本實(shí)用新型涉及拉曼信號(hào)樣品檢測技術(shù)，具體涉及一種液體中激光誘導(dǎo)增強(qiáng)拉曼光譜的檢測與分選裝置。

背景技術(shù)：
當(dāng)光束照射到樣品上時(shí)，其散射光絕大部分光子以瑞利散射的形式出射，其散射光與入射光頻率相等。另外，存在著極少些部分的光子將發(fā)生拉曼散射，這些光子與樣品相互作用時(shí)產(chǎn)生能量交換，出射光的頻率會(huì)發(fā)生藍(lán)移或紅移，統(tǒng)稱為拉曼位移(RamanShift)，兩者分別對應(yīng)于反斯托克斯(anti-Stokes)線和斯托克斯(Stokes)線。實(shí)際研究中通常用光譜儀收集拉曼散射光形成拉曼光譜。相對于生物學(xué)研究中最為常用的熒光研究方法，拉曼光譜最突出的優(yōu)點(diǎn)是非標(biāo)記、無光漂白、光譜線很窄，靈敏性高、信息豐富，可以定量反映樣品的化學(xué)組分和含量，被譽(yù)為“分子指紋識(shí)別技術(shù)”。而普通拉曼散射信號(hào)極其微弱，是研究、應(yīng)用發(fā)展的最大制約因素。針對拉曼信號(hào)很弱的問題，目前，發(fā)展了一系列的增強(qiáng)拉曼信號(hào)的方法，具體包括兩類。第一類是基于局域表面等離子共振(LocalizedSurfacePlasmonResonance，LSPR)效應(yīng)的表面增強(qiáng)拉曼(SurfaceEnhancedRamanSpectroscopy,SERS)和點(diǎn)增強(qiáng)拉曼(TipEnhancedRamanSpectroscopy,TERS)。根據(jù)增強(qiáng)原理，待測樣品需要與能產(chǎn)生等離子效應(yīng)的基底材料有足夠近的物理距離。所以SERS、TERS常與電子顯微鏡結(jié)合在真空環(huán)境下實(shí)現(xiàn)拉曼信號(hào)增強(qiáng)，對材料科學(xué)領(lǐng)域等無機(jī)樣品研究較多。該方法對于基本都在水環(huán)境中的生物領(lǐng)域樣品研究受到很大限制。近年來，相應(yīng)發(fā)展了一系列基于SERS原理的拉曼光譜方法來原位研究微生物等樣品，取得了一定的進(jìn)展[1,2]。目前，利用SERS進(jìn)行生物樣品研究，最主要的實(shí)現(xiàn)形式是仍是將SERS敏感納米顆粒以基底的形式置于樣品底部，不能有效保證樣品的生物活性。第二類拉曼信號(hào)增強(qiáng)依賴于非線性光學(xué)效應(yīng)，具體包含有：共振拉曼(ResonanceRamanSpectroscopy,RRS),受激拉曼(StimulatedRamanSpectroscopy，SRS)，相干反斯托克斯拉曼(Coherentanti-StocksRamanSpectroscopy,CARS)。此類增強(qiáng)主要是依靠超快激光系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)，實(shí)現(xiàn)過程相對復(fù)雜，對儀器硬件、實(shí)驗(yàn)操作要求均較高。目前，利用SERS技術(shù)對生物樣品進(jìn)行研究中與本實(shí)用新型最相似的方法是用膠體形式的金或銀納米顆粒與生物等樣品直接混合成溶液，然后將其滴到測量基底片上，待干燥后直接進(jìn)行測量。