本發(fā)明涉及葡萄品種和年份的檢測方法，具體是一種利用核磁共振鑒定葡萄酒的葡萄品種和年份的方法。

背景技術(shù)：

葡萄酒是破碎或未破碎的新鮮葡萄果實(shí)或葡萄汁經(jīng)完全或者部分酒精發(fā)酵后，獲得酒精度數(shù)不低于8.5%的飲料。葡萄酒己普遍認(rèn)為具有一定的抗氧化作用，作為一種健康時(shí)尚飲品，葡萄酒具有鎮(zhèn)靜、助消化、利尿、抑菌和抗血小板凝聚、抗氧化性、抗腫瘤、舒化血管等功能，在全世界有著非常大的消費(fèi)量。目前我國葡萄酒的生產(chǎn)量和消費(fèi)量均逐年遞增，葡萄酒越來越受到人們的喜愛。

葡萄酒的品種很多，因葡萄的栽培、葡萄酒生產(chǎn)工藝條件的不同，產(chǎn)品風(fēng)格各不相同。葡萄品種是決定葡萄酒味道的主要因素，知道這瓶酒所使用的葡萄品種就可以大致判斷出這瓶酒的味道，包括香氣、口感、大致的酒體和結(jié)構(gòu)。

另外，好的葡萄酒是喝年份的，葡萄酒的年份對于葡萄酒的品質(zhì)起到非常重要的決定作用，是葡萄酒品質(zhì)的一個(gè)關(guān)鍵因素，俗話說“七分葡萄，三分釀造”。對于不同的葡萄酒產(chǎn)區(qū)，每一個(gè)年份的年情都是不一樣的，所以具體哪個(gè)年份好，哪個(gè)年份比較差要看是對于哪個(gè)產(chǎn)區(qū)來說。

核磁共振（Nuclear magneticresonance, NMR）是一種基于具有自旋性質(zhì)的原子核在核外磁場作用下，吸收射頻輻射而產(chǎn)生能級躍遷的譜學(xué)技術(shù)，具有高重現(xiàn)性、無損傷性和無偏向性的優(yōu)點(diǎn)，常用1H-NMR圖譜和l3C-NMR圖譜對化合物進(jìn)行檢測分析。目前NMR圖譜與模式識別相結(jié)合已經(jīng)廣泛應(yīng)用于葡萄酒及一些液態(tài)食品的成分分析與比較、真?zhèn)闻卸ǖ确治鲋?。而且，核磁共振法是對葡萄酒的葡萄品種及年份進(jìn)行鑒別的一個(gè)很好的方法。Jang-Eun Lee等通過1H NMR對韓國當(dāng)?shù)?006年與2007年的meoru葡萄酒進(jìn)行了年份上的比較，通過主成分分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相比2007年的葡萄酒，2006年的葡萄酒中具有更高水平的脯氨酸、乳酸及酚類物質(zhì)。而這些物質(zhì)的產(chǎn)生，與該年份下當(dāng)?shù)氐慕涤炅亢腿諘駮r(shí)間對葡萄生長都有著密切關(guān)系。結(jié)合氣象學(xué)，這為葡萄酒的年份鑒別提供了思路。Hong-Seok Son等人通過核磁共振技術(shù)對韓國4個(gè)品種的葡萄及其釀造的葡萄酒進(jìn)行了主成分分析。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，葡萄酒中的許多代謝產(chǎn)物取決于葡萄品種。因此1H NMR能通過葡萄品種對葡萄酒進(jìn)行一定的特征分析，這為區(qū)別不同葡萄品種的葡萄酒提供了一定的理論基礎(chǔ)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在提供一種有別于現(xiàn)有技術(shù)的鑒定葡萄酒的葡萄品種和年份的方法，以提升鑒定的精確度，使核磁共振檢測方法得到更好的推廣、應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的具體方案如下：

一種鑒定葡萄酒的葡萄品種和年份的方法，包括以下步驟：

（1）選取鑒定對象：葡萄酒；

（2）制備樣品：每個(gè)樣品平行備樣至少3份樣品；

（3）處理樣品：分別取同等份量的步驟（2）平行備樣的樣品置于離心管中，室溫下離心處理，分別取同等份量的上清液冷凍后，進(jìn)行干燥處理，制得粉末；加入氘代試劑混合均勻，分別將溶解液轉(zhuǎn)移至離心管中，13000 r/min離心20 min，分別取同等份量的上清液作為待測樣品裝入核磁管中；

