核糖和脫氧核糖；細(xì)胞識(shí)別也和細(xì)胞膜表面的糖蛋白有關(guān)。因此，研究糖類化合物對(duì)醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)領(lǐng)域來(lái)說(shuō)，具有極其重要的意義。

糖芯片起源于DNA或蛋白質(zhì)芯片的研究，技術(shù)成熟，是目前分析糖和各種生物物質(zhì)(如凝集素、細(xì)菌、病毒、抗體等)之間相互作用的有效工具。糖芯片通常是把糖類探針先固定在基質(zhì)材料(金屬、玻璃、硝化纖維或聚苯乙烯等)表面，然后將標(biāo)記有熒光團(tuán)的生物物質(zhì)注入表面，若發(fā)生相應(yīng)的結(jié)合行為，則結(jié)合后的受配體也帶有熒光團(tuán)，在紫外光照下會(huì)發(fā)出熒光。所以，傳統(tǒng)糖芯片在檢測(cè)時(shí)都需要對(duì)樣品進(jìn)行標(biāo)記，而標(biāo)記過(guò)程有可能會(huì)改變結(jié)合的選擇性；另外，熒光團(tuán)的去除也是一個(gè)需要考慮的問(wèn)題。

基于表面等離子體共振(SPR)現(xiàn)象的生物傳感器，由于其具有無(wú)需標(biāo)記、對(duì)樣品無(wú)損傷、動(dòng)態(tài)實(shí)時(shí)檢測(cè)等眾多優(yōu)點(diǎn)，成為過(guò)去三十年研究的熱點(diǎn)，被廣泛的應(yīng)用于各種生物分子的原位實(shí)時(shí)檢測(cè)和生物物質(zhì)間相互作用的研究。將其應(yīng)用在糖類化合物的研究中，具有傳統(tǒng)糖芯片無(wú)法取代的優(yōu)勢(shì)。SPR糖芯片也需要將糖類探針固定在傳感器表面，讓待測(cè)樣品流過(guò)傳感器表面，若樣品中有物質(zhì)能夠與表面的探針發(fā)生作用，就會(huì)引起檢測(cè)器信號(hào)的相應(yīng)變化。

所以不論是傳統(tǒng)糖芯片或SPR糖芯片，糖探針在材料表面高效、快速且穩(wěn)定的固定是重點(diǎn)。分子量較大的多糖探針雖然可以通過(guò)疏水相互作用或范德華力很容易的吸附在傳感器表面，但對(duì)于單糖或者二糖這類小分子糖類，無(wú)法直接固定在傳感器表面，需要在糖的端基修飾上-SH、-NH₂等功能基團(tuán)，以共價(jià)或非共價(jià)的形式固定在傳感器表面；也可以合成各種糖復(fù)合物(如樹枝狀高分子、DNA、脂類等)。而為了更好的模擬生物體內(nèi)的糖結(jié)構(gòu)，有時(shí)我們還希望對(duì)表面上糖探針的數(shù)量和分布得到控制。通過(guò)原子轉(zhuǎn)移自由基聚合(ATRP)，在傳感器表面形成聚合物刷可以實(shí)現(xiàn)這一目的。但由于制備過(guò)程較為繁瑣，且合成聚合物刷的過(guò)程需要合適的單體材料和特定的催化劑，成本較高，應(yīng)用有一定局限性，很難適應(yīng)大批量生產(chǎn)。

在此，我們提出一種快速固定單糖探針的新方法。利用牛血清蛋白(BSA)在各種材料(金、玻璃、聚苯乙烯等)表面良好的吸附能力，直接將連接有糖探針的BSA吸附于材料表面，形成糖芯片。由于蛋白質(zhì)通常具有三維結(jié)構(gòu)，而單糖探針又是和BSA蛋白外側(cè)暴露的氨基連接，所以這種方法也可以在一定程度控制糖探針在BSA上的數(shù)量和分布。由于該固定方法過(guò)程簡(jiǎn)單，原料易得且成本低廉，可適用性強(qiáng)，適合大批量生產(chǎn)，應(yīng)用前景非常廣闊。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種新型的簡(jiǎn)單、快速、適用性廣的單糖芯片制備技術(shù)。

本發(fā)明的技術(shù)原理

在一定pH條件下，將一端接有方酸二乙酯的單糖衍生物和牛血清蛋白按不同比例反應(yīng)，可以得到外側(cè)接有不同糖鏈數(shù)的擬糖蛋白。這種擬糖蛋白可以直接吸附于各種材料表面，不需要任何的材料表面預(yù)處理。

