本發(fā)明涉及電致化學(xué)發(fā)光傳感器領(lǐng)域，具體而言，涉及具有雙信號源的電致化學(xué)發(fā)光傳感器及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

電致化學(xué)發(fā)光生物分析是近年來才發(fā)展起來的一種新型的分析方法，是將化學(xué)發(fā)光、電化學(xué)、生物分析、微電子技術(shù)及傳感技術(shù)相結(jié)合的最新產(chǎn)物，主要用于臨床、農(nóng)業(yè)、環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域。

電致化學(xué)發(fā)光(Electrogenerated Chemiluminescence,ECL)，是某些具有電致化學(xué)發(fā)光活性的物質(zhì)處在一定的電位時，與溶液中的氧化還原物質(zhì)作用生成的不穩(wěn)定激發(fā)態(tài)遷移回基態(tài)時所導(dǎo)致的化學(xué)發(fā)光。

目前，現(xiàn)有的電致化學(xué)發(fā)光傳感器大多是由一種發(fā)光物質(zhì)(比如量子點)作為信號源，這種電致化學(xué)發(fā)光傳感器的信號源單一，信號不穩(wěn)定，極容易受電致化學(xué)發(fā)光儀器或者一些環(huán)境因素的影響，出現(xiàn)一些假陽性或者假陰性信號，給這類使用電致化學(xué)發(fā)光傳感器的檢測分析帶來諸多不便。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一目的在于提供一種具有雙信號源的電致化學(xué)發(fā)光的生物傳感器，這種生物傳感器的靈敏度和精確度高，能夠有效避免由儀器、環(huán)境因素、以及一些人為操作因素導(dǎo)致的假陽性或假陰性信號對檢測的干擾，使檢測結(jié)果的可靠性高。

本發(fā)明的第二目的在于提供一種上述的具有雙信號源的電致化學(xué)發(fā)光的生物傳感器的制備方法，這種制備方法的工藝簡單，反應(yīng)條件溫和，可操作性強(qiáng)。

本發(fā)明的第三目的在于提供一種具有雙信號源的電致化學(xué)發(fā)光的生物傳感器在檢測生物酶的抑制劑或激活劑中的應(yīng)用，這種基于生物酶的生物傳感器的靈敏度高，能夠?qū)悠分械纳锩傅囊种苿┗蚣せ顒┻M(jìn)行超微量檢測，且檢測結(jié)果可信度高。

為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：

一種具有雙信號源的電致化學(xué)發(fā)光的生物傳感器，生物傳感器包括電極和附著于電極的表面的發(fā)光復(fù)合物，發(fā)光復(fù)合物包括兩種電致化學(xué)發(fā)光物質(zhì)，兩種電致化學(xué)發(fā)光物質(zhì)分別以O(shè)₂和H₂O₂作為共反應(yīng)試劑，且兩種電致化學(xué)發(fā)光物質(zhì)所發(fā)出的電致化學(xué)發(fā)光信號互不干擾。

一種具有雙信號源的電致化學(xué)發(fā)光的生物傳感器的制備方法，其包括：

步驟a：制備包含兩種電致化學(xué)發(fā)光物質(zhì)的發(fā)光復(fù)合物，所述兩種電致化學(xué)發(fā)光物質(zhì)分別以O(shè)₂和H₂O₂作為共反應(yīng)試劑，且所述兩種電致化學(xué)發(fā)光物質(zhì)所發(fā)出的電致化學(xué)發(fā)光信號互不干擾；

步驟b：利用電極表面修飾技術(shù)，將所述發(fā)光復(fù)合物修飾到電極的表面。

一種具有雙信號源的電致化學(xué)發(fā)光的生物傳感器在檢測生物酶的抑制劑或激活劑中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

這種生物傳感器，在一個循環(huán)電位掃描下，會發(fā)出兩種電致化學(xué)發(fā)光信號，并利用O₂和H₂O₂分別作為這兩種電致化學(xué)發(fā)光物質(zhì)的共反應(yīng)試劑。這兩種電致化學(xué)發(fā)光物質(zhì)的發(fā)光電位沒有重疊，同時，采用的兩種電致化學(xué)發(fā)光物質(zhì)之間沒有能量轉(zhuǎn)移，使得這種生物傳感器的靈敏度和精確度顯著提高，不僅能夠避免能量轉(zhuǎn)移的復(fù)雜性，而且能夠有效避免由儀器、環(huán)境因素、以及一些人為操作因素導(dǎo)致的假陽性或假陰性信號對檢測的干擾，使檢測結(jié)果的可靠性高。

這種生物傳感器的制備方法，通過在電極表面修飾發(fā)光復(fù)合物，使得電極上同時具有兩種電致化學(xué)發(fā)光物質(zhì)，使這種電極能夠同時產(chǎn)生兩種電致化學(xué)發(fā)光信號，這種制備方法的工藝簡單，反應(yīng)條件溫和，可操作性強(qiáng)。