常用的基底有氟化鈣、硅、鋁片等。實(shí)驗(yàn)改變的參量通常包含納米顆粒膠體大小、顆粒聚集形式等。干燥后能保證待測樣品與納米顆粒有足夠近的物理距離以達(dá)到增強(qiáng)的效果。此方法最大的特點(diǎn)是實(shí)現(xiàn)過程簡便，增強(qiáng)效果是最重要的考量標(biāo)準(zhǔn)。將金屬顆粒(薄層)直接合成到樣品表面或細(xì)胞壁內(nèi)，是另一種SERS增強(qiáng)方法。合成各種類型的納米顆粒、納米尺度溝(gap)增強(qiáng)LSPR效應(yīng)，或者將顆粒進(jìn)行三維組裝以擴(kuò)大樣品與金屬表面的接觸面積。此外，將合成金屬納米顆?！叭觥钡綐悠飞希辉诩{米金屬顆粒表面包被生物相容性好的表殼；與生物樣品共同孵育培養(yǎng)以實(shí)現(xiàn)內(nèi)吞等都是近來發(fā)展的SERS方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
針對以上現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本實(shí)用新型提出了一種液體中激光誘導(dǎo)增強(qiáng)拉曼光譜的檢測與分選裝置。本實(shí)用新型的液體中激光誘導(dǎo)增強(qiáng)拉曼光譜的檢測與分選裝置包括：誘導(dǎo)光裝置、激發(fā)光裝置、合束鏡、第一二向色鏡、物鏡、樣品池、金屬納米顆粒、聚焦透鏡、激發(fā)光濾波器、拉曼光譜儀和計(jì)算機(jī)；其中，待測樣品與金屬納米顆粒均勻混合，溶于盛放在透明的樣品池中的液體中；誘導(dǎo)光裝置發(fā)出近紅外激光作為誘導(dǎo)光，經(jīng)合束鏡，再經(jīng)第一二向色鏡進(jìn)入物鏡，由高數(shù)值孔徑的物鏡高度聚焦，焦點(diǎn)位于懸浮在樣品池中的待測樣品上，在液體中形成三維光阱，懸浮固定待測樣品，并富集金屬納米顆粒于待測樣品的表面；激發(fā)光裝置發(fā)出可見光波段的激光，作為激發(fā)光，經(jīng)合束鏡與誘導(dǎo)光合束后，經(jīng)第一二向色鏡進(jìn)入物鏡，由高數(shù)值孔徑的物鏡高度聚焦，焦點(diǎn)同樣位于樣品池中的待測樣品上，形成激光誘導(dǎo)增強(qiáng)拉曼信號(hào)；激光誘導(dǎo)增強(qiáng)拉曼信號(hào)由物鏡聚焦后，經(jīng)第一二向色鏡與激發(fā)光和誘導(dǎo)光分路，經(jīng)過激發(fā)光濾波器，再經(jīng)聚焦透鏡聚焦后，進(jìn)入拉曼光譜儀，得到激光誘導(dǎo)增強(qiáng)拉曼光譜；拉曼光譜儀經(jīng)數(shù)據(jù)線連接至計(jì)算機(jī)，分析激光誘導(dǎo)增強(qiáng)拉曼光譜得到待測樣品的信息。樣品池采用無熒光的透明材料。在樣品池中盛放溶于液體的被測樣品，待測樣品包括生物樣品和非生物顆粒物；若待測樣品為細(xì)胞、蛋白、微生物和化學(xué)分子中的一種或多種，液體采用緩沖液、培養(yǎng)液和水溶液中的一種；若待測樣品為空氣中的固體顆粒物，則液體為水溶液或有機(jī)溶劑。在樣品池的頂部設(shè)置蓋玻片，用于蓋住液體，以降低液體與空氣接觸交換，增加檢測結(jié)果的穩(wěn)定性，尤其在揮發(fā)性檢測中有效降低誤差。