本發(fā)明涉及一種次黃嘌呤的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
：魚肉中含有容易被人體所消化吸收的蛋白質(zhì)，并且這些蛋白質(zhì)的含量有很多。蛋白質(zhì)不僅含量多，其中還含有人體所需的不同種類氨基酸，亮氨酸和賴氨酸是人體需求最多魚中含有量也豐富的兩大氨基酸。魚肉是所有肉類中最容易消化的，消化繼而被人體吸收的轉(zhuǎn)化率能夠達(dá)到90％。魚肉中的脂肪含量相對(duì)較低，與畜肉相比，含量只在1％-10％。魚肉中的脂肪也是很容易被人們消化吸收的，它呈中性，人們的消化率能夠接近百分之百。無機(jī)鹽也是魚肉中含量非常豐富的，不僅在于它的含量比畜肉多十到五十倍之間，種類也高達(dá)十種以上。更為重要的是人體必不可少的微量元素也儲(chǔ)存在魚肉當(dāng)中。魚肝是魚中的脂肪，這類脂肪中維生素A和維生素D的含量很多，與畜肉的含量相比，更勝的不只一籌。魚類新鮮度的檢測(cè)關(guān)系到魚制品的安全衛(wèi)生和營(yíng)養(yǎng)程度各個(gè)方面，在魚制品的加工制作買賣過程中有至高無上的作用。魚類早期從新鮮到次新鮮再到腐敗這一系列的變化過程中，次黃嘌呤的含量是不斷上升的，魚類在腐敗以前都可以用次黃嘌呤的含量檢測(cè)魚的新鮮度。如今，用來檢測(cè)水產(chǎn)品新鮮程度的方式，大部分為傳統(tǒng)檢測(cè)。其中有人們?nèi)菀讖耐庥^著手的感官評(píng)價(jià)，也有需要相關(guān)儀器藥品，由專業(yè)檢測(cè)人員驗(yàn)證的微生物檢測(cè)和化學(xué)指標(biāo)測(cè)定。如果將這三種方法同時(shí)用到水產(chǎn)品新鮮度的檢測(cè)中，結(jié)果理論來說會(huì)準(zhǔn)確。可是，如此將會(huì)花費(fèi)大量的人力物力和時(shí)間。跟傳統(tǒng)的檢測(cè)方法相比，諸如生物傳感器、新鮮度指示卡、電子舌、電子鼻這些能夠快速方便的方式的研究也如雨后春筍一般，但在實(shí)地應(yīng)用層面卻并不多見。水產(chǎn)品新鮮度的檢測(cè)方法大致可以分為：人體感官層次上的測(cè)試、物理方面的測(cè)試、化學(xué)方面的測(cè)試等。其中物理檢測(cè)有激光檢測(cè)、僵硬指數(shù)測(cè)試，化學(xué)檢測(cè)有很多，比如pH值檢測(cè)、k值測(cè)定、揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定和丙二醛的測(cè)定等。過去人們用于檢測(cè)魚類新鮮度的一些方法的實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備昂貴，操作方法需要專業(yè)人員進(jìn)行專業(yè)作業(yè)，時(shí)間及人員的付出上不可估量，推行的難度較大。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明目的是提供一種易操作、完成速度快、易廣泛推廣的檢測(cè)魚中次黃嘌呤含量的方法。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的一種檢測(cè)魚中次黃嘌呤含量的方法是按下述步驟進(jìn)行的：步驟一、取魚肉研磨至泥狀，離心取上清液，用過濾膜過濾后去除沉淀蛋白；步驟二、然后離心取上清液，用辣根過氧化物酶和黃嘌呤氧化酶偶聯(lián)催化，再用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)獲取次黃嘌呤的含量。