本發(fā)明涉及微球測(cè)速統(tǒng)計(jì)分析領(lǐng)域，具體涉及流式細(xì)胞儀的流動(dòng)室內(nèi)層流穩(wěn)定性評(píng)估領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

流式細(xì)胞儀是一種對(duì)懸液中處于高速、直線流動(dòng)的單細(xì)胞或其他顆粒，通過檢測(cè)散射光信號(hào)和(或)熒光信號(hào)，實(shí)現(xiàn)高速逐一多參數(shù)定量分析的臨床檢驗(yàn)分析儀器。其中，液路系統(tǒng)的主要目的是使包含被測(cè)樣品(細(xì)胞或微球)的樣本液在鞘液的包裹下，形成穩(wěn)定的層流，從而達(dá)到獲取單細(xì)胞流的目的。液路系統(tǒng)的穩(wěn)定性將直接影響細(xì)胞/微球通過流動(dòng)室檢測(cè)區(qū)域的位置及時(shí)間，進(jìn)而影響相應(yīng)散射光及熒光信號(hào)的信號(hào)強(qiáng)度及光脈沖持續(xù)時(shí)間。對(duì)液路系統(tǒng)穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)估，尤其是對(duì)細(xì)胞/微球通過流動(dòng)室檢測(cè)區(qū)域時(shí)的速度穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)估，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)整臺(tái)儀器穩(wěn)定性的快速預(yù)判。

目前，流式細(xì)胞儀液路系統(tǒng)穩(wěn)定性的判定方法主要有壓力法和脈沖信號(hào)特征分析法。壓力法是指通過對(duì)液路系統(tǒng)中最關(guān)鍵的樣本液壓力和鞘液壓力進(jìn)行觀測(cè)，并且針對(duì)不同的檢測(cè)速率要求，兩者變化幅度在一定范圍之內(nèi)就可判定液路系統(tǒng)穩(wěn)定。但是，壓力法是對(duì)作用于樣本液和鞘液的氣體壓力進(jìn)行檢測(cè)，而不是直接對(duì)液體流速進(jìn)行檢測(cè)，所以無法衡量后續(xù)進(jìn)樣結(jié)構(gòu)及管路對(duì)層流及細(xì)胞/微球速度的影響。脈沖信號(hào)特征分析法是指通過數(shù)據(jù)采集模塊對(duì)細(xì)胞經(jīng)過流動(dòng)室檢測(cè)區(qū)域時(shí)產(chǎn)生的散射光及熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)，利用得到的脈沖寬度的穩(wěn)定性來表征細(xì)胞速度的穩(wěn)定性。該方法需要完成細(xì)胞/微球的散射光激發(fā)、收集、光電轉(zhuǎn)換、脈沖處理和參數(shù)提取等一系列操作，涉及到光路系統(tǒng)、電子電路處理系統(tǒng)，從而增加了測(cè)量過程的不確定因素，無法真實(shí)反映細(xì)胞/微球在流動(dòng)室內(nèi)的流動(dòng)情況。

高精度的流場(chǎng)特性分析方法主要是粒子圖像測(cè)速法(Particl image velocimetry,PIV),其速度測(cè)量依賴于散布在流場(chǎng)中的示蹤粒子，通過測(cè)量示蹤粒子在已知很短時(shí)間間隔內(nèi)的位移來間接地測(cè)量流場(chǎng)的瞬時(shí)速度分布，并可提供豐富的流場(chǎng)空間結(jié)構(gòu)以及流動(dòng)特性。然而，PIV技術(shù)用于液體流場(chǎng)分析所使用的微球尺寸與流式細(xì)胞儀檢測(cè)樣本尺寸相近，從而無法利用多示蹤粒子對(duì)流動(dòng)室內(nèi)層流及單細(xì)胞流的流動(dòng)特性進(jìn)行分析。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決上述問題，本發(fā)明的目的在于提供一種流式細(xì)胞儀層流穩(wěn)定性評(píng)估方法，所述方法包括以下步驟：1)利用高速顯微圖像采集系統(tǒng)對(duì)流動(dòng)室內(nèi)微球的90°Mie散射光進(jìn)行檢測(cè)；2)利用灰色聚類分析方法對(duì)采集到的大量圖像中光強(qiáng)/拖尾長(zhǎng)度不足、正常、衍射及重疊等情況進(jìn)行聚類分析，獲得標(biāo)準(zhǔn)的正常拖尾圖像，具體實(shí)現(xiàn)步驟如下：設(shè)有n個(gè)觀測(cè)對(duì)象，m個(gè)評(píng)估指標(biāo)，s個(gè)不同的灰類，則每個(gè)觀測(cè)對(duì)象有m個(gè)特征數(shù)據(jù)需要觀測(cè)，可得序列如式(1)所示：

