本發(fā)明涉及蜂蜜產(chǎn)地鑒別技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種篩選用于鑒別蜂蜜產(chǎn)地的特征標(biāo)志物的方法，還涉及利用該特征標(biāo)志物進(jìn)行蜂蜜產(chǎn)地鑒別的方法。尤其涉及一種篩選用于鑒別洋槐蜜產(chǎn)地的特征標(biāo)志物的方法，以及洋槐蜜產(chǎn)地的鑒別方法。

背景技術(shù)：

我國(guó)是世界養(yǎng)蜂大國(guó)，蜂蜜年產(chǎn)量超過(guò)45萬(wàn)噸，是蜂蜜生產(chǎn)、消費(fèi)和出口大國(guó)。研究表明，蜂蜜含有近百余種內(nèi)源性成分，葡萄糖和果糖占總成分含量的70％以上，其次是水分、蔗糖、礦物質(zhì)、維生素、蛋白質(zhì)、氨基酸等。近幾年，消費(fèi)者對(duì)蜂蜜的興趣與日俱增，這主要是因?yàn)榉涿塾幸娼】担热缈咕?、抗炎、抗突變、抗腫瘤、抗氧化活性。蜂蜜成分與其植物源和地理源密切相關(guān)，因?yàn)榉涿鄢煞秩菀资艿缴a(chǎn)地區(qū)土壤和氣候特性的影響。相比于雜花蜜，單一植物源和地理源的蜂蜜能夠提供一種獨(dú)特的口味和質(zhì)量屬性而具有更高的價(jià)值。在銷(xiāo)售環(huán)節(jié)中，消費(fèi)者也非常關(guān)注具有特定產(chǎn)地真實(shí)標(biāo)簽的蜂蜜，所以蜂蜜的質(zhì)量和價(jià)格取決于其植物源和地理源。因此，對(duì)不同產(chǎn)地的蜂蜜進(jìn)行鑒別對(duì)消費(fèi)者具有重要意義。

已有的鑒別不同植物源和產(chǎn)地的蜂蜜技術(shù)包括孢粉學(xué)、指紋識(shí)別、化學(xué)統(tǒng)計(jì)分析和標(biāo)記物識(shí)別。孢粉學(xué)主要通過(guò)顯微鏡觀察花粉的大小、形狀和顏色，但是這種方法非常難掌握并且容易得出不同的花粉具有相同的花粉特征這種錯(cuò)誤的結(jié)果，這主要是由于該方法極易受檢驗(yàn)人員主觀因素影響而導(dǎo)致分析偏差?；谀軌蚍从巢煌瘜W(xué)成分特征輪廓的色譜和指紋識(shí)別技術(shù)已經(jīng)被認(rèn)為是一種可靠的蜂蜜樣品質(zhì)量控制技術(shù)。但是獲得可靠的指紋圖譜比較困難，因?yàn)樵诓煌膶?shí)驗(yàn)室和不同批次樣品之間，實(shí)驗(yàn)條件難以完全重現(xiàn)，大量低含量化合物的基線、響應(yīng)值和保留時(shí)間就會(huì)導(dǎo)致偏差。并且盡管指紋識(shí)別技術(shù)全面展示了樣品信息，并沒(méi)有對(duì)從數(shù)據(jù)中獲得的信息進(jìn)行深入挖掘。化學(xué)統(tǒng)計(jì)計(jì)量學(xué)在分析龐大的數(shù)據(jù)特別是復(fù)雜數(shù)據(jù)的大樣本集，分析植物源和地理源，并建立可靠模型方面體現(xiàn)出巨大優(yōu)勢(shì)。但是，這種方法需要大量的樣本建立一個(gè)可靠的模型，而確定樣品真實(shí)性又依賴于所開(kāi)發(fā)的模型，實(shí)際應(yīng)用十分困難。

特征標(biāo)記物可以簡(jiǎn)單方便地對(duì)蜂蜜進(jìn)行溯源分類(lèi)?，F(xiàn)有的蜂蜜鑒別方法均基于在初步假設(shè)某一類(lèi)化合物的基礎(chǔ)上，將某一個(gè)目標(biāo)代謝物在作為潛在的標(biāo)志物。如基于多種儀器技術(shù)將酮類(lèi)化合物、酚類(lèi)化合物；碳水化合物、礦物質(zhì)和微量元素、揮發(fā)性化合物、有機(jī)酸、氨基酸等內(nèi)源性化合物，以及脫落酸、橙皮素、鄰氨基苯甲酸甲酯和3-氨基苯乙酮等特殊化合物作為標(biāo)記物，來(lái)確定蜂蜜的植物源和地理源。但是，蜂蜜是一種由蜜蜂生產(chǎn)的天然的并且組分極其復(fù)雜的產(chǎn)品，根據(jù)植物源和地理源不同而具有多種大量的內(nèi)源性化合物。因此，根據(jù)事先主觀假設(shè)的一類(lèi)化合物尋找出某一種可靠的標(biāo)志物鑒別其植物源和地理源是十分有限也不科學(xué)的。

