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      一種檢測(cè)煙氣總粒相物對(duì)細(xì)胞炎癥效應(yīng)因子影響方法與流程

      文檔序號(hào):11110207閱讀:716來源:國(guó)知局
      一種檢測(cè)煙氣總粒相物對(duì)細(xì)胞炎癥效應(yīng)因子影響方法與制造工藝

      本發(fā)明屬于煙草制品生物學(xué)效應(yīng)評(píng)價(jià)技術(shù)領(lǐng)域,特別涉及一種檢測(cè)煙氣總粒相物對(duì)細(xì)胞炎癥效應(yīng)因子影響方法。



      背景技術(shù):

      隨著人們對(duì)健康的關(guān)注越來越高,對(duì)煙草產(chǎn)品提出了更高的要求,不但要有較好的口感,而且要盡可能的減少人體的不良感受。卷煙產(chǎn)品研發(fā)人員在煙油產(chǎn)品配方設(shè)計(jì)初期將不同組份按照不同比例組合調(diào)配,形成具有不同風(fēng)格的初選配方,再結(jié)合化學(xué)評(píng)價(jià)和感官評(píng)價(jià)對(duì)配方進(jìn)行不斷篩選調(diào)整形成最終的產(chǎn)品配方。然而初選配方數(shù)量眾多,全部進(jìn)行感官評(píng)價(jià)耗時(shí)耗力,且感官評(píng)價(jià)側(cè)重于對(duì)產(chǎn)品的風(fēng)格口感進(jìn)行篩選,如何利用生物學(xué)測(cè)試指標(biāo)對(duì)產(chǎn)品初選配方進(jìn)篩選,以獲得降低人體不良感受的產(chǎn)品配方,目前尚屬探索階段,無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)方法。



      技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:

      本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)煙氣總粒相物對(duì)細(xì)胞炎癥效應(yīng)因子影響方法,為電子煙制品的安全性評(píng)估提供參考。

      一種檢測(cè)煙氣總粒相物對(duì)細(xì)胞炎癥效應(yīng)因子影響方法,包括以下步驟:

      (1)受試物的前處理;

      (2)人肺成纖維細(xì)胞單細(xì)胞懸浮液的制備;

      (3)人肺成纖維細(xì)胞單細(xì)胞懸浮液的細(xì)胞濃度的計(jì)算;

      (4)人肺成纖維細(xì)胞單細(xì)胞懸浮液的細(xì)胞接種;

      (5)受試物的分組;

      (6)受試物檢測(cè)劑量的設(shè)定;

      (7)受試物培養(yǎng)品的制備;

      (8)受試物的孵育;

      (9)受試物孵育品的收集;

      (10)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制;

      (11)添加待測(cè)樣;

      (12)添加抗體;

      (13)添加結(jié)合液;

      (14)顯色;

      (15)測(cè)量吸光值;

      (16)細(xì)胞因子分泌量測(cè)定。

      本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中,上述的方法,包括以下具體步驟:

      (1)受試物的前處理:參照中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 19609-2004《卷煙用常規(guī)分析用吸煙機(jī)測(cè)定總粒相物和焦油》制備卷煙煙氣總粒相物樣品,樣品濃度為10mg/mL;

      (2)人肺成纖維細(xì)胞HPF單細(xì)胞懸浮液的制備:人肺成纖維細(xì)胞復(fù)蘇后,接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,置于37℃、5vt%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),倒置顯微鏡觀察培養(yǎng)細(xì)胞的匯合和形態(tài)情況,待細(xì)胞長(zhǎng)至90%的匯合率時(shí),移除培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基,用磷酸緩沖液洗兩次,加入適量0.25%的胰蛋白酶溶液,其中胰蛋白酶/磷酸鹽緩沖液的濃度單位為質(zhì)量:體積;單層孵育約1-2min,用成纖維成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基懸起,形成單細(xì)胞懸浮液;

      (3)人肺成纖維細(xì)胞HPF單細(xì)胞懸浮液的細(xì)胞濃度的計(jì)算:用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法對(duì)步驟(2)得到人肺成纖維細(xì)胞單細(xì)胞懸浮液的細(xì)胞濃度進(jìn)行計(jì)算,計(jì)算出每毫升人肺成纖維細(xì)胞單細(xì)胞懸浮液的活細(xì)胞數(shù);

      (4)人肺成纖維細(xì)胞HPF單細(xì)胞懸浮液的細(xì)胞接種:將步驟(3)計(jì)數(shù)后的人肺成纖維細(xì)胞單細(xì)胞懸浮液加入成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋至2.0×105個(gè)/mL,再按接種量為1mL/孔,接種到12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,將12孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于37℃、5vt%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h;

      (5)受試物的分組:將受試物分為兩組:細(xì)胞對(duì)照組和檢測(cè)樣品組;各組的構(gòu)成為:細(xì)胞對(duì)照組為成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基上種植人肺成纖維細(xì)胞;檢測(cè)樣品組為在成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基上種植人肺成纖維細(xì)胞并添加受試物;

