本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種抗FITC熒光單克隆抗體及其免疫層析試紙。

背景技術(shù)：

異硫氰酸熒光素(FITC)常被用作熒光探針來標(biāo)記蛋白或核酸分子，因此可以通過免疫學(xué)檢測(cè)方法利用抗FITC的單克隆抗體來檢測(cè)由FITC標(biāo)記的蛋白質(zhì)和核酸分子（即FITC-抗FITC系統(tǒng)）。而FITC作為一種小分子半抗原，不具有免疫原性，因此FITC只能與大分子載體蛋白偶聯(lián)后才能誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生免疫應(yīng)答，再利用雜交瘤技術(shù)獲得既能無限增殖又能分泌抗FITC單抗的雜交瘤細(xì)胞株，最后通過體內(nèi)誘生腹水的方法獲得大量的抗FITC單克隆抗體。

由于FITC性質(zhì)穩(wěn)定并且1個(gè)抗FITC抗體上可同時(shí)結(jié)合3～4個(gè)FITC分子, 因而FITC-抗FITC 系統(tǒng)可有效地提高抗原抗體反應(yīng)的敏感性，所以抗FITC單克隆抗體在免疫檢測(cè)、核酸雜交、免疫斑點(diǎn)技術(shù)以及免疫組化等方面均有較廣闊的應(yīng)用前景。

此外，免疫層析技術(shù)可定性和半定量的檢測(cè)多種生物大分子或小分子物質(zhì)。由于該技術(shù)具有特異、靈敏、簡便、快速、成本低廉等特點(diǎn)，而被廣泛應(yīng)用于疾病診斷、食品安全監(jiān)測(cè)、抗體評(píng)價(jià)、微生物污染、違禁物添加及藥物殘留的檢測(cè)以及環(huán)境監(jiān)測(cè)等多個(gè)領(lǐng)域。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種抗FITC熒光單克隆抗體，以及一種以該單克隆抗體為核心的免疫層析試紙，該試紙能夠快速、特異性地對(duì)FITC熒光探針標(biāo)記的蛋白或核酸分子進(jìn)行檢測(cè)。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

研制一種抗FITC熒光單克隆抗體，包括：

人工完全抗原的合成，動(dòng)物免疫，細(xì)胞融合，陽性雜交瘤細(xì)胞的亞克隆，單克隆抗體的大量制備和純化，以及單克隆抗體的鑒定。

具體步驟為：以半抗原FITC與BSA（牛血清白蛋白）的偶聯(lián)物FITC-BSA作為人工完全抗原免疫BALB/c小鼠，再（通過雜交瘤技術(shù)）篩選出能夠穩(wěn)定分泌抗FITC單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，最后通過體內(nèi)誘生腹水的方法大量制備抗FITC單克隆抗體。

所述BALB/c小鼠的免疫步驟為：將合成的偶聯(lián)物FITC-BSA分別加入弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑乳化制成弗氏完全佐劑免疫原和弗氏不完全佐劑免疫原，通過背部皮下多點(diǎn)注射的方法，用弗氏完全佐劑免疫原免疫8周齡的雌性BALB/c小鼠，共3只，50μg/只；在首次免疫14天和28天后分別用弗氏不完全佐劑免疫原以相同的方法和劑量對(duì)BALB/c小鼠進(jìn)行加強(qiáng)免疫；最后一次加強(qiáng)免疫后3～30周，細(xì)胞融合前3～4天，通過尾靜脈注射的方法，用不含佐劑的偶聯(lián)物FITC-BSA對(duì)BALB/c小鼠進(jìn)行超強(qiáng)免疫，免疫劑量是100μg/只。

所述單克隆抗體的制備步驟為：采用聚乙二醇誘導(dǎo)進(jìn)行細(xì)胞融合10天后，以半抗原FITC與OVA（雞卵清白蛋白）的偶聯(lián)物FITC-OVA作為包被原，通過間接ELISA法對(duì)融合成功的孔進(jìn)行陽性篩選，然后再對(duì)陽性孔進(jìn)行亞克隆以獲得分泌抗FITC單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，再通過體內(nèi)誘生腹水的方法大量制備抗FITC單克隆抗體，最后對(duì)獲得的單抗進(jìn)行免疫學(xué)鑒定。

所述單克隆抗體只與FITC特異性結(jié)合，其亞型為IgG1，Kappa型，敏感性IC50不大于1.37ng/ml，親和力不小于1.72×10¹⁰ L/mol。

上述單克隆抗體在免疫層析試紙檢測(cè)中的應(yīng)用，采用上述抗FITC熒光單克隆抗體在免疫層析法中能夠快速、特異性地識(shí)別FITC熒光探針標(biāo)記的蛋白質(zhì)或核酸分子。