然而采用非靶向比較代謝組學(xué)探索特定的標(biāo)記物可以解決這個(gè)問(wèn)題。非靶向代謝組學(xué)通過(guò)分析數(shù)據(jù)集中的全部信息盡可能多的獲得一個(gè)復(fù)雜樣品中的代謝產(chǎn)物。利用與庫(kù)匹配的多元統(tǒng)計(jì)技術(shù)，非靶向代謝組學(xué)已經(jīng)廣泛應(yīng)用通過(guò)來(lái)自分析不同條件下的不同樣品的大量數(shù)據(jù)來(lái)確定標(biāo)志物方面。核磁共振技術(shù)和高分辨質(zhì)譜技術(shù)在非靶向代謝領(lǐng)域作為主要的技術(shù)手段，通過(guò)評(píng)估代謝水平的變化來(lái)反映基質(zhì)本身的變化和環(huán)境影響。核磁共振的主要優(yōu)勢(shì)在于無(wú)損樣品既可獲得大量數(shù)據(jù)。最近，液相色譜或氣相色譜于質(zhì)譜聯(lián)用在非靶向分析確定代謝物中得到廣泛應(yīng)用，因?yàn)樵摷夹g(shù)能夠在前端的分離系統(tǒng)中將各種化學(xué)組分在復(fù)雜的混合物中分離出來(lái)，并在后端的質(zhì)譜系統(tǒng)中獲得準(zhǔn)確的質(zhì)量信息。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

以往蜜蜂產(chǎn)地的鑒定方法都集中于某一類(lèi)物質(zhì)(如黃酮類(lèi)、酚酸類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)等)的分析，即通過(guò)購(gòu)買(mǎi)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，然后對(duì)樣品中該物質(zhì)進(jìn)行定量分析，依據(jù)該物質(zhì)在不同產(chǎn)地蜂蜜樣品中的含量是否存在差異確定該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)能否作為特征標(biāo)志物，這被稱為靶標(biāo)技術(shù)。靶標(biāo)技術(shù)尋找特征標(biāo)志物的范圍十分的有限，不能探尋出真正的特征物質(zhì)。本發(fā)明提供的蜂蜜產(chǎn)地鑒別方法是基于非靶標(biāo)技術(shù)，即從蜂蜜樣品的全譜圖中搜尋特征標(biāo)志物，特征標(biāo)志物的確定更加客觀精準(zhǔn)，篩選得到的特征標(biāo)志物更具有說(shuō)服力。同樣地，利用該特征標(biāo)志物對(duì)不同產(chǎn)地的蜂蜜進(jìn)行鑒別，鑒別結(jié)果也更加精準(zhǔn)。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案之一是：一種篩選用于鑒別蜂蜜產(chǎn)地的特征標(biāo)志物的方法，包括如下步驟：

(1)取來(lái)自兩個(gè)已知不同產(chǎn)地的相同蜜源蜂蜜樣品，相同產(chǎn)地的若干蜂蜜樣品為一組；以純水為溶劑，分別對(duì)每組中的蜂蜜樣品進(jìn)行溶解，得多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品，備用；

(2)取步驟(1)制備得到的所有標(biāo)準(zhǔn)樣品，分別進(jìn)行高效液相色譜-四級(jí)桿/靜電場(chǎng)軌道肼高分辨率質(zhì)譜分析，得到每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)；對(duì)所有的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行背景扣除、色譜峰提取和峰對(duì)齊，得到每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品的總離子流色譜圖，用于后續(xù)分析；

(3)采用t-test手段對(duì)每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品的總離子流色譜圖的質(zhì)核比數(shù)據(jù)進(jìn)行檢測(cè)，取檢測(cè)結(jié)果中P-Value＜0.05的組分進(jìn)行分析，得潛在特征標(biāo)志物；

(4)繪制每組樣品的火山圖進(jìn)一步從步驟(3)中所述潛在特征標(biāo)志物中篩選特征標(biāo)志物；

(5)繪制每組樣品的變量重要性投影圖，取最大VIP值對(duì)應(yīng)的物質(zhì)即為可用于鑒別蜂蜜產(chǎn)地的特征標(biāo)志物，繪圖時(shí)，VIP值的設(shè)定以確保變量重要性投影圖中顯示的物質(zhì)包括步驟(4)篩選得到的潛在特征標(biāo)志物為準(zhǔn)。