（4）測量數(shù)據(jù)：將步驟（3）中制得的待測樣品用核磁共振儀進(jìn)行NMR實(shí)驗(yàn)，并開啟數(shù)據(jù)分析軟件；

（5）數(shù)據(jù)分析：對步驟（4）測得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾處理，以找出并消除在建模時(shí)不太可能使用到的變量；對過濾后的特征量進(jìn)行歸一化處理，以增強(qiáng)數(shù)據(jù)的可比性；利用主成分分析和偏最小二乘法進(jìn)行模式識別分析，以確定樣品間主要代謝產(chǎn)物相對含量的差異；

（6）確定葡萄品種和年份：根據(jù)步驟（5）測得的數(shù)據(jù)確定各樣品的葡萄品種和年份。

進(jìn)一步的，所述鑒定對象包括同一產(chǎn)地的兩類葡萄酒，其中一類鑒定對象為同一年份、不同品種的葡萄酒；另一類鑒定對象相同品種、不同年份的葡萄酒。

進(jìn)一步的，所述氘代試劑是四氯甲烷或重水D₂0。

進(jìn)一步的，所述用于測量數(shù)據(jù)步驟的核磁共振儀為Bruker公司的AVANVEⅡ600核磁共振儀。

進(jìn)一步的，所述用于測量數(shù)據(jù)步驟的核磁共振條件為：室溫24 ℃，譜寬15000 Hz，進(jìn)樣次數(shù)為32，駐留時(shí)間參數(shù)33.33 μs，弛豫延遲時(shí)間2.00 s，原子核Larmor頻率600.13 MHz。

進(jìn)一步的所述用于測量數(shù)據(jù)步驟的數(shù)據(jù)分析軟件為MetaboAnalysis 2.0。

本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明使用核磁共振辨別葡萄酒的葡萄品種及葡萄采摘年份，即使樣本數(shù)量較少，也能通過特征量的篩選，建立對應(yīng)數(shù)據(jù)庫，從試驗(yàn)結(jié)果辨別葡萄品種和年份。

本發(fā)明的測試方法簡單，實(shí)驗(yàn)裝置常見，更能實(shí)現(xiàn)大眾化普及，不受檢測者個(gè)人條件的限制；而且，本發(fā)明檢測數(shù)據(jù)與客觀事實(shí)之間的吻合度高，重現(xiàn)性好。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實(shí)施例1的數(shù)據(jù)歸一化處理前后對比圖，表示本實(shí)施例1通過NMR提取到的特征標(biāo)記物；

圖2是本發(fā)明實(shí)施例1主成分分析的3D主成分分析空間圖，表示本實(shí)施例1所選取樣本在三維空間中的分布情況；

圖3是本發(fā)明實(shí)施例1主成分分析的貢獻(xiàn)率累計(jì)趨勢圖，對特征成分進(jìn)行組分分析，前5個(gè)組分的表達(dá)率合計(jì)已達(dá)94.8%，故對已能表達(dá)本次實(shí)驗(yàn)中的樣本特性；

圖4是本發(fā)明實(shí)施例1主成分分析的各組分間對比圖，對本實(shí)施例1選取的組分進(jìn)行逐一的二維空間分析，發(fā)現(xiàn)在組分1與組分2（PC1vsPC2）及組分1與組分3（PC1vsPC3）中，a、b兩類樣本能類聚，并相互區(qū)別；

圖5是本發(fā)明實(shí)施例1主成分分析的主成分1與主成分2間得分對比圖，表示通過組分1與組分2的對比分析，a、b樣本已能得到較好的區(qū)分；

圖6是本發(fā)明實(shí)施例1主成分分析的主成分1與主成分2間主成分雙標(biāo)圖，表示在通過組分1與組分2區(qū)分a、b樣本是，組分1與組分2中特征物的差異情況，遠(yuǎn)離聚合中心點(diǎn)（原點(diǎn)）的特征物在區(qū)別a、b樣本時(shí)起到較大的作用；