金屬納米顆粒的材料采用金、銀、鉑和銅等錢幣金屬中的一種，激光激發(fā)局域表面等離子共振LSPR效應(yīng)。激光的入射波長大于金屬納米顆粒的直徑10倍，金屬納米顆粒的直徑小于100nm。誘導(dǎo)光和激發(fā)光均有可能激發(fā)金屬納米顆粒產(chǎn)生局域表面等離子共振LSPR。誘導(dǎo)光裝置包括：近紅外激光器、第一電子快門和耦合透鏡組；其中，近紅外激光器發(fā)出近紅外激光，經(jīng)第一電子快門，由耦合透鏡組擴(kuò)束后，光束的直徑大于物鏡的后瞳的直徑，形成誘導(dǎo)光。第一電子快門作為誘導(dǎo)光裝置的開關(guān)，控制近紅外激光器的開關(guān)，從而控制誘導(dǎo)光的誘導(dǎo)時(shí)間、洗脫分選時(shí)使用激光進(jìn)行操作的時(shí)間等。激發(fā)光裝置包括：TEM00模激光器、第二電子快門和擴(kuò)束鏡組；其中，固體激光器發(fā)出可見光波段的激光，由擴(kuò)束鏡組擴(kuò)束，形成激發(fā)光，在擴(kuò)束鏡組中設(shè)置第二電子快門。第二電子快門作為激發(fā)光裝置的開關(guān)，控制固體激光器的開關(guān)，從而控制激發(fā)光的拉曼散射激發(fā)時(shí)間。第一電子快門和第二電子快門由遙控器手動(dòng)控制。進(jìn)一步，本實(shí)用新型還包括照明光裝置和成像裝置，在樣品池外與物鏡相對的一側(cè)設(shè)置照明光裝置，并且在樣品池外與物鏡同側(cè)設(shè)置成像裝置；照明光裝置發(fā)射出明場光，照射在樣品池中，透射光經(jīng)物鏡聚焦后，經(jīng)第一二向色鏡與誘導(dǎo)光分路，再經(jīng)第二二向色鏡與激光誘導(dǎo)增強(qiáng)拉曼信號(hào)分路，成像在成像裝置上，成像裝置經(jīng)數(shù)據(jù)線連接至監(jiān)視器，實(shí)時(shí)顯示樣品池內(nèi)部的待測樣品。成像裝置通過數(shù)據(jù)線連接至計(jì)算機(jī)，實(shí)現(xiàn)對成像裝置的控制。成像裝置采用CCD相機(jī)。照明光裝置發(fā)射出明場光，照射在樣品池中，經(jīng)物鏡聚焦后，經(jīng)第一二向色鏡與誘導(dǎo)光分路，再經(jīng)第二二向色鏡與激光誘導(dǎo)增強(qiáng)拉曼信號(hào)分路，成像在成像裝置上，并將圖像傳輸至監(jiān)視器，實(shí)時(shí)顯示樣品池內(nèi)部的待測樣品；控制誘導(dǎo)光的焦點(diǎn)位于選定的樣品上，待誘導(dǎo)光在液體中形成的三維光阱穩(wěn)定后，控制載物臺(tái)的移動(dòng)帶動(dòng)樣品池的移動(dòng)，從而控制誘導(dǎo)光所形成的三維光阱相對樣品池移動(dòng)，使得選定的樣品與樣品池發(fā)生相對移動(dòng)，實(shí)現(xiàn)樣品分選和提取。樣品池中固定一個(gè)毛細(xì)管，毛細(xì)管的內(nèi)徑略大于選定的樣品的尺寸，毛細(xì)管的一端放置在樣品中，另一端與微注射器相連；當(dāng)選定的樣品移動(dòng)到毛細(xì)管在樣品池中的端口時(shí)，注射器施加負(fù)壓，將選定的樣品吸出。進(jìn)行分選前，還包括洗脫：控制誘導(dǎo)光不動(dòng)，待測樣品被誘導(dǎo)形成的三位光阱束縛懸浮固定在溶液中，對樣品池進(jìn)行灌流沖洗，實(shí)現(xiàn)金屬納米粒子的洗脫。