優(yōu)選地，為了使得蜂蜜樣品更具代表性，步驟(1)中，所述蜂蜜樣品是通過(guò)如下方法得到的：從每個(gè)已知產(chǎn)地的不同地區(qū)采集相同蜜源植物的蜂蜜樣品20-60個(gè)，每3-6個(gè)采集到的蜂蜜樣品混合均勻成為一個(gè)樣品，即得。

進(jìn)一步優(yōu)選地，本發(fā)明每組中的蜂蜜樣品數(shù)量為3-8個(gè)，最優(yōu)選為5個(gè)。

優(yōu)選地，步驟(1)中，所述標(biāo)準(zhǔn)樣品通過(guò)如下方法得到：按照1：5(g：mL)的固液比，分別向蜂蜜樣品中加入純水，渦旋混均，離心除去顆粒性雜質(zhì)，取上清液，即得。

進(jìn)一步優(yōu)選地，所述離心條件為：采用8000-12000rpm轉(zhuǎn)速離心8-12min。

本發(fā)明利用環(huán)境友好的純水溶解蜂蜜，對(duì)環(huán)境無(wú)任何污染作用；此外無(wú)任何復(fù)雜的樣品前處理過(guò)程，保證了化合物信息的完整性，減少由于前處理過(guò)程而導(dǎo)致的化合物信息丟失，進(jìn)而導(dǎo)致潛在的特征標(biāo)志物信息丟失。

優(yōu)選地，步驟(2)中，所述高效液相色譜采用C18色譜柱，以0.05-0.15％的甲酸水溶液為流動(dòng)A相，以0.05-0.15％的甲酸乙腈溶液為流動(dòng)B相，按照體積比為(5～95):(95～5)的A和B的混合液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。本發(fā)明的流動(dòng)相水相中加入甲酸，甲酸的存在為待測(cè)物提供酸性環(huán)境，可提高離子化效率。

進(jìn)一步優(yōu)選地，所述梯度洗脫為：0-2.0min,5％B；2.0-7.0min,5％-30％B；7.0-13.0min,30％-95％B；13.0-18.0min,95％B；18.0-18.1min,95％-5％B；18.1-20.0min,5％B。

優(yōu)選地，步驟(2)中，所述四級(jí)桿/靜電場(chǎng)軌道肼高分辨率質(zhì)譜的條件選自如下條件①～⑩中的至少一個(gè)：

①HESI-II正模式和負(fù)模式的噴霧電壓分別為3500v和3200v；

②鞘流氣，輔助氣和吹掃器壓力分別為35arb,10arb和0arb；

③S-lens RF為50v；

④霧化器溫度為350℃；

⑤離子傳輸管溫度為320℃；

⑥全掃描質(zhì)量軸范圍為80–1200Da；

⑦一級(jí)質(zhì)譜和二極質(zhì)譜在m/z＝200處的分辨率分別為70000FWHM和17500FWHM；

⑧自動(dòng)增益控制為106個(gè)電荷；

⑨最大進(jìn)針時(shí)間為50毫秒；

⑩所有提取的質(zhì)量數(shù)窗口設(shè)置為4.0ppm。

上述條件①～⑩中的各個(gè)參數(shù)為本發(fā)明較佳的參數(shù)設(shè)定，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，上述條件①～⑩中的各個(gè)參數(shù)均可在±10％范圍內(nèi)浮動(dòng)，不會(huì)影響最終的測(cè)定結(jié)果。例如，具體應(yīng)用時(shí)，HESI-II正模式的噴霧電壓可在3150v～3850v范圍內(nèi)選取。

進(jìn)一步優(yōu)選地，所述四級(jí)桿/靜電場(chǎng)軌道肼高分辨率質(zhì)譜的條件包括上述①～⑩的全部。

本發(fā)明所使用的超高效液相色譜-四級(jí)桿/靜電場(chǎng)軌道肼高分辨率質(zhì)譜是以超高液相色譜作為分離系統(tǒng)，靜電場(chǎng)軌道肼質(zhì)譜作為檢測(cè)系統(tǒng)，經(jīng)簡(jiǎn)單處理后的樣品在液相色譜和質(zhì)譜部分經(jīng)過(guò)分離和離子化，經(jīng)由檢測(cè)器得到質(zhì)譜圖。該質(zhì)譜的一級(jí)質(zhì)譜和二極質(zhì)譜在m/z＝200處的分辨率分別為70000和17500，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他高分辨質(zhì)譜，所以結(jié)合了超高液相色譜對(duì)復(fù)雜樣品的高分離能力和高分辨質(zhì)譜的高選擇性，高靈敏度及能夠提供相對(duì)分子量和結(jié)構(gòu)信息的優(yōu)點(diǎn)。