利用這種生物傳感器能夠?qū)悠分猩锩傅囊种苿┗蚣せ顒┻M(jìn)行檢測分析，定性或者定量分析均可以，且這種基于生物酶的生物傳感器的靈敏度高，其最低檢測限為1.25×10^-13mol/L，即這種生物傳感器能夠?qū)悠分械纳锩傅囊种苿┗蚣せ顒┻M(jìn)行超微量檢測，可廣泛應(yīng)用于生物、農(nóng)業(yè)或環(huán)境分析等領(lǐng)域。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，以下將對實施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。

圖1為實施例7中的生物傳感器的制備過程以及相應(yīng)的響應(yīng)原理圖；

圖2為實施例7中的生物傳感器在飽和空氣下pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液中對不同濃度的乙基對氧磷響應(yīng)的ECL譜圖；

圖3為用實施例7中的生物傳感器檢測乙基對氧磷的工作曲線；

圖4為驗證實施例7中的生物傳感器的穩(wěn)定性的ECL譜圖；

圖5為裸電極(a線)、修飾有PFO-GO-CdTe QDs的電極(b線)、以及修飾有AChE-ChOx的生物傳感器(c線)的循環(huán)伏安圖譜，電位：-0.2-0.6V，掃速：100mV/s；

圖6為不同材料的透射電子顯微鏡圖，其中，A圖為PFO dots的TEM圖；B圖為GO-CdTe QDs的TEM圖；C圖為GO-CdTe QDs的放大圖；D圖為PFO-GO-CdTe QDs的TEM圖。

具體實施方式

下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

本實施方式提供一種具有雙信號源的ECL生物傳感器，生物傳感器包括電極和附著于電極的表面的發(fā)光復(fù)合物，發(fā)光復(fù)合物包括兩種ECL物質(zhì)，兩種ECL物質(zhì)分別以O(shè)₂和H₂O₂作為共反應(yīng)試劑，且兩種ECL物質(zhì)所發(fā)出的ECL信號互不干擾。

在本發(fā)明中，"兩種ECL物質(zhì)所發(fā)出的ECL信號互不干擾”指這兩種ECL物質(zhì)的發(fā)光電位沒有重疊，相互之間沒有影響。

這種生物傳感器，在一個循環(huán)電位掃描下，會發(fā)出兩種ECL信號，并利用O₂和H₂O₂分別作為這兩種ECL物質(zhì)的共反應(yīng)試劑，當(dāng)O₂和H₂O₂分別為某個化學(xué)反應(yīng)或生物反應(yīng)的反應(yīng)物和生成物時，即可實現(xiàn)這兩種ECL信號的呈相反變化的趨勢。

O₂和H₂O₂為共反應(yīng)試劑，能夠促進(jìn)ECL物質(zhì)中發(fā)光基團(tuán)的發(fā)光效率，使其ECL信號顯著增強(qiáng)，即當(dāng)該生物傳感器的表面有O₂時，以O(shè)₂為共反應(yīng)試劑的ECL物質(zhì)的ECL信號便會顯著增強(qiáng)，O₂的濃度越大，該ECL信號越強(qiáng)；同理，當(dāng)該生物傳感器的表面有H₂O₂時，以H₂O₂為共反應(yīng)試劑的ECL物質(zhì)的ECL信號便會顯著增強(qiáng)，H₂O₂的濃度越大，該ECL信號越強(qiáng)。

這兩種ECL物質(zhì)的發(fā)光電位沒有重疊，同時，采用的兩種ECL物質(zhì)之間沒有能量轉(zhuǎn)移，使得這種生物傳感器的靈敏度和精確度顯著提高，不僅能夠避免能量轉(zhuǎn)移的復(fù)雜性，而且能夠有效避免由儀器、環(huán)境因素、以及一些人為操作因素導(dǎo)致的假陽性或假陰性信號對檢測的干擾，使檢測結(jié)果的可靠性高。

進(jìn)一步地，在被發(fā)明較佳的實施例中，發(fā)光復(fù)合物還包括導(dǎo)電載體，兩種ECL物質(zhì)固載于導(dǎo)電載體。

本發(fā)明中的“固載”指某種物質(zhì)通過物理或化學(xué)方法使之與固體載體相結(jié)合,而形成一種特殊的復(fù)合物。

加入導(dǎo)電載體，使電極與這兩種電致發(fā)光物質(zhì)之間的電子轉(zhuǎn)移速率增強(qiáng)，同時，導(dǎo)電載體作為的載體，有助于將這兩種電致發(fā)光物質(zhì)修飾到電極上。在本發(fā)明中，電極優(yōu)選為玻碳電極、金電極或者其他能滿足實際需求的電極。