本實(shí)用新型的優(yōu)點(diǎn)：本實(shí)用新型通過誘導(dǎo)光聚焦在懸浮的待測樣品上，在液體中形成三維光阱，使金屬納米顆粒富集在待測樣品的表面，通過激發(fā)光與誘導(dǎo)光焦點(diǎn)重合，共同作用，同時(shí)激發(fā)LSPR和拉曼信號(hào)，拉曼信號(hào)與LSPR相互作用產(chǎn)生激光誘導(dǎo)增強(qiáng)拉曼信號(hào)增強(qiáng)效果，從而更方便得到待測樣品的信息；本實(shí)用新型的實(shí)現(xiàn)方法簡便，光譜增強(qiáng)效果明顯，適合于液體環(huán)境中的生物樣品原位拉曼光譜快速檢測；本實(shí)用新型不需要待測樣品與金屬納米顆粒共同孵育，能有效提高實(shí)驗(yàn)效率，減少耗材消耗，特別適用于疾病、疫情、食品安全等快速檢測領(lǐng)域；同時(shí)，由于增強(qiáng)效應(yīng)，能有效減少了激發(fā)光的強(qiáng)度和光譜采集時(shí)間，減少激光對樣品產(chǎn)生的影響；此外，本實(shí)用新型的方法中金屬納米顆粒與待測樣品作用時(shí)間短，大大降低了金屬納米顆粒對生物樣品的毒性損傷，從而能最大程度地反應(yīng)活細(xì)胞真實(shí)生理狀態(tài)。再有，近紅外激光無損的將待測樣品非接觸懸浮固定在液體中，同時(shí)又將金屬納米顆粒富集到待測樣品的表面，使待測樣品與樣品池的池壁無接觸，有效降低了底部玻片的自發(fā)熒光對拉曼信號(hào)的干擾；同時(shí)，避免了對待測樣品的機(jī)械性損傷。更重要的是，整個(gè)檢測過程都是在液體環(huán)境中快速完成的，對生物樣品(如活細(xì)胞)幾乎無損，有利于拉曼光譜檢測后進(jìn)一步培養(yǎng)、擴(kuò)增等研究，從而拉曼光譜測量后的待測樣品可以方便地用本實(shí)用新型形成的光鑷進(jìn)行分選、提取和洗脫，實(shí)現(xiàn)單個(gè)活細(xì)胞的拉曼光譜識(shí)別和分選功能，有利于生物樣品的后續(xù)研究。附圖說明圖1為本實(shí)用新型的液體中激光誘導(dǎo)增強(qiáng)拉曼光譜的檢測與分選裝置的示意圖；圖2為根據(jù)本實(shí)用新型的液體中激光誘導(dǎo)增強(qiáng)拉曼光譜的檢測方法的一個(gè)實(shí)施例得到的激光誘導(dǎo)增強(qiáng)拉曼光譜圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖，通過具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本實(shí)用新型。如圖1所示，本實(shí)施例的液體中激光誘導(dǎo)增強(qiáng)拉曼光譜的檢測與分選裝置包括：誘導(dǎo)光裝置1、激發(fā)光裝置2、合束鏡3、第一二向色鏡4、物鏡5、樣品池6、金屬納米顆粒、聚焦透鏡、拉曼光譜儀7、照明光裝置8和計(jì)算機(jī)9；其中，透明的樣品池6中盛放溶于液體中的待測樣品，金屬納米顆粒注入至樣品池的液體中；誘導(dǎo)光裝置1發(fā)出近紅外激光作為誘導(dǎo)光，先經(jīng)第一反射鏡M1反射后經(jīng)合束鏡3，由第一二向色鏡4反射進(jìn)入物鏡5，由物鏡5高度聚焦，從樣品