四級(jí)桿/靜電場(chǎng)軌道肼高分辨率質(zhì)譜儀在對(duì)特征標(biāo)志物及其碎片結(jié)構(gòu)解析過(guò)程中所有離子的偏差均小于1.0ppm，這是所有質(zhì)譜都難以達(dá)到的高準(zhǔn)確度，所以對(duì)化合物的結(jié)構(gòu)信息解析的也更準(zhǔn)確。

優(yōu)選地，步驟(4)中，所述火山圖以(log₂^FC)為橫坐標(biāo)，(-log₁₀^P-value)為縱坐標(biāo)，并取FC>10且P-value<0.01的數(shù)值作圖。

本發(fā)明首先利用t-test初步篩選出特征標(biāo)志物，然后在這些特征標(biāo)志物范圍內(nèi)利用火山圖和VIP值分析差異顯著的特征標(biāo)志物，以多重手段保證特征標(biāo)志物的真實(shí)性。尤其是，在采用變量重要性投影圖分析時(shí)，設(shè)定的VIP值要求最終顯示的化合物中應(yīng)包含火山圖分析中篩選得到的特征標(biāo)志物，這樣更具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果更加精準(zhǔn)。

優(yōu)選地，所述方法還包括采用主成分分析方法對(duì)每組標(biāo)準(zhǔn)樣品的總離子流色譜圖的質(zhì)核比數(shù)據(jù)進(jìn)行分析以初步判斷是否存在特征標(biāo)志物的步驟；

若每組的數(shù)據(jù)聚集在各自的95％置信限橢圓圖內(nèi)，且兩組數(shù)據(jù)能夠完全分離，則初步判斷兩個(gè)產(chǎn)地的蜂蜜存在區(qū)分二者的特征標(biāo)志物；

若每組的數(shù)據(jù)不能聚集在各自的95％置信限橢圓圖內(nèi)，和/或，兩組數(shù)據(jù)不能夠完全分離，則初步判斷兩個(gè)產(chǎn)地的蜂蜜不存在區(qū)分二者的特征標(biāo)志物或很難篩選可以區(qū)分二者的特征標(biāo)志物。

采用主成分分析法有助于快速判斷不同產(chǎn)地的相同蜜源蜂蜜是否存在特征標(biāo)志物，使得特征標(biāo)志物的篩選更加快捷。

采用上述技術(shù)方案一的方法可實(shí)現(xiàn)相同蜜源兩個(gè)不同產(chǎn)地蜂蜜的特征標(biāo)志物的確定。其中，所述相同蜜源指的是荔枝蜜、洋槐蜜、棗花蜜、槐花蜜等蜂蜜品種中的任意一種。

在一種具體的實(shí)施方式中，上述方法可用于篩選用于鑒別陜西洋槐蜜和遼寧洋槐蜜的特征標(biāo)志物。其具體結(jié)果為：經(jīng)主成分分析，結(jié)果顯示遼寧省和陜西省洋槐蜜可以得到完全分離，證實(shí)了遼寧省和陜西省洋槐蜜由于產(chǎn)地的不同引起了蜂蜜中明顯的代謝物變化。經(jīng)t-test檢測(cè)，正模式下獲得了3個(gè)潛在的特征標(biāo)志物，分別為DL-絲氨酸，L(+)-精氨酸和異櫻花素(Isosakuranetin)，陜西省洋槐蜜中這三種物質(zhì)的含量明顯低于遼寧省洋槐蜜。經(jīng)火山圖分析，進(jìn)一步證實(shí)了遼寧省洋槐蜜中含有這3個(gè)特征標(biāo)志物；最終，變量重要性投影圖分析時(shí)，設(shè)定VIP值＞2.0對(duì)代謝物進(jìn)行排序，結(jié)果顯示正模式下異櫻花素可作為鑒別遼寧省洋槐蜜和陜西省洋槐蜜的特征標(biāo)志物。

本發(fā)明的技術(shù)方案之二是：上述任意一種篩選用于鑒別蜂蜜產(chǎn)地的特征標(biāo)志物的方法在相同蜜源蜂蜜產(chǎn)地鑒別中的應(yīng)用。

本發(fā)明所述的特征標(biāo)志物的篩選方法是從大量的數(shù)據(jù)中篩查和識(shí)別標(biāo)志物，特征標(biāo)志物的確定更加客觀精準(zhǔn)，因此，采用該方法確定得到的特征標(biāo)志物進(jìn)行相同蜜源蜂蜜產(chǎn)地的鑒別也更加的準(zhǔn)確。