進(jìn)一步優(yōu)選地，導(dǎo)電載體為石墨稀。石墨稀具有片層結(jié)構(gòu)，其比表面積大、導(dǎo)電性能好，且容易對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，使兩種電致發(fā)光物質(zhì)能夠固載于石墨稀，即兩種電致發(fā)光物質(zhì)與石墨稀形成復(fù)合物。

在本發(fā)明較佳的實施例中，生物傳感器還包括生物酶，生物酶附著于發(fā)光復(fù)合物的表面，生物酶在酶促反應(yīng)中的反應(yīng)物包括O₂，且生物酶在酶促反應(yīng)中的生成物包括H₂O₂。

O₂和H₂O₂分別為很多生物酶參與的酶促反應(yīng)的反應(yīng)物和生成物，在電極的發(fā)光復(fù)合物表面修飾生物酶，能夠?qū)崿F(xiàn)在電極表面原位產(chǎn)生O₂和H₂O₂，并使O₂和H₂O₂的含量始終處于負(fù)相關(guān)的變化趨勢，進(jìn)而實現(xiàn)兩種ECL信號也呈現(xiàn)相反的變化趨勢，使得僅通過兩種ECL信號的比值便可對生物酶的活性進(jìn)行檢測、評估，同時也可對這種生物酶的抑制劑或激活劑進(jìn)行檢測分析。

進(jìn)一步的，在本發(fā)明較佳的實施例中，兩種ECL物質(zhì)分別為陽極發(fā)光物質(zhì)和陰極發(fā)光物質(zhì)，陽極發(fā)光物質(zhì)以H₂O₂為共反應(yīng)試劑，陰極發(fā)光物質(zhì)以O(shè)₂為共反應(yīng)試劑。

當(dāng)給予該生物傳感器施加掃描電壓，例如采用ECL檢測儀對生物傳感器施加-2～2V的掃描電壓，這兩種ECL物質(zhì)中的一種會在掃描電壓為-2～0V的過程中出現(xiàn)ECL信號，即該ECL物質(zhì)為陰極發(fā)光物質(zhì)；而另一種ECL物質(zhì)則會在掃描電壓為0～2V的過程中出現(xiàn)ECL信號，即該ECL物質(zhì)為陽極發(fā)光物質(zhì)。在同一個生物傳感器中選擇這兩種ECL物質(zhì)的好處在于，這兩種ECL發(fā)光物質(zhì)的發(fā)光電位沒有重疊，相互之間沒有交叉干擾，從而降低檢測結(jié)果的誤差。

優(yōu)選地，陽極發(fā)光物質(zhì)為聚芴衍生物或魯米諾，陰極發(fā)光物質(zhì)為量子點。

魯米諾和聚芴衍生物，都是一種ECL物質(zhì)。酶促反應(yīng)產(chǎn)生的H₂O₂可作為魯米諾或聚芴衍生物的共反應(yīng)試劑，能夠增強(qiáng)魯米諾或聚芴衍生物的ECL信號。

量子點具有寬的激發(fā)譜和窄的發(fā)射譜，且具有很好的光穩(wěn)定性，是一種理想的ECL物質(zhì)。參與酶促反應(yīng)的O₂可作為量子點的共反應(yīng)試劑，能夠增強(qiáng)量子點的ECL信號。量子點可以為CdS、CdTe、CdSe等。

更為優(yōu)選地，聚芴衍生物為聚(9,9-正二辛基芴基-2,7-二基)(PFO)顆粒，陰極發(fā)光物質(zhì)為CdTe量子點。這兩種ECL物質(zhì)組合使用，所得到的生物傳感器的抗干擾性和靈敏度更好。

O₂能使CdTe量子點(CdTe QDs)的ECL信號增強(qiáng)的原理是：

CdTe QDs得電子被還原為CdTe QDs^·-(式1)；O₂得電子生成OOH^-和OH^-(式2)；隨后，CdTe QDs^·-和OOH^-進(jìn)一步反應(yīng)生成激發(fā)態(tài)的CdTe QDs^*(式3)；最后，激發(fā)態(tài)的CdTe QDs^*回到基態(tài)，產(chǎn)生ECL信號(式4)，具體如下所示：

CdTe QDs+e^-→CdTe QDs^·- (1)

O₂+H₂O+2e^-→OOH^-+OH^- (2)

2CdTe QDs^·-+OOH^-+H₂O→3OH^-+2CdTe QDs* (3)

CdTe QDs*→CdTe QDs+hv (4)

H₂O₂能使PFO的ECL信號增強(qiáng)的原理是：

PFO可以被氧化成PFO^·+(式1)；H₂O₂水解為HO₂^-和H⁺(式2)；隨后，HO₂^-失去電子生成O₂^·-(式3和式4),O₂^·-會進(jìn)一步與PFO^·+反應(yīng)生成激發(fā)態(tài)的PFO^*(式5)。最后，PFO^*回到基態(tài)，產(chǎn)生ECL信號(式6)，具體如下所示：