池的底部聚焦至樣品池6內(nèi)，焦點(diǎn)位于懸浮在樣品池6中的待測樣品上，形成三維光阱，懸浮固定待測樣品，并富集金屬納米顆粒于待測樣品的表面；激發(fā)光裝置2發(fā)出可見光波段的激光，作為激發(fā)光，先經(jīng)第二反射鏡M2反射后經(jīng)合束鏡3與誘導(dǎo)光合束后，由第一二向色鏡4反射進(jìn)入物鏡，由物鏡5高度聚焦，焦點(diǎn)同樣位于樣品池中的待測樣品上，激發(fā)富集在待測樣品表面的納米金屬顆粒產(chǎn)生局域表面等離子共振LSPR效應(yīng)，同時(shí)激發(fā)待測樣品產(chǎn)生拉曼信號(hào)，拉曼信號(hào)與局域表面等離子共振LSPR效應(yīng)相互作用，形成激光誘導(dǎo)增強(qiáng)拉曼信號(hào)；激光誘導(dǎo)增強(qiáng)拉曼信號(hào)由物鏡5收集，經(jīng)第一二向色鏡4透射，第二二向色鏡83反射，經(jīng)第三反射鏡M3反射，經(jīng)激發(fā)光濾波器71過濾瑞利散射光后，經(jīng)聚焦透鏡72聚焦，進(jìn)入拉曼光譜儀7，得到激光誘導(dǎo)增強(qiáng)拉曼光譜；拉曼光譜儀7經(jīng)數(shù)據(jù)線連接至計(jì)算機(jī)9，拉曼散射測的是分子鍵的振動(dòng)信號(hào)，通過分析測得的拉曼光譜，可以進(jìn)一步推測出待測樣品的成分和相對含量。合束鏡3采用二向色鏡。激發(fā)光濾波器71采用陷波濾波器。在本實(shí)施例中，樣品池6采用厚度約為5mm的有機(jī)塑料中間打孔，底部粘貼石英波片62，頂部蓋上石英的蓋波片61。待測樣品為吡啶，液體采用1mL濃縮的銀溶膠，加入10uL、1M的NaCl鹽溶液，終濃度約為10mM。金屬納米顆粒的材料采用銀，銀納米顆粒的直徑約60nm，球形。誘導(dǎo)光裝置1包括：近紅外激光器11、第一電子快門12和耦合透鏡組13；其中，近紅外激光器1發(fā)出波長1064nm的單橫模激光，經(jīng)第一電子快門12，由耦合透鏡組13擴(kuò)束后，光束的直徑大于物鏡的后瞳的直徑，形成誘導(dǎo)光。激發(fā)光裝置2包括：固體激光器21、第二電子快門22和擴(kuò)束鏡組23；其中，固體激光器21發(fā)出532nm(500mW)TEM00模激光，由擴(kuò)束鏡組擴(kuò)束23，形成激發(fā)光，在擴(kuò)束鏡組中設(shè)置第二電子快門22。照明光裝置8設(shè)置在樣品池的上面，照明光裝置包括明場照明鹵素?zé)?1和聚光鏡82，明場照明鹵素?zé)?1發(fā)射出明場光，由聚光鏡82聚焦后照射在樣品池6中，樣品經(jīng)物鏡5聚焦后，經(jīng)第一二向色鏡4和第二二向色鏡83透射，成像在成像裝置84上，成像裝置84經(jīng)數(shù)據(jù)線連接至監(jiān)視器85，實(shí)時(shí)顯示樣品池內(nèi)部的待測樣品。成像裝置84通過數(shù)據(jù)線連接至計(jì)算機(jī)9，實(shí)現(xiàn)對成像裝置的控制。成像裝置采用CCD相機(jī)。本實(shí)施例的液體中激光誘導(dǎo)增強(qiáng)拉曼光譜的檢測方法包括：1)樣品制備：a)金屬顆粒制備：金屬納米顆粒采用銀，銀納米顆粒存在于銀溶膠中；b)樣品制備：99％分析純濃度的吡啶稀釋10倍，配制1M的NaCl溶液；c)將10uLNaCl溶液，8uL吡啶注入1mL銀溶膠中混合均勻；d)注入樣品池，蓋上蓋玻片。