本發(fā)明的技術(shù)方案之三是：一種洋槐蜜產(chǎn)地的鑒別方法，該方法以異櫻花素作為鑒別陜西洋槐蜜和遼寧洋槐蜜的特征標(biāo)志物。

優(yōu)選地，利用異櫻花素鑒別陜西洋槐蜜和遼寧洋槐蜜時(shí)，包括如下步驟：

(1)取未知產(chǎn)地的洋槐蜜樣品，向其中加入純水，經(jīng)渦旋、離心處理后，取上清液，得待測(cè)樣品；

(2)采用高效液相色譜-四級(jí)桿/靜電場(chǎng)軌道肼高分辨率質(zhì)譜分析所述待測(cè)樣品，得到質(zhì)譜圖；

(3)當(dāng)所述質(zhì)譜圖中含有異櫻花素的所有碎片離子峰時(shí)，判定為遼寧產(chǎn)洋槐蜜；當(dāng)所述質(zhì)譜圖中不含有異櫻花素的碎片離子峰或只含有異櫻花素的部分碎片離子峰時(shí)，判定不為遼寧洋槐蜜；

所述異櫻花素的碎片離子峰為91.05423±1ppm，103.05423±1ppm，167.03389±1ppm，213.09101±1ppm，226.06245±1ppm，241.08592±1ppm，269.08084±1ppm。

優(yōu)選地，所述待測(cè)樣品采用如下方法制備：取未知產(chǎn)地的洋槐蜜樣品，按照1：5(g：mL)的固液比，分別向蜂蜜樣品中加入純水，渦旋混均，離心除去顆粒性雜質(zhì)，取上清液，即得。

在一種具體的實(shí)施方式中，所述待測(cè)樣品的制備方法為：稱取未知產(chǎn)地的洋槐蜜樣品1.0±0.1g置于10mL具塞離心管中，加入5mL純水，渦旋5min混勻，10000rpm離心10min沉淀顆粒雜質(zhì)，取上清液，即得。

優(yōu)選地，所述高效液相色譜采用C18色譜柱，以0.05-0.15％的甲酸水溶液為流動(dòng)A相，以0.05-0.15％的甲酸乙腈溶液為流動(dòng)B相，按照體積比為(5～95):(95～5)的A和B的混合液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。

進(jìn)一步優(yōu)選地，所述梯度洗脫為：0-2.0min,5％B；2.0-7.0min,5％-30％B；7.0-13.0min,30％-95％B；13.0-18.0min,95％B；18.0-18.1min,95％-5％B；18.1-20.0min,5％B。

其中，柱溫、流速和進(jìn)樣量可采用本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)手段，例如柱溫可設(shè)定為35-45℃，流速可設(shè)定為0.2-0.4mL/min，進(jìn)樣量可設(shè)定為4-6μL。

在一種具體的實(shí)施方式中，所述高效液相色譜的條件為：

流動(dòng)相：0.1％的甲酸水和0.1％的甲酸乙腈溶液；

洗脫條件：0-2.0min,5％B；2.0-7.0min,5％-30％B；7.0-13.0min,30％-95％B；13.0-18.0min,95％B；18.0-18.1min,95％-5％B；18.1-20.0min,5％B；

色譜柱：Thermo Scientific Hypersil GOLD C-18column(2.1mm×100mm,1.9μm)色譜柱；

柱溫為40℃；流速為0.3mL/min；進(jìn)樣量為5.0μL。

優(yōu)選地，所述四級(jí)桿/靜電場(chǎng)軌道肼高分辨率質(zhì)譜的條件選自如下條件①～⑩中的至少一個(gè)：

①HESI-II正模式和負(fù)模式的噴霧電壓分別為3500v和3200v；

②鞘流氣，輔助氣和吹掃器壓力分別為35arb,10arb和0arb；

③S-lens RF為50v；

④霧化器溫度為350℃；

⑤離子傳輸管溫度為320℃；

⑥全掃描質(zhì)量軸范圍為80–1200Da；

⑦一級(jí)質(zhì)譜和二極質(zhì)譜在m/z＝200處的分辨率分別為70000FWHM和17500FWHM；

⑧自動(dòng)增益控制為106個(gè)電荷；

⑨最大進(jìn)針時(shí)間為50毫秒；

⑩所有提取的質(zhì)量數(shù)窗口設(shè)置為4.0ppm。

上述條件①～⑩中的各個(gè)參數(shù)為本發(fā)明較佳的參數(shù)設(shè)定，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，上述條件①～⑩中的各個(gè)參數(shù)均可在±10％范圍內(nèi)浮動(dòng)，不會(huì)影響最終的測(cè)定結(jié)果。例如，具體應(yīng)用時(shí)，HESI-II正模式的噴霧電壓可在3150v～3850v范圍內(nèi)選取。