圖7是本發(fā)明實(shí)施例1主成分分析的主成分1與主成分2中特征量空間分布圖，表示特征物在組分1與組分2中的空間分布情況；

圖8是本發(fā)明實(shí)施例1偏最小二乘法辨析的主成分1、主成分2與主成分3間三維得分對比圖，經(jīng)過之前的主成分分析后，對所選組分進(jìn)行偏最小二乘法辨析，并建立回歸模型。選取權(quán)重最大的3個(gè)主成分，即成分1、主成分2與主成分3建立三維空間圖。在圖中我們能觀察到a、b樣本各自聚合，并相互區(qū)分；

圖9是本發(fā)明實(shí)施例1偏最小二乘法辨析的主成分1與主成分2間得分對比圖，以主成分1與主成分2建立二維空間圖，圖中a、b類樣本已能得到完全區(qū)別；

圖10是本發(fā)明實(shí)施例1偏最小二乘法辨析的主成分1與主成分2中特征量空間分布圖，表示主成分1與主成分2中特征量空間分布；

圖11是本發(fā)明實(shí)施例1偏最小二乘法辨析的各組分間對比圖，對選取的5個(gè)主成分行進(jìn)逐一類比，其中主成分1與其余4個(gè)主成分類比中，a、b樣本均體現(xiàn)相互完全分離，并各自類聚；

圖12是本發(fā)明實(shí)施例1偏最小二乘法辨析的重要特征量圖，選取了本實(shí)驗(yàn)中貢獻(xiàn)最大的15個(gè)特征量；

圖13是本發(fā)明實(shí)施例2的數(shù)據(jù)歸一化處理前后對比圖；

圖14是本發(fā)明實(shí)施例2主成分分析的主成分分析圖；

圖15是本發(fā)明實(shí)施例2主成分分析的貢獻(xiàn)率累計(jì)趨勢圖；

圖16是本發(fā)明實(shí)施例2主成分分析的各組分間對比圖1；

圖17是本發(fā)明實(shí)施例2主成分分析的各組分間對比圖2；

在組分1與組分2對比中，

圖18是本發(fā)明實(shí)施例2主成分分析的主成分1與主成分2中特征量空間分布圖；

圖19是本發(fā)明實(shí)施例2主成分分析的主成分1與主成分2間主成分雙標(biāo)圖；

圖20是本發(fā)明實(shí)施例2偏最小二乘法辨析的主成分1、主成分2與主成分3間三維得分對比圖；

圖21是本發(fā)明實(shí)施例2偏最小二乘法辨析的主成分1與主成分2間得分對比圖；

圖22是本發(fā)明實(shí)施例2偏最小二乘法辨析的主成分1與主成分2中特征量空間分布圖；

圖23是本發(fā)明實(shí)施例2偏最小二乘法辨析的各組分間對比圖；

圖24是本發(fā)明實(shí)施例2偏最小二乘法辨析的重要特征量圖。

具體實(shí)施方式

下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例，在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標(biāo)號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附圖描述的實(shí)施例是示例性的，所述實(shí)施例的示例旨在用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實(shí)施例1：

本實(shí)施例1提供一種鑒定葡萄酒的葡萄品種的方法，包括以下步驟：

（1）選取鑒定對象：年份為2012年，波爾多法定產(chǎn)區(qū)的赤霞珠葡萄酒、梅洛葡萄酒；

（2）制備樣品：選取3個(gè)赤霞珠葡萄酒樣本作為A組樣品，選取6個(gè)梅洛葡萄酒樣本作為B組樣品；

（3）處理樣品：

分別取10 ml步驟（2）平行備樣的樣品置于離心管中，室溫下離心處理，取上清液冷凍后，進(jìn)行干燥處理，制得粉末；

加入重水D₂0混合均勻，將溶解液轉(zhuǎn)移至1.5 ml的離心管中，13000 r/min離心20 min，分別取上清液500 pl作為待測樣品裝入5 mm核磁管中；