2)打開照明光裝置，照明光裝置發(fā)射出明場光，照射在樣品池中，經(jīng)物鏡聚焦后，分別經(jīng)第一和第二二向色鏡透射后，成像在成像裝置上，并將圖像傳輸至監(jiān)視器，實(shí)時(shí)顯示樣品池內(nèi)部的待測樣品。3)關(guān)閉照明光裝置。4)打開誘導(dǎo)光裝置，誘導(dǎo)光裝置發(fā)出1064nm激光作為誘導(dǎo)光，經(jīng)合束鏡后，再經(jīng)第一二向色鏡反射進(jìn)入物鏡，由高數(shù)值孔徑的物鏡高度聚焦，焦點(diǎn)位于懸浮在樣品池中的待測樣品上，距樣品池底部5～10μm，形成三維光阱，富集金屬納米顆粒于待測樣品的表面。5)打開激發(fā)光裝置，激發(fā)光裝置發(fā)出532nm(500mW)TEM00模激光，作為激發(fā)光，經(jīng)合束鏡與誘導(dǎo)光合束后，經(jīng)第一二向色鏡進(jìn)入物鏡，由高數(shù)值孔徑的物鏡高度聚焦，焦點(diǎn)同樣位于樣品池中的待測樣品上，激發(fā)富集在待測樣品表面的納米金屬顆粒產(chǎn)生局域表面等離子共振LSPR效應(yīng)，同時(shí)激發(fā)待測樣品產(chǎn)生拉曼信號(hào)，拉曼信號(hào)與局域表面等離子共振LSPR效應(yīng)相互作用，形成激光誘導(dǎo)增強(qiáng)拉曼信號(hào)。6)激光誘導(dǎo)增強(qiáng)拉曼信號(hào)由物鏡收集，經(jīng)第一二向色鏡與誘導(dǎo)光和激發(fā)光分路，經(jīng)第二二向色鏡與照明光分路，經(jīng)過激發(fā)光濾波器，再經(jīng)聚焦透鏡聚焦后，進(jìn)入拉曼光譜儀，得到激光誘導(dǎo)增強(qiáng)拉曼光譜。拉曼光譜由光譜儀附帶的液氮制冷光譜CCD接收。7)拉曼光譜儀將數(shù)據(jù)傳輸至計(jì)算機(jī)，分析激光誘導(dǎo)增強(qiáng)拉曼光譜得到待測樣品的成分和相對含量。圖2是本實(shí)施例的激光誘導(dǎo)增強(qiáng)拉曼光譜裝置所采集的一組數(shù)據(jù)。圖2中X表示拉曼位移，單位cm-1；Y軸表示拉曼散射光強(qiáng)，任意單位。光滑實(shí)線表示激光誘導(dǎo)增強(qiáng)拉曼譜信號(hào)，貼近X軸的帶三角標(biāo)記實(shí)線表示自發(fā)拉曼譜信號(hào)。自發(fā)拉曼組用蒸餾水代替納米銀顆粒，其他與實(shí)驗(yàn)組保持一致。在本實(shí)用新型的激光誘導(dǎo)增強(qiáng)拉曼光譜裝置下，吡啶分子增強(qiáng)拉曼與自發(fā)拉曼光譜信號(hào)相比，增強(qiáng)超過兩個(gè)數(shù)量級(jí)。最后需要注意的是，公布實(shí)施例的目的在于幫助進(jìn)一步理解本實(shí)用新型，但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以理解：在不脫離本實(shí)用新型及所附的權(quán)利要求的精神和范圍內(nèi)，各種替換和修改都是可能的。因此，本實(shí)用新型不應(yīng)局限于實(shí)施例所公開的內(nèi)容，本實(shí)用新型要求保護(hù)的范圍以權(quán)利要求書界定的范圍為準(zhǔn)。