在符合本領(lǐng)域常識(shí)的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可以相互組合，即得本發(fā)明各較佳實(shí)例。

本發(fā)明涉及到的原料和試劑均可市購(gòu)獲得。

本發(fā)明取得了如下積極效果：

(1)該特征標(biāo)志物的篩選方法的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單，快速，準(zhǔn)確，穩(wěn)定，并且是首次以基于軌道肼質(zhì)譜技術(shù)的非靶標(biāo)代謝組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于蜂蜜的品種鑒別；

(2)本發(fā)明所述的方法對(duì)于加強(qiáng)蜂蜜種類(lèi)鑒別的研究，探索蜂蜜溯源信息，提高我國(guó)蜂蜜質(zhì)量，保證消費(fèi)者的健康等具有重要的意義。

附圖說(shuō)明

圖1是實(shí)施例1中遼寧省洋槐蜜(上圖)和陜西省洋槐蜜(下圖)的TIC圖；

圖2是遼寧省洋槐蜜(左側(cè)六邊形)和陜西省洋槐蜜(右側(cè)菱形)的PCA圖；

圖3中A圖為正模式下遼寧省洋槐蜜潛在標(biāo)志物火山圖；B圖為正模式下遼寧省洋槐蜜VIP＞2.0條件下的特征標(biāo)志物；C圖為負(fù)模式下陜西省洋槐蜜潛在標(biāo)志物火山圖；D圖為正模式下陜西省洋槐蜜VIP＞2.0條件下的特征標(biāo)志物。

圖4為特征標(biāo)志物異櫻花素的結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中涉及的操作如無(wú)特殊說(shuō)明，均為本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)操作。

實(shí)施例1

一種篩選用于鑒別洋槐蜜產(chǎn)地的特征標(biāo)志物的方法，其中，所述產(chǎn)地指的是陜西和遼寧，所述篩選的方法包括如下步驟：

(1)從我國(guó)楊槐蜂蜜主產(chǎn)區(qū)遼寧和陜西共采集60個(gè)蜂蜜樣品。其中遼寧省27個(gè)樣品、陜西省33個(gè)樣品。樣品貯藏在20℃通風(fēng)良好避光的樣品貯藏室內(nèi)。為了提高蜂蜜樣品的代表性，相同產(chǎn)地相同蜜源植物的3-6個(gè)蜂蜜樣品隨機(jī)均勻混合成一個(gè)樣品，最終使每個(gè)產(chǎn)地具有相同植物源的蜂蜜樣品為5個(gè)，每個(gè)產(chǎn)地的5個(gè)蜂蜜樣品為一組，共兩組；

(2)稱取每個(gè)蜂蜜樣品1.0±0.1g分別置于10mL具塞離心管中，加入5mL純水，渦旋5min混勻，10000rpm離心10min沉淀顆粒性雜質(zhì)，取上清液，即為標(biāo)準(zhǔn)樣品，備用；

(3)取步驟(2)制備得到的所有標(biāo)準(zhǔn)樣品，分別進(jìn)行高效液相色譜-四級(jí)桿/靜電場(chǎng)軌道肼高分辨率質(zhì)譜分析，分析條件為：

高效液相色譜：

流動(dòng)相：0.1％的甲酸水(A)和0.1％的甲酸乙腈溶液(B)；

洗脫條件：0–2.0min,5％B；2.0–7.0min,5％–30％B；7.0–13.0min,30％–95％B；13.0–18.0min,95％B；18.0–18.1min,95％-5％B；18.1-20.0min,5％B.；

色譜柱：Thermo Scientific Hypersil GOLD C-18column(2.1mm×100mm,1.9μm)色譜柱。

柱溫為40℃；流速為0.3mL/min；進(jìn)樣量為5.0μL；

質(zhì)譜條件：

HESI-II噴霧電壓分別為3500v(正模式)和3200v(負(fù)模式)；鞘流氣,輔助氣和吹掃器壓力分別為35arb,10arb,和0arb；S-lens RF為50v；霧化器溫度350℃；離子傳輸管溫度320℃.全掃描質(zhì)量軸范圍為80–1200Da。一級(jí)質(zhì)譜和二極質(zhì)譜在m/z＝200處的分辨率分別為70000FWHM和17500FWHM。自動(dòng)增益控制為106個(gè)電荷，最大進(jìn)針時(shí)間為50毫秒。所有提取的質(zhì)量數(shù)窗口設(shè)置為4.0ppm。