進(jìn)一步限定：步驟一中取5g魚肉研磨。步驟一中所述去除沉淀蛋白是按下述步驟制備的：向用過濾膜過濾的濾液中加入0.1mL10％(質(zhì)量)三氯醋酸，攪拌混勻。步驟二中偶聯(lián)催化是：向上清液中依次加入3mL的苯酚、3mL4-氨基安替比林、3mLTris-HCL緩沖液(pH8.0)、3mL疊氮鈉和3mL辣根過氧化物酶，加100μL黃嘌呤氧化酶和10mL樣品液，置于37℃的恒溫水浴鍋內(nèi)保溫8min，然后煮沸2min后加入1mL濃度為71.389mg/mL的Na2CO3溶液，放入冰水中冷卻，用紫外分光光度計(jì)測(cè)量。步驟二中紫外分光光度計(jì)測(cè)量波長(zhǎng)為508nm。本發(fā)明中酶測(cè)定法原理：次黃嘌呤在進(jìn)行一系列化學(xué)反應(yīng)的過程中，是在黃嘌呤氧化酶的作用下，伴著1mol分子氧和1mol水的情況下，生成了1mol尿酸和1mol過氧化氫。過氧化氫在辣根過氧化物酶的作用下，分解的產(chǎn)物，能夠讓4-氨基安替比林與苯酚反應(yīng)，生成一種化合物，這種化合物是亞醌類化合物，能顯出紅色。在整個(gè)反應(yīng)中，黃嘌呤氧化酶和辣根過氧化物酶充足的前提下，由紅色化合物測(cè)定出的吸光度值大小(可見光范圍內(nèi))，就可以推測(cè)出樣品中次黃嘌呤的含量。本發(fā)明的方法簡(jiǎn)單，完成速度快，設(shè)計(jì)合理，準(zhǔn)確度高，數(shù)據(jù)參考性強(qiáng)，操作容易，無須特制實(shí)驗(yàn)儀器，即使用現(xiàn)有檢測(cè)儀器就能達(dá)到檢測(cè)目的，有利于大面積推廣和使用。本發(fā)明用于判斷魚的新鮮度。本發(fā)明通過檢測(cè)鯽魚中次黃嘌呤的含量來判斷魚肉的新鮮度，實(shí)現(xiàn)了對(duì)魚肉新鮮度的準(zhǔn)確判定。本發(fā)明對(duì)鯽魚早期品質(zhì)新鮮度變化的檢測(cè)，有助于鯽魚新鮮度變化的及時(shí)發(fā)現(xiàn)。具體實(shí)施方式實(shí)施例1：本實(shí)施例中檢測(cè)魚中次黃嘌呤含量的方法是按下述步驟進(jìn)行的：步驟一、固體放入小號(hào)離心管，加蒸餾水，放入圓槽中，在其對(duì)稱位置放入同樣型號(hào)的魚類處理：把魚洗干凈，剪去魚鰓魚尾，剪成小塊，取5g魚肉，用研缽充分研磨至泥狀后，將離心管，并添加一樣多的蒸餾水，保證對(duì)稱位置重量平衡的前提下，打開低速離心機(jī)開關(guān)，設(shè)置成5000r/min，10min離心，之后用塑料吸管提取上清液到注射器中，蓋上過濾膜擠壓過濾10mL至燒杯，按壓過程中若發(fā)現(xiàn)出液體速率下降，及時(shí)更換新的過濾膜。在過濾好的液體中，用塑料滴管加入10％三氯醋酸0.1mL，拿玻璃棒攪拌，混勻沉淀蛋白。步驟二、然后倒入新的小號(hào)離心管中，添加同樣多的蒸餾水，用同樣的方法放置對(duì)側(cè)的小號(hào)離心管，放入低速離心機(jī)5000r/min低速離心20min，用塑料吸管取上清液到試管用進(jìn)行紫外分光光度計(jì)法檢驗(yàn)；紫外分光光度計(jì)法：在試管中用各自的10mL吸量管和洗耳球依次加入3mL的苯酚、3mL4-氨基安替比林、3mLTris-HCL緩沖液(pH8.0)、3mL疊氮鈉、3mL辣根過氧化物酶，用移液槍和無菌槍頭加100μL黃嘌呤氧化酶，酶液濃度為0.32U·mL-1，及10mL的上層清液。