X₁＝(x₁(1),x₁(2),…,x₁(n))

X₂＝(x₂(1),x₂(2),…,x₂(n))

……

X_m＝(x_m(1),x_m(2),…,x_m(n)) (1)

確定灰類1,2,…,s的中心點(diǎn)λ₁,λ₂,...,λ_s，將各個(gè)指標(biāo)的取值范圍也相應(yīng)地劃分為s個(gè)灰類；將灰類向不同方向進(jìn)行延拓，考慮增加0灰類和s+1灰類，并確定其中心點(diǎn)λ₀和λ_s+1，從而得到新的中心點(diǎn)序列：λ₀,λ₁,λ₂,...,λ_s,λ_s+1，連接點(diǎn)(λ_k,1)與第k-1個(gè)小灰類的中心點(diǎn)(λ_k-1,0)，連接點(diǎn)(λ_l,1)與第l+1個(gè)小灰類的中心點(diǎn)(λ_l+1,0)，得到j(luò)指標(biāo)關(guān)于k灰類的梯形白化權(quán)函數(shù)對(duì)于指標(biāo)j的一個(gè)觀測(cè)值x，可由

計(jì)算出其屬于灰類k(k＝1,2,…s)的隸屬度計(jì)算對(duì)象i(i＝1,2,…,n)關(guān)于灰類k的綜合聚類系數(shù)

其中，為j指標(biāo)k子類白化權(quán)函數(shù)，η_j為指標(biāo)j在綜合聚類中的權(quán)重，

由判斷對(duì)象i屬于灰類k*；

3)利用中點(diǎn)法確定拖尾邊界，并計(jì)算相應(yīng)的微球流速；4)利用微球流速的穩(wěn)定性表征流式細(xì)胞儀液路系統(tǒng)的穩(wěn)定性。

優(yōu)選地，所述步驟2)中進(jìn)行聚類分析的指標(biāo)按照如下方式確定：

分別對(duì)圖像中光強(qiáng)/拖尾長(zhǎng)度不足、正常、衍射及重疊這四類圖像中每一行像素點(diǎn)的灰度值求和，得到橫向灰度總和曲線；對(duì)橫向灰度總和曲線求解一階導(dǎo)數(shù)；設(shè)定正負(fù)向閾值，并對(duì)閾值范圍內(nèi)的極值點(diǎn)個(gè)數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，有效極值點(diǎn)個(gè)數(shù)作為聚類分析的指標(biāo)；

分別對(duì)圖像中光強(qiáng)/拖尾長(zhǎng)度不足、正常、衍射及重疊這四類圖像中每一列像素點(diǎn)的灰度值求和，得到縱向灰度總和曲線；對(duì)縱向灰度總和曲線求解一階導(dǎo)數(shù)；設(shè)定正負(fù)向閾值，并對(duì)曲線經(jīng)過正負(fù)閾值的次數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，與正負(fù)閾值的交點(diǎn)個(gè)數(shù)可作為聚類分析的指標(biāo)。

優(yōu)選地，所述步驟3)中微球流速由公式v＝l/t求得，其中l(wèi)為微球拖尾長(zhǎng)度，t為相機(jī)曝光時(shí)間。

優(yōu)選地，所述步驟4)還包括由公式計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差，利用拖尾長(zhǎng)度的平均值對(duì)微球速度進(jìn)行表征，并利用拖尾長(zhǎng)度的標(biāo)準(zhǔn)差對(duì)微球速度的穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)估。

應(yīng)當(dāng)理解，前述大體的描述和后續(xù)詳盡的描述均為示例性說明和解釋，并不應(yīng)當(dāng)用作對(duì)本發(fā)明所要求保護(hù)內(nèi)容的限制。