PFO-e→PFO^·+ (1)

H₂O₂→HO₂^-+H⁺ (2)

HO₂^--e→HO₂^· (3)

HO₂^·→O₂^·-+H⁺ (4)

PFO^·++O₂^·-→PFO*+O₂ (5)

PFO*→PFO+hv (6)

進(jìn)一步的，在本發(fā)明較佳的實施例中，生物酶為乙酰膽堿酯酶-膽堿氧化酶復(fù)合酶(AChE-ChOx)。

基于乙酰膽堿酯酶(AChE)系統(tǒng)的酶促反應(yīng)為：底物硫代乙酰膽堿(ATCl)在AChE的作用下水解為乙酸和硫代膽堿(RSH)；RSH在膽堿氧化酶(ChOx)的催化作用下，進(jìn)一步與O₂反應(yīng)生成二硫代二膽堿(RSSR)和H₂O₂。

用AChE-ChOx為生物酶，可通過酶促反應(yīng)在電極表面原位產(chǎn)生O₂和H₂O₂，從而引起兩種ECL物質(zhì)的ECL信號的變化，通過檢測ECL信號既可返推出AChE-ChOx的活性。因此，可用該生物傳感器來檢測AChE的抑制劑或激活劑。

以AChE-ChOx作為生物酶的生物傳感器為例，這類具有雙信號源的ECL的生物傳感器的工作原理為(如圖1所示)：

該生物傳感器以CdTe QDs為陰極發(fā)光物質(zhì)，以溶液中溶解的O₂作為CdTe QDs的共反應(yīng)試劑；以PFO顆粒(PFO dots)為陽極發(fā)光物質(zhì)，以酶促反應(yīng)產(chǎn)生的H₂O₂為PFO dots的共反應(yīng)試劑。在底物ATCl存在下，隨著AChE和膽堿氧化酶ChOx引起的酶促反應(yīng)的發(fā)生，溶液中溶解的O₂被消耗，陰極發(fā)光物質(zhì)CdTe QDs的ECL信號被猝滅；同時，通過酶促反應(yīng)原位生成的H₂O₂將使陽極發(fā)光物質(zhì)PFO dots的ECL信號增強(qiáng)。

當(dāng)溶液中存在AChE的抑制劑時，比如有機(jī)磷(OPs)，由于OPs具有抑制AChE的活性的特性，從而阻礙了溶液中溶解的O₂的消耗和H₂O₂的產(chǎn)生，進(jìn)一步導(dǎo)致陰極發(fā)光物質(zhì)的ECL信號增加，而陽極發(fā)光物質(zhì)的ECL信號相應(yīng)地下降。反之，當(dāng)溶液中存在AChE的激活劑時，由于O₂的消耗量增多和H₂O₂的產(chǎn)生量增大，進(jìn)一步導(dǎo)致陰極發(fā)光物質(zhì)的ECL信號降低，而陽極發(fā)光物質(zhì)的ECL信號增大。根據(jù)這兩種ECL信號的比值便可實現(xiàn)對溶液中含有的抑制劑或激活劑的濃度進(jìn)行測定。

本實施方式還提供一種具有雙信號源的電致化學(xué)發(fā)光的生物傳感器的制備方法，如圖1所示，其包括：

步驟a：制備包含兩種電致化學(xué)發(fā)光物質(zhì)的發(fā)光復(fù)合物，所述兩種電致化學(xué)發(fā)光物質(zhì)分別以O(shè)₂和H₂O₂作為共反應(yīng)試劑，且所述兩種電致化學(xué)發(fā)光物質(zhì)所發(fā)出的電致化學(xué)發(fā)光信號互不干擾。

在本發(fā)明較佳的實施例中，步驟a為：先將兩種電致化學(xué)發(fā)光物質(zhì)固載于導(dǎo)電載體，形成發(fā)光復(fù)合物；

在本發(fā)明較佳的實施例中，上述導(dǎo)電載體為石墨稀，進(jìn)一步優(yōu)選的，所述兩種電致化學(xué)發(fā)光物質(zhì)分別為量子點和聚芴衍生物；

在本發(fā)明較佳的實施例中，步驟a中，兩種電致化學(xué)發(fā)光物質(zhì)固載于導(dǎo)電載體的方法包括：(1)制備表面具有氨基的石墨稀-量子點復(fù)合物的步驟；優(yōu)選地，石墨稀-量子點復(fù)合物為石墨稀-碲化鎘量子點復(fù)合物(GO-CdTe QDs)。