提前打開恒溫水浴鍋定在37℃預(yù)熱，將試管中的液體混勻，待水浴鍋達(dá)到37℃后，放置在恒溫水浴鍋中計(jì)時(shí)保溫8min。同時(shí)，將800mL的燒杯中加入足夠沒過試管中液體水平面的水，打開電熱套，加熱水至沸騰后把試管放入其中，煮沸2min終止反應(yīng)，改成用塑料滴管加入Na2CO3溶液1mL即可，之后立即用手套將試管轉(zhuǎn)移放入冰水中冷卻。完成上述步驟后，可打開電腦及紫外分光光度計(jì)，讓其自檢合格后，以不加入次黃嘌呤的蒸餾水做參比溶液，把比色皿洗凈，用擦鏡紙將玻璃面擦拭干凈，倒入相應(yīng)濃度的溶液潤(rùn)洗2-3次。用定波長(zhǎng)檢測(cè)方式，在電腦上將檢測(cè)波長(zhǎng)調(diào)至508nm，讓其調(diào)零自檢后，將參比溶液放入紫外分光光度計(jì)中，保證鏡面可以通過光束照射，蓋好樣品室蓋，按下“Autozero”按鈕，儀器自動(dòng)進(jìn)行校準(zhǔn)(校準(zhǔn)工作只需要在第一次測(cè)量時(shí)進(jìn)行，只要不改編參比溶液和測(cè)量波長(zhǎng)范圍的情況下，只需校準(zhǔn)一次)，在樣品池放入樣品液，單機(jī)“測(cè)量”命令按鈕，進(jìn)行測(cè)量工作。表1次黃嘌呤檢測(cè)梯度的測(cè)試判斷依據(jù)新鮮魚類：次黃嘌呤≤3.6×10-4g/5g；次新鮮魚類:3.6×10-4g/5g<次黃嘌呤≤5.9×10-4g/5g；腐敗魚類:黃嘌呤>5.9×10-4g/5g。下述實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)明效果：1不同濃度次黃嘌呤溶液吸光度檢測(cè)表2.次黃嘌呤濃度為0.02mmol/L情況下吸光度值次數(shù)12345平均值A(chǔ)bs0.05400.05420.05410.05390.05380.0540表3.次黃嘌呤濃度為0.04mmol/L情況下吸光度值次數(shù)12345平均值A(chǔ)bs0.05960.05930.05950.05920.05940.0594表4.次黃嘌呤濃度為0.06mmol/L情況下吸光度值次數(shù)12345平均值A(chǔ)bs0.06410.06390.06390.06380.06380.0639表5.次黃嘌呤濃度為0.08mmol/L情況下吸光度值次數(shù)12345平均值A(chǔ)bs0.15210.15200.15190.15220.15230.1521表6.次黃嘌呤濃度為0.1mmol/L情況下吸光度值次數(shù)12345平均值A(chǔ)bs0.17150.17170.17190.17170.17170.1717表7.次黃嘌呤濃度為0.12mmol/L情況下吸光度值2雙酶法偶聯(lián)分光光度計(jì)測(cè)魚中次黃嘌呤表8.魚肉重量1號(hào)2號(hào)3號(hào)4號(hào)燒杯重量(g)97.596.598.598.4總重量(g)162.8172167.8167.7魚肉重量(g)65.375.569.369.3儲(chǔ)存溫度冷凍-18℃冷藏4度℃15℃30℃表9.30℃時(shí)，魚的新鮮程度。表10.15℃時(shí)，魚的新鮮程度。表11.4℃時(shí)，魚的新鮮程度魚類在不同儲(chǔ)存溫度下新鮮度的變化是不同的，30℃的魚腐敗的最快，其次是15℃的魚，然后是4℃的魚，最后是-18℃的魚。30℃保存條件下，6h內(nèi)是新鮮的，10h內(nèi)是次新鮮的，12h以上就腐敗了。