（4）測量數(shù)據(jù)：將步驟（3）中制得的待測樣品用核磁共振儀進(jìn)行NMR實(shí)驗(yàn)，并開啟數(shù)據(jù)分析軟件；

核磁共振儀為Bruker公司的AVANVEⅡ600核磁共振儀，核磁共振條件為：室溫24 ℃，譜寬15000 Hz，進(jìn)樣次數(shù)為32，駐留時(shí)間參數(shù)33.33 μs，弛豫延遲時(shí)間2.00 s，原子核Larmor頻率600.13 MHz；

數(shù)據(jù)分析軟件為MetaboAnalysis 2.0；

（5）數(shù)據(jù)分析，并鑒定葡萄品種：

對步驟（4）測得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾處理，以找出并消除在建模時(shí)不太可能使用到的變量，得到126個(gè)特征量；

對過濾后的126個(gè)特征量進(jìn)行歸一化處理，以增強(qiáng)數(shù)據(jù)的可比性；參照圖1，為前50個(gè)特征量歸一化前后對比圖，表明在本實(shí)施例1中通過NMR提取到的特征標(biāo)記物。

參照圖2，對樣品進(jìn)行主成分分析，共得到5個(gè)主成分，表示所選取樣本在三維空間中的分布情況。

參照圖3，對特征成分進(jìn)行組分分析，主成分1、主成分2、主成分3、主成分4、主成分5的貢獻(xiàn)率分別為35.5%、26.2%、16.9%、10.9%和5.3%，累計(jì)貢獻(xiàn)率為94.8%，已經(jīng)能較好的代表整個(gè)樣本信息。

參照圖4，可以看到各組分間的對比，對選取的組分進(jìn)行逐一的二維空間分析，發(fā)現(xiàn)在組分1與組分2（PC1 vs PC2）及組分1與組分3（PC1 vs PC3）中，A、B兩類樣本能類聚，并相互區(qū)別。

參照圖5，表示通過組分1與組分2的對比分析，可以看到A和B這兩組樣品在主成分1和主成分2上已經(jīng)得到了較好的區(qū)分。

參照圖6、圖7，表示特征物在組分1與組分2中的空間分布情況，表示通過組分1與組分2區(qū)分A、B樣本，組分1與組分2中特征物的差異情況，遠(yuǎn)離聚合中心點(diǎn)（原點(diǎn)）的特征物在區(qū)別A、B樣本時(shí)起到較大的作用。從主成分1和主成分2間的載荷圖可以顯示使這A、B兩組樣本得以區(qū)分的特征量。特征量間的距離表示其相互間的相關(guān)程度，距離越近，相關(guān)性越好。而特征量離原點(diǎn)的距離代表其在主成分1和主成分2對比中的特異貢獻(xiàn)量，距離原點(diǎn)越遠(yuǎn)，其對區(qū)別這兩個(gè)主成分的貢獻(xiàn)也越大。

參照圖8，經(jīng)過之前的主成分分析后，對所選組分進(jìn)行偏最小二乘法辨析，并建立回歸模型。選取權(quán)重最大的3個(gè)主成分，即主成分1、主成分2與主成分3建立三維空間圖。在圖中我們能觀察到A、B樣本各自聚合，并相互區(qū)分。

參照圖9，對樣品進(jìn)行偏最小二乘法辨析，可以發(fā)現(xiàn)，A、B兩組樣本已經(jīng)能完全區(qū)分開。

參照圖10，表示主成分1與主成分2中特征量空間分布，可以看到成分1和成分2上起到區(qū)別功能的特征量。

參照圖11，可以看到其他成分的對比，對選取的5個(gè)主成分行進(jìn)逐一類比，其中主成分1與其余4個(gè)主成分類比中，a、b樣本均體現(xiàn)相互完全分離，并各自類聚。

參照圖12，選取了本實(shí)驗(yàn)中貢獻(xiàn)最大的15個(gè)特征量，可以發(fā)現(xiàn)起到區(qū)別這兩組樣本的重要特征量（前15個(gè)）分別是V300、V221、V222、V220、V223、V218、V295、V219、V303、V296、V302、V297、V301、V298、V299。