在本發(fā)明較佳的實施例中，制備GO-CdTe QDs的步驟包括：將CdCl₂與石墨稀混合攪拌，隨后再與亞碲酸鈉、硼氫化鈉和半胱氨酸混合，并于140-160℃下加熱回流9-11h，得到表面具有氨基的GO-CdTe QDs。

(2)制備羧基功能化的聚芴衍生物顆粒的步驟；優(yōu)選地，聚芴衍生物顆粒為PFO dots；

在本發(fā)明較佳的實施例中，制備羧基功能化的PFO dots的步驟包括：將PFO與聚(苯乙烯-馬來酸酐)(PSMA)溶解于四氫呋喃中，并在超聲波的作用下乳化8-12min，過濾后得到羧基功能化的PFO dots。

(3)以及使石墨稀-量子點復(fù)合物與聚芴衍生物顆粒發(fā)生?；磻?yīng)得到發(fā)光復(fù)合物的步驟。

在本發(fā)明較佳的實施例中，制備發(fā)光復(fù)合物(PFO-GO-CdTe QDs)的方法為：將上述制備的羧基功能化的PFO dots用交聯(lián)劑1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)活化處理0.8-1.2h后，加入表面具有氨基的GO-CdTe QDs，攪拌反應(yīng)后經(jīng)離心、洗滌，即可得到PFO-GO-CdTe QDs。

步驟b：利用電極表面修飾技術(shù)，將發(fā)光復(fù)合物修飾到電極的表面；

在本發(fā)明較佳的實施例中，在步驟b之后還包括步驟c，步驟c為：在表面附著發(fā)光復(fù)合物的電極的表面修飾生物酶。

優(yōu)選地，所述生物酶在酶促反應(yīng)中的反應(yīng)物包括所述O₂，且所述生物酶在酶促反應(yīng)中的生成物包括所述H₂O₂。進(jìn)一步優(yōu)選地，該生物酶為AChE-ChOx。

在本發(fā)明較佳的實施例中，制備AChE-ChOx的方法為：將AChE、ChOx以及戊二醛混合，在4℃冰浴條件下攪拌混合反應(yīng)后，即可得到AChE-ChOx。

這種生物傳感器的制備方法，通過在電極表面修飾發(fā)光復(fù)合物，使得電極上同時具有兩種ECL物質(zhì)，使這種電極能夠同時產(chǎn)生兩種ECL信號，這種制備方法的工藝簡單，反應(yīng)條件溫和，可操作性強(qiáng)。

本實施方式還提供一種具有雙信號源的電致化學(xué)發(fā)光的生物傳感器在檢測生物酶的抑制劑或激活劑中的應(yīng)用。

在本發(fā)明較佳的實施例中，用該生物傳感器進(jìn)行檢測的方法為：將該生物傳感器于待測樣品溶液進(jìn)行孵育，再將孵育后的生物傳感器置于含有生物酶的底物的檢測液中，隨后采用ECL檢測儀采集該生物傳感器的兩種ECL信號，得到檢測數(shù)據(jù)。

在本發(fā)明較佳的實施例中，該生物傳感器在檢測生物酶的抑制劑或激活劑的分析方法包括以下步驟：

(1)將生物傳感器用含有抑制劑或激活劑的不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液孵育后，再將孵育后的生物傳感器置于含有生物酶的底物的檢測液中，并采集生物傳感器的兩種電致化學(xué)發(fā)光信號；

(2)將采集到的兩種電致化學(xué)發(fā)光信號的強(qiáng)度比值的對數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度的對數(shù)進(jìn)行線性擬合，得到工作曲線；

(3)用生物傳感器檢測待測樣品中的抑制劑或激活劑，通過工作曲線計算得到抑制劑或激活劑的濃度。

優(yōu)選地，抑制劑為有機(jī)磷農(nóng)藥。

以下結(jié)合實施例對本發(fā)明的特征和性能作進(jìn)一步的詳細(xì)描述：

實施例1

本實施例提供一種具有雙信號源的電致化學(xué)發(fā)光的生物傳感器，該生物傳感器包括電極和附著于電極的表面的發(fā)光復(fù)合物，發(fā)光復(fù)合物包括兩種電致化學(xué)發(fā)光物質(zhì)，兩種電致化學(xué)發(fā)光物質(zhì)分別以O(shè)₂和H₂O₂作為共反應(yīng)試劑，且兩種電致化學(xué)發(fā)光物質(zhì)所發(fā)出的電致化學(xué)發(fā)光信號互不干擾。