(4)采用超高效液相色譜-四級(jí)桿/靜電場(chǎng)軌道肼高分辨率質(zhì)譜儀器自帶SIEVE軟件對(duì)遼寧省和陜西省洋槐蜜兩組蜂蜜樣品的數(shù)據(jù)進(jìn)行背景扣除、色譜峰提取和峰對(duì)齊，得到各個(gè)蜂蜜樣品的總離子流色譜圖(TIC)圖譜，具體請(qǐng)參考圖1。

(5)TIC數(shù)據(jù)導(dǎo)出后利用主成分分析(PCA)對(duì)各個(gè)蜂蜜樣品的總離子流色譜圖數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示(具體請(qǐng)參考圖2)每組的數(shù)據(jù)聚集在各自的95％置信限橢圓圖內(nèi)，且兩組數(shù)據(jù)能夠完全分離，說(shuō)明遼寧省和陜西省洋槐蜜可以得到完全的分離，也證實(shí)了遼寧省和陜西省洋槐蜜由于產(chǎn)地的影響引起了蜂蜜中明顯的代謝物變化。

(6)遼寧省和陜西省洋槐蜜相比，第一步：采用t-test手段對(duì)每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品的總離子流色譜圖的質(zhì)核比數(shù)據(jù)進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)t-test中P-Value＜0.05具有顯著差異組分進(jìn)行分析，正模式下獲得共獲得了3個(gè)潛在的特征標(biāo)志物，包括DL-絲氨酸、L(+)-精氨酸和Isosakuranetin，而陜西省洋槐蜜中這三種物質(zhì)含量明顯低于遼寧省洋槐蜜；第二步：以(log₂^FC)為橫坐標(biāo)，(-log₁₀^P-value)為縱坐標(biāo)，并取FC>10且P-value<0.01的數(shù)值繪制每組樣品中各個(gè)代謝產(chǎn)物的火山圖，結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了遼寧省洋槐蜜中包含3個(gè)潛在的特征標(biāo)志物，分別為DL-絲氨酸、L(+)-精氨酸和Isosakuranetin；第三步：通過(guò)設(shè)定變量重要性投影圖中VIP>2.0和1.80對(duì)代謝物進(jìn)行排序(具體請(qǐng)參考圖3)，結(jié)果顯示正模式下VIP數(shù)值最大的為isosakuranetin(異櫻花素)，即異櫻花素可作為遼寧省洋槐蜜區(qū)別陜西省洋槐蜜的特征標(biāo)志物(異櫻花素的結(jié)構(gòu)鑒定請(qǐng)參考圖4)。

實(shí)施例2

一種篩選用于鑒別洋槐蜜產(chǎn)地的特征標(biāo)志物的方法，其中，所述產(chǎn)地指的是陜西和遼寧，所述篩選的方法同實(shí)施例1，區(qū)別僅在于樣品處理方法不同，分析條件不同，該實(shí)施例的條件如下所示：

(1)稱取蜂蜜每份2.0±0.1g置于10mL具塞離心管中，加入8mL純水，渦旋8min混勻，8000rpm離心10分鐘沉淀顆粒性雜質(zhì)，取上清液，即得；

(2)高效液相色譜：

流動(dòng)相：0.1％的甲酸水(A)和0.1％的甲酸乙腈溶液(B)；

洗脫條件：0–2.0min,5％B；2.0–7.0min,5％–30％B；7.0–13.0min,30％–95％B；13.0–18.0min,95％B；18.0–18.1min,95％-5％B；18.1-20.0min,5％B.；

色譜柱：Thermo Scientific Hypersil GOLD C-18column(2.1mm×100mm,1.9μm)色譜柱。

柱溫為40℃；流速為0.4mL/min；進(jìn)樣量為3.0μL。

質(zhì)譜條件：

HESI-II噴霧電壓分別為3500v(正模式)和3200v(負(fù)模式)；鞘流氣,輔助氣和吹掃器壓力分別為35arb,10arb,和0arb；S-lens RF為50v；霧化器溫度350℃；離子傳輸管溫度320℃.全掃描質(zhì)量軸范圍為80–1200Da。一級(jí)質(zhì)譜和二極質(zhì)譜在m/z＝200處的分辨率分別為70000FWHM和17500FWHM。自動(dòng)增益控制為106個(gè)電荷，最大進(jìn)針時(shí)間為50毫秒。所有提取的質(zhì)量數(shù)窗口設(shè)置為4.0ppm。

