本發(fā)明涉及藥物檢測(cè)領(lǐng)域,具體涉及一種芪葛顆粒hplc指紋圖譜的構(gòu)建方法及其指紋圖譜。
背景技術(shù):
指紋圖譜是一種國際公認(rèn)用來控制中藥或中藥復(fù)方質(zhì)量的有效手段,它是建立在中藥化學(xué)成分系統(tǒng)研究的基礎(chǔ)上,主要用于評(píng)價(jià)中藥材以及中藥制劑質(zhì)量的真實(shí)性、優(yōu)良性和穩(wěn)定性。在一定條件下指紋圖譜能全面反映中藥或中藥復(fù)方所含成分的相對(duì)量,從而使中藥及中藥復(fù)方的質(zhì)控指標(biāo)由單一成分的含量測(cè)定上升為對(duì)整體成分的質(zhì)量控制,實(shí)現(xiàn)對(duì)中藥及其復(fù)方制劑內(nèi)在質(zhì)量的綜合評(píng)價(jià)和整體物質(zhì)的全面控制,更具科學(xué)性和全面性。在中藥的生產(chǎn)和流通中,中藥產(chǎn)品質(zhì)量控制主要通過單成分定量,并不能對(duì)產(chǎn)品的質(zhì)量進(jìn)行全面控制。因此建立一種綜合評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量的方法是必然趨勢(shì)。
芪葛顆粒處方為臨床經(jīng)驗(yàn)方,由黃芪、葛根、陳皮藥材組成,具有養(yǎng)胃健脾,益氣生肌,解酒毒的功效,可用于預(yù)防治療胃黏膜損傷、脾胃虛弱等疾病以及酒前酒后的保健作用。黃芪、葛根、陳皮所含化學(xué)成分組成復(fù)雜,個(gè)別成分的定性定量分析難以全面反映芪葛顆粒中所含化學(xué)成分的種類與數(shù)量,不能對(duì)芪葛顆粒質(zhì)量進(jìn)行整體描述和評(píng)價(jià)。為更有效地控制質(zhì)量,確保制劑臨床使用的安全、有效,本發(fā)明采用hplc指紋圖譜的研究方法對(duì)芪葛顆粒進(jìn)行研究,用色譜指紋圖譜相似度計(jì)算軟件對(duì)得到的hplc指紋圖譜進(jìn)行相似度計(jì)算,應(yīng)用對(duì)照品對(duì)主要特征峰進(jìn)行化學(xué)指認(rèn),并對(duì)復(fù)方化學(xué)成分指紋圖譜色譜峰的歸屬進(jìn)行了研究。該方法穩(wěn)定性、精密度、重復(fù)性均符合要求,較全面反映了芪葛顆粒整體特征信息,為制劑質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了依據(jù)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
本發(fā)明的目的在于公開一種芪葛顆粒hplc指紋圖譜的構(gòu)建方法及其指紋圖譜
一種芪葛顆粒hplc指紋圖譜的建立方法,包括以下步驟:
(1)制備混合對(duì)照品溶液;
(2)制備供試品溶液;
(3)利用hplc法制作指紋圖譜;所述hplc法制作指紋圖譜的條件是:色譜柱:依利特hypersilods2c18柱(250mm×4.6mm,5μm);流動(dòng)相:0.1%檸檬酸水溶液(a)-甲醇(b),梯度洗脫;洗脫程序?yàn)椋?-20min,10%-25%(b);20-45min,25%-35%(b);45-50min,35%-37%(b);50-55min,37%(b);55-60min,37%-45%(b);60-65min,45%-50%(b);65-70min,50%-60%(b);70-75min,60%-70%(b);75-80min,70%-80%(b);80-85min,80%-90%(b);流速1.0ml/min;柱溫30℃,進(jìn)樣量20μl;檢測(cè)波長(zhǎng)250nm。
優(yōu)選的,芪葛顆粒由黃芪30份,葛根10份,陳皮5份煎煮制成。
優(yōu)選的,制備混合對(duì)照品溶液的方法是:稱取3’-羥基葛根素、葛根素、大豆苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、染料木苷、橙皮苷、大豆苷元、毛蕊異黃酮、染料木素、芒柄花素、川陳皮素、桔皮素12種對(duì)照品分別用甲醇溶解配制成儲(chǔ)備液,精密吸取各對(duì)照品儲(chǔ)備液適量,置于量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,配制成混合對(duì)照品溶液。