這種生物傳感器的制備方法為：

S1：制備包含兩種電致化學(xué)發(fā)光物質(zhì)的發(fā)光復(fù)合物；

S2：利用電極表面修飾技術(shù)，將發(fā)光復(fù)合物修飾到電極的表面。

實施例2

本實施例提供一種具有雙信號源的電致化學(xué)發(fā)光的生物傳感器，該生物傳感器包括電極和附著于電極的表面的發(fā)光復(fù)合物，發(fā)光復(fù)合物包括兩種電致化學(xué)發(fā)光物質(zhì)和導(dǎo)電載體，兩種電致化學(xué)發(fā)光物質(zhì)固載于導(dǎo)電載體，兩種電致化學(xué)發(fā)光物質(zhì)分別以O(shè)₂和H₂O₂作為共反應(yīng)試劑，且兩種電致化學(xué)發(fā)光物質(zhì)所發(fā)出的電致化學(xué)發(fā)光信號互不干擾。

這種生物傳感器的制備方法為：

S1：將兩種電致化學(xué)發(fā)光物質(zhì)固載于導(dǎo)電載體，制備發(fā)光復(fù)合物S2：利用電極表面修飾技術(shù)，將發(fā)光復(fù)合物修飾到電極的表面。

實施例3

本實施例提供一種具有雙信號源的電致化學(xué)發(fā)光的生物傳感器，該生物傳感器包括電極和附著于電極的表面的發(fā)光復(fù)合物，發(fā)光復(fù)合物包括兩種電致化學(xué)發(fā)光物質(zhì)和石墨稀，兩種電致化學(xué)發(fā)光物質(zhì)固載于導(dǎo)電載體，兩種電致化學(xué)發(fā)光物質(zhì)分別以O(shè)₂和H₂O₂作為共反應(yīng)試劑，且兩種電致化學(xué)發(fā)光物質(zhì)所發(fā)出的電致化學(xué)發(fā)光信號互不干擾。

這種生物傳感器的制備方法為：

S1：將兩種電致化學(xué)發(fā)光物質(zhì)固載于石墨稀上來制備發(fā)光復(fù)合物；

S2：利用電極表面修飾技術(shù)，將發(fā)光復(fù)合物修飾到電極的表面。

實施例4

本實施例提供一種具有雙信號源的電致化學(xué)發(fā)光的生物傳感器，生物傳感器包括電極、附著于電極的表面的發(fā)光復(fù)合物、以及附著于發(fā)光復(fù)合物的表面的生物酶，發(fā)光復(fù)合物包括兩種電致化學(xué)發(fā)光物質(zhì)和石墨稀，兩種電致化學(xué)發(fā)光物質(zhì)固載于石墨稀上，兩種電致化學(xué)發(fā)光物質(zhì)分別以O(shè)₂和H₂O₂作為共反應(yīng)試劑，且兩種電致化學(xué)發(fā)光物質(zhì)所發(fā)出的電致化學(xué)發(fā)光信號互不干擾，生物酶在酶促反應(yīng)中的反應(yīng)物包括O₂，且生物酶在酶促反應(yīng)中的生成物包括H₂O₂。

這種生物傳感器的制備方法為：

S1：制備包含石墨稀和兩種電致化學(xué)發(fā)光物質(zhì)的發(fā)光復(fù)合物；

S2：利用電極表面修飾技術(shù)，將發(fā)光復(fù)合物修飾到電極的表面；

S3:將生物酶孵育到表面附著發(fā)光復(fù)合物的電極上。

實施例5

本實施例提供一種具有雙信號源的電致化學(xué)發(fā)光的生物傳感器，基本與實施例4一致，不同之處在于：

兩種電致化學(xué)發(fā)光物質(zhì)分別為陽極發(fā)光物質(zhì)和陰極發(fā)光物質(zhì)，其中，陽極發(fā)光物質(zhì)以H₂O₂為共反應(yīng)試劑，陰極發(fā)光物質(zhì)以O(shè)₂為共反應(yīng)試劑。陽極發(fā)光物質(zhì)為魯米諾，陰極發(fā)光物質(zhì)為CdTe量子點。

這種生物傳感器的制備方法為：

S1：制備包含石墨稀、魯米諾以及CdTe量子點的發(fā)光復(fù)合物；

S2：利用電極表面修飾技術(shù)，將發(fā)光復(fù)合物修飾到電極的表面；

S3:將生物酶孵育到表面附著發(fā)光復(fù)合物的電極上。

實施例6

本實施例提供一種具有雙信號源的電致化學(xué)發(fā)光的生物傳感器，基本與實施例5一致，不同之處在于：陽極發(fā)光物質(zhì)為聚芴衍生物，陰極發(fā)光物質(zhì)為CdTe量子點。

這種生物傳感器的制備方法為：

S1：制備包含石墨稀、聚芴衍生物以及CdTe量子點的發(fā)光復(fù)合物；

具體包括：

(1)制備表面具有氨基的GO-CdTe QDs的步驟：將CdCl₂與石墨稀混合攪拌，隨后再與亞碲酸鈉、硼氫化鈉和半胱氨酸混合，并于140-160℃下加熱回流9-11h，得到表面具有氨基的GO-CdTe QDs。