      (6)受試物檢測(cè)劑量的設(shè)定:將受試物,即電子煙原液分為5非個(gè)非零劑量:20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、100μg/mL;

      (7)受試物培養(yǎng)品的制備:移除步驟(4)中12孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)的成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基,再按步驟(5)進(jìn)行分組,各組的構(gòu)成為:細(xì)胞對(duì)照組為成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基+人肺成纖維細(xì)胞;檢測(cè)樣品組為成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基+人肺成纖維細(xì)胞+受試物,并使檢測(cè)樣品組的最終濃度分別為步驟(6)設(shè)定的劑量;并且2組培養(yǎng)品用成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基將每孔中的液體體積補(bǔ)足到1mL/孔;

      (8)受試物的孵育:將步驟(7)加樣后的12孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于37℃、5vt%CO2培養(yǎng)箱中孵育24h;

      (9)受試物孵育品的收集:吸取步驟(8)細(xì)胞板中的上清液,離心20min,轉(zhuǎn)速1000rpm,取上清;

      (10)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制:梯度稀釋法配制炎癥效應(yīng)因子的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液,

      (11)添加待測(cè)樣:空白對(duì)照孔加蒸餾水100μL,其余孔分別加步驟(10)配制的標(biāo)準(zhǔn)品溶液或步驟(9)獲得的待測(cè)樣品100μL,蓋酶標(biāo)板覆膜,37℃孵育90分鐘;

      (12)添加抗體:將步驟(11)中的固液進(jìn)行分離,取分離的液體,甩干,每孔加入抗體工作液100μL,蓋酶標(biāo)板覆膜,37℃孵育60分鐘;

      (13)添加結(jié)合液:將步驟(12)中的固液進(jìn)行分離,取分離的液體,甩干,用磷酸鹽緩沖液PBS洗板三次,每次浸泡大約2分鐘,350μL/每孔,甩干并在吸水紙上輕拍將孔內(nèi)液體拍干,每孔加酶結(jié)合工作液100μL,蓋酶標(biāo)板覆膜,37℃孵育30分鐘;

      (14)顯色:將步驟(13)中的固液進(jìn)行分離,取分離的液體,甩干,用清洗液洗板五次,每次浸泡大約2分鐘,350μL/每孔,甩干并在吸水紙上輕拍將孔內(nèi)液體拍干,每孔加底物工作液90μL,蓋酶標(biāo)板覆膜,37℃孵育,觀察每孔顏色變化,適時(shí)加入終止液50μL/孔;

      (15)測(cè)量吸光值:于酶標(biāo)儀450nm下檢測(cè)吸光度;

      (16)細(xì)胞因子分泌量測(cè)定:根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算細(xì)胞因子分泌量。

      本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中,步驟(10)中的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的配制過程為:將抗體用抗體工作液配制成相應(yīng)濃度,其中IL-6標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍為0-500pg/mL,IL-8標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍為0-2000pg/mL,IL-10標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍為0-500pg/mL,TGF-β1標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍為0-2000pg/mL,TNF-α標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍為0-500pg/mL,GM-CSF標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍為0-500pg/mL,抗體購(gòu)買于伊萊瑞特公司。

      本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中,步驟(12)中的抗體工作液屬于商品化商品,能夠在市場(chǎng)上購(gòu)買于伊萊瑞特公司。

      本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中,步驟(13)中的酶結(jié)合工作液屬于商品化商品,能夠在市場(chǎng)上購(gòu)買于伊萊瑞特公司。

      本發(fā)明有益效果:

      本發(fā)明對(duì)樣品的有效處理、檢測(cè)劑量的優(yōu)化設(shè)定以及靶細(xì)胞的正確選擇,使得本方法能夠準(zhǔn)確有效的檢測(cè)卷煙煙氣總粒相物對(duì)細(xì)胞炎癥效應(yīng)因子分泌影響。

      附圖說明

      圖1為4種卷煙煙氣總粒相物對(duì)HPF細(xì)胞IL-6細(xì)胞因子分泌的影響;

      圖2為4種卷煙煙氣總粒相物對(duì)HPF細(xì)胞IL-10細(xì)胞因子分泌的影響。

      具體實(shí)施方式

      下面將結(jié)合具體實(shí)例對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)描述,但并不限制本發(fā)明。

      本發(fā)明針對(duì)4種國(guó)內(nèi)市售卷煙的煙氣總粒相物對(duì)人肺成纖維細(xì)胞IL-6、IL-10兩種炎癥效應(yīng)因子分泌量的影響測(cè)試。

      (1)受試物的前處理:參照中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 19609-2004《卷煙用常規(guī)分析用吸煙機(jī)測(cè)定總粒相物和焦油》制備卷煙煙氣總粒相物樣品,樣品濃度為10mg/mL;