優(yōu)選的,制備的混合對(duì)照品溶液是:配制成濃度分別為3’-羥基葛根素0.129mg/ml、葛根素0.693mg/ml、大豆苷11.35μg/ml、毛蕊異黃酮葡萄糖苷22.80μg/ml、染料木苷56.25μg/ml、橙皮苷57.00μg/ml、大豆苷元10.45μg/ml、毛蕊異黃酮8.35μg/ml、染料木素5.25μg/ml、芒柄花素5.72μg/ml、川陳皮素7.90μg/ml、桔皮素4.10μg/ml的混合對(duì)照品溶液。
優(yōu)選的,供試品溶液的制備方法是:精密稱取芪葛顆粒樣品1.0g,置于10ml量瓶中,加50%甲醇適量,超聲處理30min,放冷,50%甲醇定容至刻度,搖勻,0.22μm微孔濾膜過濾,取續(xù)濾液,即得。
一種芪葛顆粒hplc指紋圖譜特征在于,其特征峰為與3’-羥基葛根素對(duì)應(yīng)的3號(hào)峰、與葛根素對(duì)應(yīng)的5號(hào)峰、與大豆苷對(duì)應(yīng)的9號(hào)峰、與毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)應(yīng)的12號(hào)峰、與染料木苷13號(hào)峰、與橙皮苷對(duì)應(yīng)的15號(hào)峰、與大豆苷元對(duì)應(yīng)的17號(hào)峰、毛蕊異黃酮對(duì)應(yīng)的18號(hào)峰、染料木素對(duì)應(yīng)的19號(hào)峰、與芒柄花素對(duì)應(yīng)的20號(hào)峰、與川陳皮素對(duì)應(yīng)的21號(hào)峰、與桔皮素對(duì)應(yīng)的22號(hào)峰,其相對(duì)保留時(shí)間分別為17.89、23.59、28.14、34.94、36.32、49.16、60.53、64.93、67.40、74.29、77.88、80.65,以9號(hào)峰大豆苷為參照峰。
優(yōu)選的,特征峰還包括:相對(duì)保留時(shí)間為14.03的1號(hào)峰、相對(duì)保留時(shí)間為16.92的2號(hào)峰、相對(duì)保留時(shí)間為21.71的4號(hào)峰、相對(duì)保留時(shí)間為25.15的6號(hào)峰、相對(duì)保留時(shí)間為25.91的7號(hào)峰、相對(duì)保留時(shí)間為27.25的8號(hào)峰、相對(duì)保留時(shí)間為30.21的10號(hào)峰、相對(duì)保留時(shí)間為33.08的11號(hào)峰、相對(duì)保留時(shí)間為42.02的14號(hào)峰、相對(duì)保留時(shí)間為54.62的16號(hào)峰。
優(yōu)選的,特征在于:圖譜中12、18、20號(hào)峰來源于黃芪,1、2、3、5、7、8、9、13、14、16、17、19、20號(hào)峰來源葛根,15、21、22號(hào)峰來源于陳皮。
本發(fā)明的有益效果是:指紋圖譜可以全面地反映藥物所含化學(xué)成分的種類和數(shù)量,有效表征其質(zhì)量,突破了中藥復(fù)方質(zhì)量控制模式的單一性和片面性,有利于其全面質(zhì)量檢測(cè)和整體質(zhì)量的控制,有助于提高該藥物臨床使用安全性和有效性。同時(shí),本發(fā)明所述芪葛顆粒指紋圖譜的方法具有穩(wěn)定性高、精密度高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。
附圖說明
圖1是本發(fā)明芪葛顆粒hplc標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。
圖2是精密度試驗(yàn)指紋圖譜的疊加圖。
圖3是重復(fù)性試驗(yàn)指紋圖譜的疊加圖。
圖4是穩(wěn)定性試驗(yàn)指紋圖譜的疊加圖。
圖5是本發(fā)明的10批芪葛顆粒樣品的hplc指紋圖譜。
圖6是本發(fā)明的芪葛顆粒指紋圖譜與混合對(duì)照品色譜圖,其中a為芪葛顆粒,b為混合標(biāo)準(zhǔn)品;3為3'-羥基葛根素峰,5為葛根素峰,9為大豆苷峰,12為毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰,13為染料木苷峰,15為橙皮苷峰,17為大豆苷元峰,18為毛蕊異黃酮峰,19為染料木素峰,20為芒柄花素峰,21為桔皮素峰,22為川陳皮素峰。
圖7單味藥材與芪葛顆粒樣品色譜圖,其中a為陳皮的峰,b為葛根的峰,c為黃芪的峰,d為芪葛顆粒的峰。