(2)制備羧基功能化的PFO dots的步驟：將PFO與聚(苯乙烯-馬來酸酐)(PSMA)溶解于四氫呋喃中，并在超聲波的作用下乳化8-12min，過濾后得到羧基功能化的PFO dots。

(3)制備發(fā)光復(fù)合物(PFO-GO-CdTe QDs)的步驟：將上述制備的羧基功能化的PFO dots用交聯(lián)劑EDC和NHS活化處理1h后，加入表面具有氨基的GO-CdTe QDs，攪拌反應(yīng)后經(jīng)離心、洗滌，即可得到PFO-GO-CdTe QDs。

S2：利用電極表面修飾技術(shù)，將發(fā)光復(fù)合物修飾到電極的表面；

S3:將生物酶孵育到表面附著發(fā)光復(fù)合物的電極上。

實施例7

本實施例提供一種具有雙信號源的電致化學(xué)發(fā)光的生物傳感器，基本與實施例6一致，不同之處在于：生物酶為乙酰膽堿酯酶-膽堿氧化酶復(fù)合酶。

這種生物傳感器的制備方法與實施例6一致，不同之處在于：

S3:將乙酰膽堿酯酶-膽堿氧化酶復(fù)合酶孵育到表面附著發(fā)光復(fù)合物的電極上。其中，制備AChE-ChOx的方法為：將AChE、ChOx以及戊二醛混合，在4℃冰浴條件下攪拌混合反應(yīng)后，即可得到AChE-ChOx。

實施例8

本實施例提供一種具有雙信號源的電致化學(xué)發(fā)光的生物傳感器的應(yīng)用，該生物傳感器的制備方法與實施例7一致。

用該生物傳感器來檢測殘留有機(jī)磷農(nóng)藥的分析方法，包括以下步驟：

將生物傳感器于含有有機(jī)磷的不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液中孵育，再將孵育后的生物傳感器置于含硫代乙酰膽堿的檢測液中，并采集該生物傳感器的兩種ECL信號；

隨后，將采集到兩種ECL信號的強(qiáng)度比值的對數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度的對數(shù)進(jìn)行線性擬合，得到工作曲線；

最后，用生物傳感器檢測待測樣品中的抑制劑或激活劑，通過工作曲線計算得到抑制劑或激活劑的濃度。

實驗例1

用實施例7中的生物傳感器來對卷心菜、小白菜和生菜中的有機(jī)磷農(nóng)藥殘留進(jìn)行檢測：

一、樣品制備：

將卷心菜、小白菜、生菜用超純水洗滌并研碎，取10g的樣品被研磨成蔬菜汁并加入到9mL磷酸緩沖溶液(0.1mol/L，pH 7.4)和1mL的丙酮的混合溶液中。然后，將獲得的懸浮液超聲10分鐘后離心(8000轉(zhuǎn)/分鐘，15分鐘)。離心后得到的上清液直接用于檢測，不用再進(jìn)行額外或進(jìn)一步的處理。

二、檢測方法：

將生物傳感器置于樣品溶液中孵育15min。隨后，將孵育后的生物傳感器在3mL包含有0.090mmol/L的氯代乙酰膽堿的磷酸緩沖液(0.1mol/L，pH 7.4)中進(jìn)行檢測。

檢測設(shè)備為MPI-E型電致化學(xué)發(fā)光分析儀(西安瑞邁分析儀器有限公司，西安，中國)，檢測時光電倍增管高壓(PMT)為800V，掃描電壓為-2～2V。

三、工作曲線的構(gòu)建：

用乙基對氧磷標(biāo)準(zhǔn)品配制以下濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品：(a)0mol/L,(b)5×10^-13mol/L,(c)10^-12mol/L(d)5×10^-12mol/L,(e)1×10^-11mol/L,(f)5×10^-11mol/L,(g)1×10^-10mol/L,(h)5×10^-9mol/L,(i)1×10^-9mol/L和(j)5×10^-8mol/L。將生物傳感器用上述不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行孵育，采集其ECL信號，其中陽極ECL信號出現(xiàn)在掃描電壓為1.96V時，陰極ECL信號出現(xiàn)在掃描電壓為-1.67V時，ECL譜圖如圖2所示。

以陽極ECL信號(I_PFO)與陰極ECL信號(I_CdTe)強(qiáng)度之比(I_PFO/I_CdTe)的對數(shù)為縱坐標(biāo)，以乙基對氧磷的濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性擬合，得到如圖2所示的工作曲線，其線性相關(guān)方程為lg(I_PFO/I_CdTe)＝-6.49115+0.50511lg c，相關(guān)系數(shù)為0.995。