      (2)人肺成纖維細(xì)胞HPF單細(xì)胞懸浮液的制備:人肺成纖維細(xì)胞復(fù)蘇后,接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,置于37℃、5vt%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),倒置顯微鏡觀察培養(yǎng)細(xì)胞的匯合和形態(tài)情況,待細(xì)胞長(zhǎng)至90%的匯合率時(shí),移除培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基,用磷酸緩沖液洗兩次,加入適量0.25%的胰蛋白酶溶液,其中胰蛋白酶/磷酸鹽緩沖液的濃度單位為質(zhì)量:體積;單層孵育約2min,用成纖維成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基懸起,形成單細(xì)胞懸浮液;

      (3)人肺成纖維細(xì)胞HPF單細(xì)胞懸浮液的細(xì)胞濃度的計(jì)算:用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法對(duì)步驟(2)得到人肺成纖維細(xì)胞單細(xì)胞懸浮液的細(xì)胞濃度進(jìn)行計(jì)算,計(jì)算出每毫升人肺成纖維細(xì)胞單細(xì)胞懸浮液的活細(xì)胞數(shù);

      (4)人肺成纖維細(xì)胞HPF單細(xì)胞懸浮液的細(xì)胞接種:將步驟(3)計(jì)數(shù)后的人肺成纖維細(xì)胞單細(xì)胞懸浮液加入成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋至2.0×105個(gè)/mL,再按接種量為1mL/孔,接種到12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,將12孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于37℃、5vt%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h;

      (5)受試物的分組:將受試物分為兩組:細(xì)胞對(duì)照組和檢測(cè)樣品組;各組的構(gòu)成為:細(xì)胞對(duì)照組為成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基上種植人肺成纖維細(xì)胞;檢測(cè)樣品組為在成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基上種植人肺成纖維細(xì)胞并添加受試物;

      (6)受試物檢測(cè)劑量的設(shè)定:將受試物,即電子煙原液分為5非個(gè)非零劑量:20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、100μg/mL;

      (7)受試物培養(yǎng)品的制備:移除步驟(4)中12孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)的成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基,再按步驟(5)進(jìn)行分組,各組的構(gòu)成為:細(xì)胞對(duì)照組為成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基+人肺成纖維細(xì)胞;檢測(cè)樣品組為成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基+人肺成纖維細(xì)胞+受試物,并使檢測(cè)樣品組的最終濃度分別為步驟(6)設(shè)定的劑量;并且2組培養(yǎng)品用成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基將每孔中的液體體積補(bǔ)足到1mL/孔;

      (8)受試物的孵育:將步驟(7)加樣后的12孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于37℃、5vt%CO2培養(yǎng)箱中孵育24h;

      (9)受試物孵育品的收集:吸取步驟(8)細(xì)胞板中的上清液,離心20min,轉(zhuǎn)速1000rpm,取上清;

      (10)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制:梯度稀釋法配制炎癥效應(yīng)因子的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液,

      (11)添加待測(cè)樣:空白對(duì)照孔加蒸餾水100μL,其余孔分別加步驟(10)配制的標(biāo)準(zhǔn)品溶液或步驟(9)獲得的待測(cè)樣品100μL,蓋酶標(biāo)板覆膜,37℃孵育90分鐘;

      (12)添加抗體:將步驟(11)中的固液進(jìn)行分離,取分離的液體,甩干,每孔加入抗體工作液100μL,蓋酶標(biāo)板覆膜,37℃孵育60分鐘;

      (13)添加結(jié)合液:將步驟(11)中的固液進(jìn)行分離,取分離的液體,甩干,用磷酸鹽緩沖液PBS洗板三次,每次浸泡大約2分鐘,350μL/每孔,甩干并在吸水紙上輕拍將孔內(nèi)液體拍干,每孔加酶結(jié)合工作液100μL,蓋酶標(biāo)板覆膜,37℃孵育30分鐘;

      (14)顯色:將步驟(11)中的固液進(jìn)行分離,取分離的液體,甩干,用清洗液洗板五次,每次浸泡大約2分鐘,350μL/每孔,甩干并在吸水紙上輕拍將孔內(nèi)液體拍干,每孔加底物工作液90μL,蓋酶標(biāo)板覆膜,37℃孵育,觀察每孔顏色變化,適時(shí)加入終止液50μL/孔;

      (15)測(cè)量吸光值:于酶標(biāo)儀450nm下檢測(cè)吸光度;

      (16)細(xì)胞因子分泌量測(cè)定:根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算細(xì)胞因子分泌量。

      結(jié)果見圖1和圖2。由試驗(yàn)結(jié)果可以看出,在本發(fā)明方法給出的樣品處理方法、檢測(cè)劑量條件下,樣品1#、2#、3#、4#在檢測(cè)劑量范圍內(nèi)對(duì)HPF細(xì)胞IL-6炎癥效應(yīng)因子的分泌量存在影響,且有劑量效應(yīng)關(guān)系,與0劑量組相比存在顯著差異(p<0.05);樣品4#與樣品1#、2#、3#間存在顯著差異。而對(duì)HPF細(xì)胞IL-10炎癥效應(yīng)因子的分泌量無影響,且與0劑量組相比無顯著差異(p>0.05);以上結(jié)果不同的卷煙煙氣總粒相物對(duì)HPF細(xì)胞不同的炎癥效應(yīng)因子的分泌量的影響存在差異。

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