本發(fā)明的積極有益效果在于：

（1）FITC常被用作分子探針來標(biāo)記蛋白質(zhì)或核酸分子，而本發(fā)明既利用其熒光探針的功能，又利用其半抗原的特性，將其與分子量較大的載體蛋白偶聯(lián)從而制備出具有較強(qiáng)的免疫原性的人工完全抗原，為下一步獲得高親和力和強(qiáng)特異性的抗FITC單克隆抗體奠定了基礎(chǔ)。

（2）本發(fā)明采用雜交瘤技術(shù)建立了能穩(wěn)定分泌抗FITC熒光單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，并且通過體內(nèi)誘生腹水的方法制備出大量抗FITC熒光單克隆抗體，本發(fā)明制備出的單抗不僅與FITC熒光探針具有高親和力，而且只與FITC熒光探針特異性結(jié)合，因此該抗體在免疫檢測(cè)中具有廣泛的研究和商業(yè)使用價(jià)值，此外，利用所述抗FITC熒光單克隆抗體研發(fā)出的免疫層析試紙為快速、特異性地檢測(cè)各種由FITC探針標(biāo)記的蛋白或核酸分子提供了技術(shù)和物質(zhì)支撐。

（3）利用本發(fā)明研制出的免疫層析試紙來檢測(cè)FITC熒光探針標(biāo)記的蛋白或核酸分子的方法具有諸多的優(yōu)點(diǎn)，如靈敏度高，特異性強(qiáng)，不需要昂貴的儀器設(shè)備和專業(yè)的操作人員，可以實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)實(shí)時(shí)檢測(cè)等。

附圖說明

圖1 人工完全抗原FITC-BSA紫外掃描鑒定結(jié)果。

圖2 人工完全抗原FITC-OVA紫外掃描鑒定結(jié)果。

圖3 人工完全抗原SDS-PAGE鑒定結(jié)果。

圖4 2A7單克隆抗體SDS-PAGE鑒定結(jié)果。

圖5 2A7單克隆抗體親和力鑒定結(jié)果。

圖6 2A7單克隆抗體特異性鑒定結(jié)果。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于此。以下各實(shí)施例中所用原料及試劑，如無特別說明，則均為市售；所涉及的檢測(cè)方法或試驗(yàn)方法，如無特別說明，則均為常規(guī)方法。

實(shí)施例1

抗FITC熒光單克隆抗體的制備，包括以下步驟：

（1）實(shí)驗(yàn)所用BALB/c小鼠購自鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，主要試劑見表1。

表1 實(shí)施例1主要試劑

。

（2）人工完全抗原FITC-BSA和FITC-OVA的制備及鑒定：

利用異硫氰酸熒光素易于和蛋白質(zhì)結(jié)合的特性采用直接標(biāo)記法，將FITC分別與載體蛋白BSA和OVA偶聯(lián)，從而制備出免疫抗原FITC-BSA和檢測(cè)抗原FITC-OVA。

人工完全抗原的鑒定：用PBS緩沖液分別將人工抗原FITC-BSA和FITC-OVA稀釋到1mg/ml，然后分別通過紫外吸收光譜法、SDS-PAGE法以及動(dòng)物免疫對(duì)人工完全抗原進(jìn)行鑒定。

（3）動(dòng)物免疫：

將合成的FITC-BSA分別加入弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑乳化制成弗氏完全佐劑免疫原和弗氏不完全佐劑免疫原（其中FITC-BSA與弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑體積比均為1:1）。通過背部皮下多點(diǎn)注射的方法，用FITC-BSA弗氏完全佐劑免疫原免疫8周齡的雌性BALB/c小鼠3只，50μg/只；在首次免疫14天和28天后分別用FITC-BSA弗氏不完全佐劑免疫原以相同的方法和劑量對(duì)BALB/c小鼠進(jìn)行加強(qiáng)免疫；最后一次加強(qiáng)免疫后3～30 周，細(xì)胞融合前3～4天，通過尾靜脈注射的方法，用不含佐劑的FITC-BSA對(duì)BALB/c小鼠進(jìn)行超強(qiáng)免疫，免疫劑量是100μg /只。

（4）細(xì)胞融合及雜交瘤細(xì)胞的篩選：

對(duì)小鼠進(jìn)行超強(qiáng)免疫后第3天，采用聚乙二醇的方法，將免疫小鼠的脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0按細(xì)胞數(shù)量10:1的比例進(jìn)行細(xì)胞融合，融合后的細(xì)胞用HAT選擇培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，分裝在鋪有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置37℃、5% CO₂培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，10天后，以FITC-OVA作為包被原，通過間接ELISA法對(duì)長有雜交瘤細(xì)胞的孔進(jìn)行陽性篩選，再通過有限稀釋法對(duì)陽性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行亞克隆，直到獲得能穩(wěn)定分泌抗FITC單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。