具體實(shí)施方式
通過下面具體實(shí)施例及其附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述,便于理解本發(fā)明的技術(shù)方案,但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
1.芪葛顆粒的制備:
(1)將黃芪、葛根、陳皮除雜洗凈,然后加藥材總重量12倍的水浸泡30min,武火煮開后,文火煎煮30min,倒出煎液,按照同樣的方法煎煮3次,合并三次的水煎液,混合攪勻即可;
(2)將步驟(1)的水煎液濃縮至相對(duì)密度為1.3的浸膏,備用;
(3)測(cè)定步驟(2)中的浸膏重量,加入糖粉、糊精的混合物,其中浸膏、糖粉及糊精的的重量比為1:3:1,混勻并制成軟材,過16目篩制粒,60℃真空干燥,即得。
2.色譜條件:
色譜柱:依利特hypersilods2c18柱(250mm×4.6mm,5μm);流動(dòng)相:0.1%檸檬酸水溶液(a)-甲醇(b),梯度洗脫,洗脫程序?yàn)椋?-20min,10%-25%(b);20-45min,25%-35%(b);45-50min,35%-37%(b);50-55min,37%(b);55-60min,37%-45%(b);60-65min,45%-50%(b);65-70min,50%-60%(b);70-75min,60%-70%(b);75-80min,70%-80%(b);80-85min,80%-90%(b);流速1.0ml/min;檢測(cè)波長(zhǎng)250nm;柱溫30℃,進(jìn)樣量20μl。
3.方法與結(jié)果
3.1混合對(duì)照品溶液的制備
12種對(duì)照品分別用甲醇溶解配制成儲(chǔ)備液,精密吸取各對(duì)照品適量,配制成濃度分別為3'-羥基葛根素0.129mg/ml、葛根素0.693mg/ml、大豆苷11.35μg/ml、毛蕊異黃酮葡萄糖苷22.80μg/ml、染料木苷56.25μg/ml、橙皮苷57.00μg/ml、大豆苷元10.45μg/ml、毛蕊異黃酮8.35μg/ml、染料木素5.25μg/ml、芒柄花素5.72μg/ml、川陳皮素7.90μg/ml、桔皮素4.10μg/ml的混合對(duì)照品溶液。
3.2供試品溶液的制備
精密稱取芪葛顆粒樣品1.0g,置于10ml量瓶中,加50%甲醇適量,超聲處理30min,放冷,50%甲醇定容至刻度,搖勻,0.22μm微孔濾膜過濾,取續(xù)濾液,即得。
3.3標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的測(cè)定
精密吸取供試品溶液,按照步驟2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行洗脫,記錄譜圖得到芪葛顆粒hplc標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜,見圖1。
3.4方法學(xué)考察
3.4.1精密度試驗(yàn)取同一供試品,連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄色譜圖,以大豆苷為參照峰,計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積,結(jié)果各峰相對(duì)保留時(shí)間的rsd均<0.1%;相對(duì)峰面積的rsd均<2.0%;采用中藥色譜指紋圖譜相似性評(píng)價(jià)軟件進(jìn)行處理,相似度均大于0.99,結(jié)果見圖2,表明儀器精密度良好。
3.4.2重現(xiàn)性試驗(yàn)取同一批號(hào)芪葛顆粒樣品,平行制備6份供試品溶液,進(jìn)行測(cè)定,記錄色譜圖,以大豆苷為參照峰,計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積,結(jié)果各峰相對(duì)保留時(shí)間的rsd均<0.5%;相對(duì)峰面積的rsd均<3.5%;采用中藥色譜指紋圖譜相似性評(píng)價(jià)軟件進(jìn)行處理,相似度均大于0.99,結(jié)果見圖3,說明方法重復(fù)性較好。