15℃保存條件下，9h內(nèi)是新鮮的，15h內(nèi)是次新鮮的，18h以上就腐敗了。4℃保存條件下，8h內(nèi)是新鮮的，16h內(nèi)是次新鮮的，24h以上就腐敗了。-18℃保存條件下，儲(chǔ)存的時(shí)間會(huì)相對(duì)長(zhǎng)一些，2個(gè)月的魚肉仍可食用。為了方便人們即使食用健康的魚還可以得出以下結(jié)論：30℃實(shí)驗(yàn)組：夏天買完鮮活魚類沒有即使食用，室外儲(chǔ)存魚類時(shí)，應(yīng)在10小時(shí)之前盡快食用。若超過10小時(shí)依舊沒有食用此魚，之后就不要再食用此魚。15℃實(shí)驗(yàn)組：春秋天買完鮮活魚類沒有即使食用，室外儲(chǔ)存魚類時(shí)，應(yīng)在15小時(shí)之前盡快食用。若超過15小時(shí)依舊沒有食用此魚，之后就不要再食用此魚。4℃實(shí)驗(yàn)組：冬天以及儲(chǔ)存在冰箱冷藏室的鮮活魚類沒有即使食用，應(yīng)在16小時(shí)之前盡快食用。若超過16小時(shí)依舊沒有食用此魚，之后就不要再食用此魚。-18℃實(shí)驗(yàn)組：使用冰箱冷凍室保存鮮活魚類沒有即使食用的情況下，2個(gè)月之內(nèi)都可放心食用。上述實(shí)驗(yàn)用準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)提示人們?cè)谫?gòu)買完鮮活魚類的儲(chǔ)存中不要超出相應(yīng)的天數(shù)，為人們可以更加健康的食用魚類具有指導(dǎo)意義。本發(fā)明的檢測(cè)方式簡(jiǎn)單，完成速度快，數(shù)據(jù)參考性強(qiáng)的方向：檢測(cè)方式簡(jiǎn)單是要人們能夠更容易的操作，普通人也能把握技術(shù)要領(lǐng)，讓檢測(cè)魚類的行為大眾化。完成速度快是說檢測(cè)的方法時(shí)間不要過長(zhǎng)，能夠讓人在短時(shí)間內(nèi)就得出魚類是何種新鮮程度的結(jié)論。數(shù)據(jù)參考性強(qiáng)是說測(cè)出的數(shù)據(jù)要能準(zhǔn)確的反應(yīng)魚類的新鮮程度，讓檢測(cè)具有權(quán)威性。本發(fā)明不破壞食材的無損化方向：從前的實(shí)驗(yàn)技術(shù)都是需要提取相應(yīng)的魚肉，對(duì)提取下來的魚肉做進(jìn)一步的檢驗(yàn)。而現(xiàn)在要發(fā)展的方向是提取更少的魚肉，或者說是不用提取魚肉就能夠完成實(shí)驗(yàn)的測(cè)量，得出可靠的結(jié)論。讓樣品在檢測(cè)的過程中損失的盡量少。本發(fā)明更商品化、實(shí)用化方向：現(xiàn)在很多檢測(cè)魚類新鮮程度的實(shí)驗(yàn)方法都需要在實(shí)驗(yàn)室中，有相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)器材才能完成實(shí)驗(yàn)測(cè)量，實(shí)驗(yàn)設(shè)備的價(jià)格也會(huì)相對(duì)偏高。而將來的檢測(cè)不是說讓實(shí)驗(yàn)儀器消失，而是說實(shí)驗(yàn)儀器盡可能的變小變便宜，能夠方便人們隨時(shí)及時(shí)的測(cè)量。讓檢測(cè)的機(jī)器能成為人們手中的商品，讓人們?yōu)榱四芴岣唪~類食用質(zhì)量去進(jìn)行魚類新鮮度的檢測(cè)。當(dāng)前第1頁1 2 3