（5）單抗腹水的制備：

選擇經(jīng)產(chǎn)的雌性BALB/c小鼠，腹腔內(nèi)注射500μl滅菌石蠟，一周后，再次腹腔內(nèi)注射獲得的單克隆雜交瘤細(xì)胞，注射量為2×10⁵個(gè)細(xì)胞，再過一周后，待小鼠腹部膨大后抽取腹水，離心后取上清，用辛酸硫酸銨法對(duì)腹水進(jìn)行純化。

（6）單抗腹水的鑒定：

效價(jià)和敏感性測(cè)定：分別通過間接ELISA法和間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法對(duì)純化后的單抗腹水的效價(jià)和敏感性進(jìn)行測(cè)定；

亞型鑒定：用亞型鑒定試劑盒對(duì)單抗的亞型進(jìn)行鑒定；

親和力測(cè)定：用CBS液將FITC-OVA稀釋成濃度2μg/mL和1μg/mL的包被液分別包板，通過間接 ELISA 法測(cè)定單抗腹水效價(jià)，以單抗?jié)舛葹闄M坐標(biāo)，OD450值為縱坐標(biāo)，繪出相應(yīng)的 2 條間接 ELISA 反應(yīng)曲線，以每條曲線上部平坦段的 OD450值作為100%，在曲線上算出50% OD450值時(shí)對(duì)應(yīng)的抗體濃度，按照公式 Kaff=(n-1)/2(n[Ab′]t-[Ab]t)計(jì)算單抗的親和常數(shù)，其中 n=[Ag] t/[Ag′]t，[Ag]t、[Ag′]t 為2個(gè)不同的包被原濃度，[Ab]t、[Ab′]t 為各包被原濃度下50% OD450值對(duì)應(yīng)的抗體濃度。

特異性測(cè)定：分別選擇 FITC、空白載體蛋白（BSA和OVA）及熒光素Rhodamine B作為競(jìng)爭(zhēng)標(biāo)品，通過間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定所獲得的單抗對(duì)各競(jìng)爭(zhēng)標(biāo)品的敏感性。

穩(wěn)定性鑒定：將所建立的單克隆雜交瘤細(xì)胞株連續(xù)培養(yǎng)3個(gè)月并反復(fù)液氮凍存復(fù)蘇，從而鑒定雜交瘤細(xì)胞的穩(wěn)定性。

實(shí)施例2

免疫層析試紙條的制備，包括以下步驟：

（1）單抗的膠體金標(biāo)記

以0.2mol/L K₂CO₃調(diào)節(jié)膠體金溶液pH至9.0，取待標(biāo)記抗FITC單克隆抗體IgG對(duì)20mmol/L硼酸鈉溶液（pH 8.0）4℃過夜透析，進(jìn)行膠體金標(biāo)記；

（2）檢測(cè)膜的制備

將硝酸纖維素檢測(cè)膜切成2.5×30cm²的長條，置于XYZ 3000噴點(diǎn)儀平臺(tái)上，并以壓條固定；用PBS（pH 7.2）將FITC-OVA人工抗原和兔抗鼠IgG稀釋至 1mg/mL，經(jīng)0.22μm濾膜過濾后，用Biojet Quanti 3000以1μL/cm分別將FITC-OVA人工抗原溶液和兔抗鼠IgG溶液噴點(diǎn)于檢測(cè)膜中央，形成檢測(cè)線和質(zhì)控線印跡，檢測(cè)線與質(zhì)控線相距0.5cm；置42℃干燥箱30min或室溫自然干燥；將檢測(cè)膜置塑料袋，加干燥劑4℃密閉保存?zhèn)溆谩?/p>

（3） FITC標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備

稱取10 mg FITC標(biāo)準(zhǔn)品溶解在10 mL PBS（pH7.2）中，配制1 mg/mL FITC標(biāo)準(zhǔn)品母液，將上述FITC標(biāo)準(zhǔn)品母液用PBS緩沖液倍比稀釋為不同濃度的FITC標(biāo)準(zhǔn)樣品，PBS作為陰性標(biāo)準(zhǔn)品。

（4）試紙產(chǎn)品的測(cè)試

將FITC檢測(cè)試紙樣品端分別浸入不同濃度的FITC標(biāo)準(zhǔn)樣品中10～20s，取出試紙水平放置5～10 min觀察結(jié)果。試紙顯現(xiàn)兩條紅棕色條帶（檢測(cè)線和質(zhì)控線），且檢測(cè)線顯色強(qiáng)度與陰性標(biāo)準(zhǔn)品無明顯差別為陰性結(jié)果；試紙僅顯現(xiàn)一條紅棕色條帶（質(zhì)控線）為FITC強(qiáng)陽性；試紙未顯現(xiàn)任何條帶表明試紙失效。