附圖說明

參考隨附的附圖，本發(fā)明更多的目的、功能和優(yōu)點(diǎn)將通過本發(fā)明實(shí)施方式的如下描述得以闡明，其中：

圖1為高速圖像采集微球測(cè)速原理圖；

圖2為微球拖尾圖像；

圖3為橫向灰度總和曲線：圖3(a)正?；翌悾粓D3(b)長(zhǎng)度不足灰類；圖3(c)重疊灰類；

圖4為橫向灰度總和導(dǎo)數(shù)曲線：圖4(a)正?；翌?；圖4(b)長(zhǎng)度不足灰類；圖4(c)重疊灰類；

圖5縱向灰度總和曲線：圖5(a)正常灰類；圖5(b)長(zhǎng)度不足灰類；圖5(c)重疊灰類；

圖6為縱向灰度總和導(dǎo)數(shù)曲線：圖6(a)正?；翌悾粓D6(b)長(zhǎng)度不足灰類；圖6(c)重疊灰類；

圖7為列元素灰度值上升沿曲線圖；

圖8為列元素灰度值下降沿曲線圖。

具體實(shí)施方式

通過參考示范性實(shí)施例，本發(fā)明的目的和功能以及用于實(shí)現(xiàn)這些目的和功能的方法將得以闡明。然而，本發(fā)明并不受限于以下所公開的示范性實(shí)施例；可以通過不同形式來對(duì)其加以實(shí)現(xiàn)。說明書的實(shí)質(zhì)僅僅是幫助相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員綜合理解本發(fā)明的具體細(xì)節(jié)。

在下文中，將參考附圖描述本發(fā)明的實(shí)施例。在附圖中，相同的附圖標(biāo)記代表相同或類似的部件，或者相同或類似的步驟。

本發(fā)明提供了一種流式細(xì)胞儀的流動(dòng)室內(nèi)層流穩(wěn)定性評(píng)估的方法，該方法利用高速顯微圖像采集系統(tǒng)對(duì)流動(dòng)室內(nèi)微球的90°Mie散射光進(jìn)行檢測(cè)，并利用灰色聚類分析方法對(duì)采集到的大量圖像中光強(qiáng)/拖尾長(zhǎng)度不足、正常、衍射及重疊等情況進(jìn)行聚類分析，獲得標(biāo)準(zhǔn)的正常拖尾圖像。然后，利用中點(diǎn)法確定拖尾邊界，并計(jì)算相應(yīng)的微球流速。最后，利用微球流速的穩(wěn)定性表征流式細(xì)胞儀液路系統(tǒng)的穩(wěn)定性。

本發(fā)明選取90°側(cè)向散射光作為觀測(cè)對(duì)象可以避免激發(fā)光源的直射光干擾，并且去除傳統(tǒng)顯微圖像采集的背景光源，從而減小背景光信息同時(shí)提高圖像的對(duì)比度。當(dāng)微球經(jīng)過流動(dòng)室激光激發(fā)區(qū)域時(shí)，通過改變高速相機(jī)的曝光時(shí)間可以對(duì)微球的拖尾圖像進(jìn)行采集，進(jìn)而獲得微球的流速?；?0°Mie散射的高速圖像采集微球測(cè)速方法示意圖如圖1所示。

由于流式細(xì)胞儀每秒鐘可以對(duì)數(shù)萬個(gè)細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)高速相機(jī)的曝光瞬間微球在流動(dòng)室內(nèi)的位置具有隨機(jī)性，所以采集到的微球拖尾圖像一般包括空白、正常、長(zhǎng)度不足和重疊4種情況，如圖2所示。

本發(fā)明采用基于梯形白化權(quán)函數(shù)的聚類分析方法對(duì)微球拖尾圖像進(jìn)行分類，其具體實(shí)現(xiàn)步驟如下：

設(shè)有n個(gè)觀測(cè)對(duì)象，m個(gè)評(píng)估指標(biāo)，s個(gè)不同的灰類。則每個(gè)觀測(cè)對(duì)象有m個(gè)特征數(shù)據(jù)需要觀測(cè)，可得序列如式(1)所示：