因此，結(jié)合主成分分析和偏最小二乘法進(jìn)行模式識別分析，確定樣品間主要代謝產(chǎn)物相對含量的差異后，就可以對A組樣品和B組合樣品進(jìn)行區(qū)分，其中，A組是赤霞珠葡萄酒，B組是梅洛葡萄酒，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)鑒定葡萄酒的葡萄品種的效果。

實(shí)施例2：

本實(shí)施例2提供一種鑒定葡萄酒的葡萄年份的方法，包括以下步驟：

（1）選取鑒定對象：波爾多法定產(chǎn)區(qū)的梅洛葡萄酒，年份分別為2011年、2012年；

（2）制備樣品：選取8個(gè)2011年的梅洛葡萄酒樣本作為A組樣品，選取7個(gè)2012年的梅洛葡萄酒樣本作為B組樣品；

（3）處理樣品：

分別取10 ml步驟（2）平行備樣的樣品置于離心管中，室溫下離心處理，取上清液冷凍后，進(jìn)行干燥處理，制得粉末；

加入四氯甲烷混合均勻，將溶解液轉(zhuǎn)移至1.5 ml的離心管中，13000 r/min離心20 min，分別取上清液500 pl作為待測樣品裝入5 mm核磁管中；

（4）測量數(shù)據(jù)：將步驟（3）中制得的待測樣品用核磁共振儀進(jìn)行NMR實(shí)驗(yàn)，并開啟數(shù)據(jù)分析軟件；

核磁共振儀為Bruker公司的AVANVEⅡ600核磁共振儀，核磁共振條件為：室溫24 ℃，譜寬15000 Hz，進(jìn)樣次數(shù)為32，駐留時(shí)間參數(shù)33.33 μs，弛豫延遲時(shí)間2.00 s，原子核Larmor頻率600.13 MHz；

數(shù)據(jù)分析軟件為MetaboAnalysis 2.0；

（5）數(shù)據(jù)分析，并鑒定葡萄品種：

對步驟（4）測得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾處理，以找出并消除在建模時(shí)不太可能使用到的變量，得到126個(gè)特征量；

對過濾后的126個(gè)特征量進(jìn)行歸一化處理，以增強(qiáng)數(shù)據(jù)的可比性；參照圖13，為前50個(gè)特征量歸一化前后對比圖。

參照圖14，對樣品進(jìn)行主成分分析，共得到5個(gè)主成分。

參照圖15，主成分1、主成分2、主成分3、主成分4、主成分5的貢獻(xiàn)率分別為73.5%、7.8%、5.3%、3.6%和2.3%，累計(jì)貢獻(xiàn)率為92.4%，已經(jīng)能較好的代表整個(gè)樣本信息。

參照圖16，可以看到各組分間的對比。

參照圖17，可以看到A和B這兩組樣品在主成分1和主成分2上尚未能得到區(qū)分。

參照圖18、圖19，從主成分1和主成分2間的載荷圖顯示A、B兩組樣本的特征量。

參照圖20、圖21，對樣品進(jìn)行偏最小二乘法辨析，可以發(fā)現(xiàn)，雖然A、B兩組樣本還不能完全區(qū)分開，但是已經(jīng)有區(qū)別聚類的趨勢。

參照圖22，可以看到成分1和成分2上起到區(qū)別功能的特征量；參照圖23，可以看到其他成分的對比；參照圖24，可以發(fā)現(xiàn)起到區(qū)別這兩組樣本的重要特征量（前15個(gè)）分別是V300、V221、V222、V220、V223、V218、V295、V219、V303、V296、V302、V297、V301、V298、V299。

因此，結(jié)合主成分分析和偏最小二乘法進(jìn)行模式識別分析，確定樣品間主要代謝產(chǎn)物相對含量的差異后，就可以對A組樣品和B組合樣品進(jìn)行區(qū)分，其中，A組是2011年的梅洛葡萄酒，B組是2012年的梅洛葡萄酒，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)鑒定葡萄酒的葡萄年份的效果。

盡管結(jié)合優(yōu)選實(shí)施方案具體展示和介紹了本發(fā)明，但所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該明白，在不脫離所附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，在形式上和細(xì)節(jié)上可以對本發(fā)明做出各種變化，均為本發(fā)明的保護(hù)范圍。