實(shí)施例3

對(duì)實(shí)施例1相關(guān)過程進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果和分析如下：

（1）人工完全抗原FITC-BSA和FITC-OVA的鑒定結(jié)果

兩種人工完全抗原的紫外吸收光譜鑒定結(jié)果（圖1和圖2）顯示，相對(duì)于空白載體蛋白（BSA/OVA）和FITC兩者的最大紫外吸收峰而言，人工抗原FITC-BSA和FITC-OVA的最大紫外吸收峰均發(fā)生了偏移，由此可以初步證明FITC-BSA和FITC-OVA偶聯(lián)成功。

人工抗原的SDS-PAGE鑒定結(jié)果（圖3）顯示，F(xiàn)ITC-BSA條帶相對(duì)于BSA條帶(66KD)有拖尾現(xiàn)象產(chǎn)生，同樣的，F(xiàn)ITC-OVA條帶相對(duì)于OVA條帶(43KD)出現(xiàn)明顯的拖尾現(xiàn)象，由此證明人工抗原FITC-BSA和FITC-OVA偶聯(lián)成功。

根據(jù)公式F/P = 3.1×A495/（A280-0.31×A495）計(jì)算出人工抗原FITC與BSA和OVA的結(jié)合比率分別是14:1 和13:1。

（2）多抗血清效價(jià)和敏感性測(cè)定結(jié)果

最后一次加強(qiáng)免疫后一周，分別對(duì)3只小鼠進(jìn)行剪尾采血，然后通過間接ELISA法和間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法分別對(duì)3只小鼠多抗血清的效價(jià)和敏感性進(jìn)行測(cè)定。其中3號(hào)鼠的免疫效果最好，效價(jià)是1:51200，半數(shù)抑制IC50為4.30 ng/mL，因此，選擇3號(hào)鼠進(jìn)行融合。

（3）細(xì)胞融合及篩選結(jié)果

細(xì)胞融合后，通過有限稀釋法對(duì)陽性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行多次亞克隆，獲得能穩(wěn)定分泌抗FITC熒光探針單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株（本例試驗(yàn)所得細(xì)胞株命名為2A7雜交瘤細(xì)胞株）。

（4）單抗腹水制備及鑒定結(jié)果

用2A7雜交瘤細(xì)胞株通過體內(nèi)誘生腹水的方法大量制備2A7單克隆抗體，腹水純化后結(jié)果如圖4所示，從圖中可以看出純化后的腹水分別在約54KD和25KD處有兩條明顯的條帶，分別代表單克隆抗體的重鏈和輕鏈，而且沒有其他的雜帶，說明純化效果很好。然后再對(duì)獲得的2A7單克隆抗體進(jìn)行免疫學(xué)鑒定。間接ELISA測(cè)定結(jié)果顯示2A7單克隆抗體的效價(jià)是2.048×10^-6；根據(jù)間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定結(jié)果計(jì)算出2A7單克隆抗體的IC50是1.37ng/ml；亞型鑒定結(jié)果顯示2A7單克隆抗體屬于IgG1，Kappa型；根據(jù)親和力測(cè)定結(jié)果（圖5）計(jì)算出2A7單克隆抗體的親和力是1.72×10¹⁰ L/mol；特異性鑒定結(jié)果（圖6）也表明了2A7單克隆抗體只與FITC特異性結(jié)合；將所建立的2A7雜交瘤細(xì)胞株連續(xù)培養(yǎng)3個(gè)月后，仍能穩(wěn)定分泌抗FITC單克隆抗體，又將2A7雜交瘤細(xì)胞株在液氮中反復(fù)多次凍融后，測(cè)得其細(xì)胞培養(yǎng)上清的效價(jià)是1:2048，IC50是1.26ng/ml，結(jié)果表明獲得的2A7雜交瘤細(xì)胞株能穩(wěn)定分泌抗FITC熒光探針單克隆抗體。

（5）FITC試紙產(chǎn)品的測(cè)試結(jié)果

FITC試紙產(chǎn)品的測(cè)試結(jié)果表明，研制出的免疫層析試紙條對(duì)FITC熒光探針的檢測(cè)限度為1.9 ng/ml。

上面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作了詳細(xì)的說明，但是，所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠理解，在不脫離本發(fā)明宗旨的前提下，還可以對(duì)上述實(shí)施例中的各個(gè)具體參數(shù)進(jìn)行變更，形成多個(gè)具體的實(shí)施例，均為本發(fā)明的常見變化范圍，在此不再一一詳述。