為實(shí)現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

(1)擬糖蛋白的制備

將氨基化的糖衍生物溶于pH＝7的磷酸鹽緩沖液中，然后向溶液中加入一定量的方酸二乙酯，在室溫下緩慢攪拌14h。反應(yīng)結(jié)束后，真空蒸發(fā)掉溶劑，使用快速柱層析的方法純化得到一端接有方酸二乙酯的糖衍生物。之后取一定量的牛血清蛋白(BSA)溶于pH＝9的硼酸鹽緩沖液，向溶液中加入上一步得到的糖衍生物，在室溫下緩慢攪拌18h。反應(yīng)結(jié)束后，用交聯(lián)葡聚糖凝膠(Sephadex G-75)純化產(chǎn)物，冷凍干燥后得到擬糖蛋白(即BSA-糖結(jié)合體)。通過(guò)控制牛血清蛋白和糖衍生物的加入質(zhì)量比，可以得到外側(cè)接有不同糖鏈數(shù)的擬糖蛋白。

(2)在材料表面的吸附

將制備好的擬糖蛋白溶于pH＝7的磷酸鹽緩沖液中，然后把材料表面直接浸泡在該溶液中，即可得到吸附有擬糖蛋白的材料表面。在循環(huán)流動(dòng)的環(huán)境下，一般1h的時(shí)間擬糖蛋白的吸附即可達(dá)到飽和。

本發(fā)明的有益效果是：

(1)本發(fā)明通過(guò)控制糖和蛋白的加入比例，可以得到外側(cè)接有不同數(shù)量單糖探針的擬糖蛋白。

(2)本發(fā)明制備的糖探針在牛血清蛋白上呈三維分布，且可以直接吸附在各種材料表面。

(3)本發(fā)明的制備過(guò)程非常簡(jiǎn)單，所需原料易得，制備成本低，適合大批量生產(chǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明利用方酸二乙酯連接單糖衍生物和蛋白質(zhì)制備擬糖蛋白的原理示意圖；

圖2為本發(fā)明利用擬糖蛋白快速構(gòu)建糖芯片以及糖芯片重建的流程示意圖；

圖3為本發(fā)明利用擬糖蛋白快速構(gòu)建糖芯片以及糖芯片重建的SPR動(dòng)力學(xué)曲線。

具體實(shí)施方式

為了更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于下面的實(shí)施例。

實(shí)施例1：

取220mg的氨基化的甘露糖衍生物溶于10ml pH＝7的磷酸鹽緩沖液中，然后向溶液中加入一定數(shù)量的方酸二乙酯，在室溫下緩慢攪拌14h。反應(yīng)結(jié)束后，真空蒸發(fā)掉溶劑，使用快速柱層析的方法純化得到一端接有方酸二乙酯的甘露糖衍生物。再取54.89mg的牛血清蛋白溶于10ml pH＝9的硼酸鹽緩沖液中，然后向溶液中加入10mg的一端接有方酸二乙酯的甘露糖衍生物，在室溫下緩慢攪拌18h。反應(yīng)結(jié)束后，用交聯(lián)葡聚糖凝膠(Sephadex G-75)純化產(chǎn)物，冷凍干燥后得到所制備的甘露糖-牛血清蛋白。根據(jù)基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜得到的蛋白分子量的測(cè)試結(jié)果推斷，上述制得的甘露糖-牛血清蛋白結(jié)構(gòu)中的甘露糖探針數(shù)為11。

取上述制得的甘露糖-牛血清蛋白1.4mg溶于1.4ml pH＝7的磷酸鹽緩沖液中，通過(guò)蠕動(dòng)泵的輸送，以700μL/min的流速在金膜表面循環(huán)流動(dòng)1h，擬糖蛋白可以直接吸附到金表面，形成可用于SPR檢測(cè)的糖芯片。

然后使用刀豆凝集素(ConA)對(duì)SPR糖芯片的性能做出評(píng)價(jià)。圖2、圖3分別為糖芯片的構(gòu)建及重建的流程示意圖和SPR動(dòng)力學(xué)曲線。圖3的SPR動(dòng)力學(xué)曲線結(jié)果可以表明，該方法制備的SPR糖芯片可以用于糖-凝集素相互作用的研究，能夠直觀的反映出整個(gè)結(jié)合和解離過(guò)程。而且只需使用低濃度的氫氧化鈉溶液就可以有效地重建芯片表面，芯片可以重復(fù)使用。