該實(shí)施例的結(jié)果顯示：正模式下isosakuranetin(異櫻花素)可作為遼寧省洋槐蜜區(qū)別陜西省洋槐蜜的特征標(biāo)志物。

實(shí)施例3

一種篩選用于鑒別洋槐蜜產(chǎn)地的特征標(biāo)志物的方法，其中，所述產(chǎn)地指的是陜西和遼寧，所述篩選的方法同實(shí)施例1，區(qū)別僅在于樣品處理方法不同，分析條件不同，該實(shí)施例的條件如下所示：

(1)稱取蜂蜜每份3.0±0.1g置于10mL具塞離心管中，加入10mL純水，渦旋10min混勻，9000rpm離心8分鐘沉淀顆粒性雜質(zhì)，取上清液，即得；

(2)高效液相色譜：

流動(dòng)相：0.08％的甲酸水(A)和0.08％的甲酸乙腈溶液(B)；

洗脫條件：0–2.0min,5％B；2.0–7.0min,5％–30％B；7.0–13.0min,30％–95％B；13.0–18.0min,95％B；18.0–18.1min,95％-5％B；18.1-20.0min,5％B.；

色譜柱：Thermo Scientific Hypersil GOLD C-18column(2.1mm×100mm,1.9μm)色譜柱。

柱溫為30℃；流速為0.2mL/min；進(jìn)樣量為2.0μL；

質(zhì)譜條件：

HESI-II噴霧電壓分別為3500v(正模式)和3200v(負(fù)模式)；鞘流氣,輔助氣和吹掃器壓力分別為35arb,10arb,和0arb；S-lens RF為50v；霧化器溫度350℃；離子傳輸管溫度320℃.全掃描質(zhì)量軸范圍為80–1200Da。一級(jí)質(zhì)譜和二極質(zhì)譜在m/z＝200處的分辨率分別為70000FWHM和17500FWHM。自動(dòng)增益控制為106個(gè)電荷，最大進(jìn)針時(shí)間為50毫秒。所有提取的質(zhì)量數(shù)窗口設(shè)置為4.0ppm。

該實(shí)施例的結(jié)果顯示：正模式下isosakuranetin(異櫻花素)可作為遼寧省洋槐蜜區(qū)別陜西省洋槐蜜的特征標(biāo)志物。

實(shí)施例4

一種洋槐蜜產(chǎn)地的鑒別方法，包括如下步驟：

(1)從市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)產(chǎn)地標(biāo)注為遼寧的洋槐蜜，取該產(chǎn)品1.0±0.1g置于10mL具塞離心管中，加入5mL純水，渦旋5min混勻，10000rpm離心10min沉淀顆粒性雜質(zhì)，取上清液，備用；

(2)取步驟(1)制備得到的樣品，進(jìn)行高效液相色譜-四級(jí)桿/靜電場(chǎng)軌道肼高分辨率質(zhì)譜分析，分析條件為：

高效液相色譜：

流動(dòng)相：0.1％的甲酸水(A)和0.1％的甲酸乙腈溶液(B)；

洗脫條件：0–2.0min,5％B；2.0–7.0min,5％–30％B；7.0–13.0min,30％–95％B；13.0–18.0min,95％B；18.0–18.1min,95％-5％B；18.1-20.0min,5％B.；

色譜柱：Thermo Scientific Hypersil GOLD C-18column(2.1mm×100mm,1.9μm)色譜柱。

柱溫為40℃；流速為0.3mL/min；進(jìn)樣量為5.0μL；

質(zhì)譜條件：

HESI-II噴霧電壓分別為3500v(正模式)和3200v(負(fù)模式)；鞘流氣,輔助氣和吹掃器壓力分別為35arb,10arb,和0arb；S-lens RF為50v；霧化器溫度350℃；離子傳輸管溫度320℃.全掃描質(zhì)量軸范圍為80–1200Da。一級(jí)質(zhì)譜和二極質(zhì)譜在m/z＝200處的分辨率分別為70000FWHM和17500FWHM。自動(dòng)增益控制為106個(gè)電荷，最大進(jìn)針時(shí)間為50毫秒。所有提取的質(zhì)量數(shù)窗口設(shè)置為4.0ppm，得到高分辨質(zhì)譜圖；

(3)采用超高效液相色譜-四級(jí)桿/靜電場(chǎng)軌道肼高分辨率質(zhì)譜儀器自帶SIEVE軟件提取特征標(biāo)志物的質(zhì)譜信息；

(4)結(jié)果顯示：該待測(cè)樣品的質(zhì)譜信息中包括異櫻花素的所有碎片離子峰，判斷該產(chǎn)品確為遼寧省洋槐蜜。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明、具體實(shí)施方式及試驗(yàn)，對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。