X₁＝(x₁(1),x₁(2),…,x₁(n))

X₂＝(x₂(1),x₂(2),…,x₂(n))

… …

X_m＝(x_m(1),x_m(2),…,x_m(n)) (1)

確定灰類1,2,…,s的中心點(diǎn)λ₁,λ₂,...,λ_s，將各個(gè)指標(biāo)的取值范圍也相應(yīng)地劃分為s個(gè)灰類。將灰類向不同方向進(jìn)行延拓，考慮增加0灰類和s+1灰類，并確定其中心點(diǎn)λ₀和λ_s+1，從而得到新的中心點(diǎn)序列：λ₀,λ₁,λ₂,...,λ_s,λ_s+1，連接點(diǎn)(λ_k,1)與第k-1個(gè)小灰類的中心點(diǎn)(λ_k-1,0),連接點(diǎn)(λ_l,1)與第l+1個(gè)小灰類的中心點(diǎn)(λ_l+1,0)，得到j(luò)指標(biāo)關(guān)于k灰類的梯形白化權(quán)函數(shù)對(duì)于指標(biāo)j的一個(gè)觀測(cè)值x，可由

計(jì)算出其屬于灰類k(k＝1,2,…s)的隸屬度計(jì)算對(duì)象i(i＝1,2,…,n)關(guān)于灰類k的綜合聚類系數(shù)

其中，為j指標(biāo)k子類白化權(quán)函數(shù)，η_j為指標(biāo)j在綜合聚類中的權(quán)重。

由判斷對(duì)象i屬于灰類k*。

本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中激發(fā)光選用波長(zhǎng)為605nm的激光二極管，功率為80mW；顯微物鏡為日本Sigma Koki公司的SPAHL-50,數(shù)值孔徑為0.42，放大倍率50，工作距離20.5mm；圖像采集系統(tǒng)使用Dantec公司的Q450高速圖像采集系統(tǒng)，配套的高速CMOS相機(jī)為Vision research公司的V310,最大分辨率1280×800，最高速度為50萬fps，最小快門時(shí)間1us，單個(gè)像素點(diǎn)的幾何尺寸為20μm×20μm；檢測(cè)樣品使用Beckman Coulter公司的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控微球Flow-Check Pro Fluoro-spheres A69183，微球直徑為20±1μm。曝光時(shí)間設(shè)置為40μm，利用流式細(xì)胞儀執(zhí)行上樣操作。層流狀態(tài)穩(wěn)定后開始進(jìn)行圖像采集，采樣幀率設(shè)置為3300幀/s，采樣圖片總數(shù)設(shè)置為12000。

分別對(duì)4類圖像中每一行像素點(diǎn)的灰度值求和，得到橫向灰度總和曲線如圖3所示。設(shè)定灰度值閾值為35，對(duì)閾值以上行的個(gè)數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)可作為聚類分析的指標(biāo)。不足灰類由于在縱向存在灰度值漸變過程，其橫向灰度總和曲線中上升沿為緩慢變化；正?；翌悷o縱向灰度漸變過程，故上升沿及下降沿變化較快；重疊灰類在縱向無漸變過程，但存在多條拖尾重疊的現(xiàn)象，故其上升沿與下降沿個(gè)數(shù)均大于1。對(duì)圖3中曲線求解一階導(dǎo)數(shù)，如圖4所示。設(shè)定正向閾值為55，負(fù)向閾值為-50，并對(duì)閾值范圍內(nèi)的極值點(diǎn)個(gè)數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。即當(dāng)極值點(diǎn)的幅值大于55或小于-55時(shí)，作為有效極值點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。不足、正常、重疊的有效極值點(diǎn)個(gè)數(shù)分別為1，2，4。有效極值點(diǎn)個(gè)數(shù)可作為聚類分析的指標(biāo)。

如果不足灰類的拖尾長(zhǎng)度嚴(yán)重不足或灰度值不足，可能造成有效極值點(diǎn)個(gè)數(shù)為0；重疊灰類有多種可能性，并且重疊灰類的拖尾數(shù)量、重疊位置、重疊方式等不確定，重疊灰類的有效極值點(diǎn)個(gè)數(shù)可以是大于2的其他整數(shù)。