此外，可得出該生物傳感器對有機(jī)磷農(nóng)藥的檢測限為1.25×10^-13mol/L，信噪比S/N＝3。

四、實際樣品檢測：

發(fā)明人用標(biāo)準(zhǔn)添加法將不同濃度的乙基對氧磷添加到空氣飽和的蔬菜樣品溶液中進(jìn)行回收實驗，檢測蔬菜樣品中的有機(jī)磷農(nóng)藥的回收率，回收實驗的結(jié)果如表1所示。

表1乙基對氧磷在不同蔬菜樣品中的回收測試結(jié)果

注：^a表示三次的平均值±SD,n＝3

由表1可知，本發(fā)明提供的這種生物傳感器對卷心菜、小白菜和生菜的回收率變化范圍分別是94.0％～104％、95.7％～102％和98.0％～105％。由此可知，該生物傳感器可以很好的應(yīng)用到分析實際生活樣品。

實驗例2

驗證該生物傳感器的穩(wěn)定性：

將實施例7中的生物傳感器在濃度為5.0×10^-11mol/L的乙基對氧磷溶液中孵育，隨后將孵育后的生物傳感器在空氣飽和的pH 7.4磷酸緩沖溶液中掃描10圈來檢測該生物傳感器的操作穩(wěn)定性。

結(jié)果如圖4所示，生物傳感器的ECL信號在掃描10圈后趨于穩(wěn)定，其中PFO dots和GO-CdTe QDs的ECL信號的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別是2.26％和2.85％，表明該比率型ECL生物傳感器具有很好的操作穩(wěn)定性。

實驗例3

該生物傳感器的性能表征：

一.循環(huán)伏安法(CV)表征

將實施例7中的生物傳感器的逐步組裝過程在含有5mmol/L鐵氰化鉀的0.1mol/L的磷酸緩沖溶液(pH 7.4)中進(jìn)行循環(huán)伏安法(CV)表征。

表征結(jié)果如圖5所示，其中曲線a為裸電極的CV圖；曲線b為PFO-GO-CdTe修飾的電極的CV圖；曲線c為修飾有AChE-ChOx的生物傳感器的CV圖。

由圖5可以看出，與裸電極相比(曲線a)，PFO-GO-CdTe納米復(fù)合物修飾電極的氧化還原峰電流增加(曲線b)，這主要是由于PFO-GO-CdTe納米復(fù)合物加速了電化學(xué)探針鐵氰化鉀和電極之間的電子轉(zhuǎn)移速度。當(dāng)AChE-ChOx修飾到電極上(曲線c)，由于酶的不導(dǎo)電性，氧化還原電流降低。上述結(jié)果證明了該生物傳感器的逐步構(gòu)建過程是成功的。

二、透射電子顯微鏡(TEM)

用透射電子顯微鏡來表征在制備該生物反應(yīng)器中的材料，其結(jié)果呈現(xiàn)在如圖6所示。

圖6A為，從圖中可以看出PFO納米顆粒呈圓球狀，直徑范圍為60～160nm。

圖6B為GO-CdTe QDs的TEM圖，從圖中可以看出GO-CdTe QDs被成功制備并均勻分散在石墨烯表面。

圖6C為GO-CdTe QDs的放大圖，圖中CdTe QDs的平均直徑為3.5nm。而且，幾乎沒有單獨(dú)的石墨烯納米片或單獨(dú)的CdTe QDs出現(xiàn)。

圖6D為PFO-GO-CdTe QDs的TEM圖，圖6D中的插圖為PFO-GO-CdTe QDs的放大圖，從圖中可以看出PFO-GO-CdTe QDs已成功制備。

綜上所述，本發(fā)明提供的這種生物傳感器，在一個循環(huán)電位掃描下，會發(fā)出兩種電致化學(xué)發(fā)光信號，并利用O₂和H₂O₂分別作為這兩種電致化學(xué)發(fā)光物質(zhì)的共反應(yīng)試劑以實現(xiàn)這兩種電致化學(xué)發(fā)光信號呈相反變化的趨勢。這兩種電致化學(xué)發(fā)光物質(zhì)的發(fā)光電位沒有重疊，同時，采用的兩種電致化學(xué)發(fā)光物質(zhì)之間沒有能量轉(zhuǎn)移，使得這種生物傳感器的靈敏度和精確度顯著提高，能避免能量轉(zhuǎn)移的復(fù)雜性，而且也能夠有效避免由儀器、環(huán)境因素、以及一些人為操作因素導(dǎo)致的假陽性或假陰性信號對檢測的干擾，使檢測結(jié)果的可靠性高，其制備方法簡單易行，可用于檢測多種生物酶的抑制劑或激活劑。

盡管已用具體實施例來說明和描述了本發(fā)明，然而應(yīng)意識到，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下可以作出許多其它的更改和修改。因此，這意味著在所附權(quán)利要求中包括屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的所有這些變化和修改。