3.4.3穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一供試品,分別在0,2,4,8,12,24,48h進(jìn)樣,記錄色譜圖,以大豆苷為參照峰,計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積,結(jié)果各峰相對(duì)保留時(shí)間的rsd均<0.5%;相對(duì)峰面積的rsd均<3.0%;采用中藥色譜指紋圖譜相似性評(píng)價(jià)軟件進(jìn)行處理,相似度均大于0.99,結(jié)果見圖4,表明供試品溶液在48h內(nèi)保持穩(wěn)定。
3.5指紋圖譜的建立及特征峰的標(biāo)定
3.5.1共有峰的確定
通過比較10批芪葛顆粒的色譜圖,確定22個(gè)共有峰,通過對(duì)照品的比對(duì),其中3號(hào)峰為3’-羥基葛根素、5號(hào)峰為葛根素、9號(hào)峰為大豆苷、12號(hào)峰為毛蕊異黃酮葡萄糖苷、13號(hào)峰為染料木苷、15號(hào)峰為橙皮苷、17號(hào)峰為大豆苷元、18號(hào)峰為毛蕊異黃酮、19號(hào)峰為染料木素、20號(hào)峰為芒柄花素、21號(hào)峰為川陳皮素、22號(hào)峰為桔皮素。以9號(hào)峰大豆苷為參照峰,計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積,結(jié)果見圖5、圖6、表1-1、表1-2、表2-1、表2-2。
表1-110批芪葛顆粒指紋圖譜共有峰相對(duì)保留時(shí)間
表1-210批芪葛顆粒指紋圖譜共有峰相對(duì)保留時(shí)間(續(xù)表)
表2-110批芪葛顆粒指紋圖譜共有峰相對(duì)峰面積
表2-210批芪葛顆粒指紋圖譜共有峰相對(duì)峰面積(續(xù)表)
3.5.2.指紋圖譜的相似度評(píng)價(jià)
應(yīng)用國家藥典委員會(huì)頒布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)研究(2004a)”對(duì)10批芪葛顆粒進(jìn)行評(píng)價(jià)。本發(fā)明專利中的各共有峰與對(duì)照指紋圖譜相對(duì)比相似度均大于0.90,說明10批指紋圖譜的色譜峰整體上基本一致。結(jié)果見圖5,表3。
表310批芪葛顆粒的相似度
4.芪葛顆粒hplc指紋圖譜成分來源分析
通過與處方中單味藥材制備的樣品圖譜比較,結(jié)果顯示芪葛顆粒hplc指紋圖譜中12、18、20號(hào)峰來源于黃芪,1、2、3、5、7、8、9、13、14、16、17、19、20號(hào)峰來源于葛根,15、21、22號(hào)峰來源于陳皮,結(jié)果見圖7。
5.指紋圖譜技術(shù)參數(shù)的確定
上述試驗(yàn)結(jié)果表明,以對(duì)照指紋圖譜為參照計(jì)算相似度,10批芪葛顆粒hplc指紋圖譜相似度均在0.90以上,說明該測(cè)定方法穩(wěn)定可靠,指紋圖譜相對(duì)穩(wěn)定,因此暫定芪葛顆粒hplc指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)為:供試品圖譜應(yīng)與對(duì)照指紋圖譜一致,按中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng),供試品指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜經(jīng)相似度計(jì)算,相似度不得低于0.90。
綜上所述,本發(fā)明建立的芪葛顆粒hplc指紋圖譜的檢測(cè)方法,以大豆苷為參照峰,建立了一種芪葛顆粒hplc指紋圖譜,標(biāo)定了22個(gè)共有峰。采用標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)的方法,對(duì)芪葛顆粒hplc指紋圖譜共有峰進(jìn)行了分析研究,鑒定了3號(hào)峰(3’-羥基葛根素)、5號(hào)峰(葛根素)、9號(hào)峰(大豆苷)、12號(hào)峰(毛蕊異黃酮葡萄糖苷)、13號(hào)峰(染料木苷)、15號(hào)峰(橙皮苷)、17號(hào)峰(大豆苷元)、18號(hào)峰(毛蕊異黃酮)、19號(hào)峰(染料木素)、20號(hào)峰(芒柄花素)、21號(hào)峰(川陳皮素)、22號(hào)峰(桔皮素)12個(gè)共有峰,進(jìn)一步闡明了芪葛顆粒的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)。