同理，分別對(duì)4類圖像中每一列像素點(diǎn)的灰度值求和，得到縱向灰度總和曲線如圖5所示。設(shè)定灰度值閾值為200，對(duì)閾值以上列的個(gè)數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)可作為聚類分析的指標(biāo)。不足灰類由于在縱向存在灰度值漸變過程，其縱向灰度總和的峰值較??；重疊灰類在縱向完全重疊的幾率較低，故灰度值不為0的列數(shù)比正常情況要多。對(duì)圖5中曲線求解一階導(dǎo)數(shù)，如圖6所示。設(shè)定正向閾值為150，負(fù)向閾值為-250，并對(duì)曲線經(jīng)過正負(fù)閾值的次數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。正?；翌惖耐衔矆D像灰度分布相對(duì)均勻，故其縱向灰度總和一階導(dǎo)數(shù)曲線具有單調(diào)增減特性，在正負(fù)閾值附近不存在抖動(dòng)，與正負(fù)閾值的交點(diǎn)為4個(gè)。不足和重疊灰類的拖尾圖像灰度分布存在漸變或跳變，在正負(fù)閾值附近存在抖動(dòng)，故交點(diǎn)數(shù)不小于4。與正負(fù)閾值的交點(diǎn)個(gè)數(shù)可作為聚類分析的指標(biāo)。

微球速度由公式v＝l/t求得，其中l(wèi)為微球拖尾長(zhǎng)度，t為相機(jī)曝光時(shí)間。為了保證對(duì)液路系統(tǒng)穩(wěn)定性的準(zhǔn)確評(píng)估，需要對(duì)拖尾灰度值的上升和下降過程進(jìn)行分析，合理選擇拖尾邊界，減小微球拖尾長(zhǎng)度的計(jì)算誤差。

對(duì)正常圖像的灰度值進(jìn)行列求和，并以灰度值總和最大值為中心對(duì)稱選擇5列像素點(diǎn)。選取的5列像素點(diǎn)灰度值上升過程如圖7所示。從圖7可以看出，該5列元素在第303行之前的灰度值只有微小抖動(dòng)，并基本保持平穩(wěn)。從第304列到第309列，灰度值快速上升，并呈線性變化。同理，5列像素點(diǎn)灰度值的下降過程如圖8所示。選取的5列像素點(diǎn)灰度值在第420列之前基本保持平穩(wěn)，從第421列到第428列灰度值快速下降，并呈線性變化。

基于各列像素點(diǎn)灰度值快速線性變化的特性，本發(fā)明選用中點(diǎn)法對(duì)拖尾的邊界進(jìn)行確定。中點(diǎn)法是指選取灰度值與邊緣變化過程的平均值最接近的像素點(diǎn)作為拖尾邊界。以圖7、8為例，上升過程5列像素點(diǎn)的灰度平均值為36.5、36.5、34、33.1和35與第307行像素點(diǎn)的灰度值(38、37、35、34和35)最接近，故將第307行作為拖尾的起始邊界點(diǎn)；下降過程5列像素點(diǎn)的灰度平均值為33.2、31.7、31.2、31.4和27.4與第307行像素點(diǎn)的灰度值(32、30、30、31和27)最接近，故將第424行作為拖尾的起始邊界點(diǎn)。

利用中點(diǎn)法確定正常圖像的拖尾邊界，計(jì)算拖尾長(zhǎng)度所占像素點(diǎn)個(gè)數(shù)的平均值為116.9個(gè)，由公式計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差σ＝1.7。由于無法獲取流動(dòng)室內(nèi)微球速度的真值，故可利用拖尾長(zhǎng)度的平均值對(duì)微球速度進(jìn)行表征，并利用拖尾長(zhǎng)度的標(biāo)準(zhǔn)差對(duì)微球速度的穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)估，進(jìn)而完成對(duì)流式細(xì)胞儀層流穩(wěn)定性的評(píng)估。

結(jié)合這里披露的本發(fā)明的說明和實(shí)踐，本發(fā)明的其他實(shí)施例對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員都是易于想到和理解的。說明和實(shí)施例僅被認(rèn)為是示例性的，本發(fā)明的真正范圍和主旨均由權(quán)利要求所限定。