本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種檢測(cè)黃曲霉毒素的近紅外熒光免疫層析試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

霉菌毒素是一類由產(chǎn)毒真菌在適宜的環(huán)境條件下產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物，廣泛存在于農(nóng)作物中。由于其具有致癌性、腎毒性、神經(jīng)毒性、免疫抑制和類雌激素作用等潛在的毒性作用，因此可對(duì)人類和畜禽健康產(chǎn)生嚴(yán)重的危害。目前霉菌毒素在農(nóng)作物中的污染已成為一個(gè)全球性的問題。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織報(bào)告，全球每年約有25％的農(nóng)作物遭受霉菌毒素的污染，部分農(nóng)作物因污染嚴(yán)重而失去營養(yǎng)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，造成的直接和間接經(jīng)濟(jì)損失可達(dá)數(shù)百億美元。糧食作物中主要的霉菌毒素有黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、伏馬毒素、T-2毒素和嘔吐毒素等，其中危害最為嚴(yán)重的為黃曲霉毒素。建立快速、高靈敏、準(zhǔn)確的測(cè)定方法，監(jiān)控糧谷中黃曲霉毒素的污染水平對(duì)保障消費(fèi)者和畜禽健康具有重要意義。

目前國內(nèi)外用于霉菌毒素檢測(cè)的分析方法主要分為兩大類：儀器分析方法和免疫分析方法。儀器方法主要包括液相色譜法、氣相色譜法、毛細(xì)管電泳法、液相色譜-質(zhì)譜法和氣相色譜-質(zhì)譜法等，這些方法具有較高的準(zhǔn)確度和精確度，常用于霉菌毒素的定量和確證分析，但是通常需要在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境運(yùn)行，并且需要昂貴的儀器和配備專業(yè)的技術(shù)人員，同時(shí)在進(jìn)行儀器分析之前，需要對(duì)樣品進(jìn)行繁瑣的前處理。因此，儀器分析方法不適合于基層實(shí)驗(yàn)室和現(xiàn)場(chǎng)環(huán)境霉菌毒素的快速檢測(cè)。常用的免疫分析方法主要包括酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法、免疫層析法、熒光光度法和熒光偏振免疫測(cè)定法等。因其操作簡(jiǎn)便、快速、檢測(cè)成本低和不需要昂貴儀器等特點(diǎn)，已廣泛用于霉菌毒素的篩查。

在這些免疫分析方法中，免疫層析試紙條法是其中檢測(cè)速度最快、最簡(jiǎn)便和分析成本最低的分析手段。大部分的免疫層析方法采用膠體金作為標(biāo)記物實(shí)現(xiàn)定量和定性檢測(cè)靶分析物。但是，膠體金免疫分析法存在一些弊端。如分析靈敏度有待提高，同時(shí)樣品基質(zhì)的顏色可能影響結(jié)果判斷。作為膠體金標(biāo)記物的替代物，熒光標(biāo)記物如量子點(diǎn)、熒光微球和熒光硅納米顆粒等廣泛應(yīng)用于免疫層析方法，表現(xiàn)出較高的靈敏度。但是，這些熒光標(biāo)記物的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)均在紫外-可見光范圍。由于組成試紙條的膜材料、生物基質(zhì)組分等的光散射和自發(fā)熒光等問題，這些熒光免疫層析法常產(chǎn)生非常高的背景熒光信號(hào)，從而在一定程度上抵消了這種方法的高靈敏度。與這些紫外-可見光區(qū)域的熒光標(biāo)記物相比，激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)在近紅外區(qū)的熒光標(biāo)記物可克服這些問題。在近紅外波長(zhǎng)區(qū)域，膜材料和生物基質(zhì)組分的光散射和自發(fā)熒光可大大降低，因而近紅外熒光檢測(cè)可顯著提高信噪比和靈敏度。近年來，近紅外熒光免疫分析已開始用于大分子蛋白如人類表皮生長(zhǎng)因子、甲胎蛋白、蛋白G、白介素和C-反應(yīng)蛋白等的檢測(cè)。目前沒有近紅外熒光免疫層析試紙條用于小分子化合物的檢測(cè)分析的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種檢測(cè)黃曲霉毒素的近紅外熒光免疫層析試劑盒。

本發(fā)明提供的試劑盒，為如下1)或2)：

1)所示的試劑盒包括檢測(cè)黃曲霉毒素的免疫層析試紙條和單獨(dú)包裝的近紅外熒光標(biāo)記抗黃曲霉毒素抗體；

2)所示的試劑盒包括檢測(cè)黃曲霉毒素的免疫層析試紙條和裝有所述近紅外熒光標(biāo)記抗黃曲霉毒素抗體的容器；

所述檢測(cè)黃曲霉毒素免疫層析試紙條依次包括設(shè)于底板上的樣品墊、包被檢測(cè)線和質(zhì)控線的反應(yīng)膜和吸水墊；

所述檢測(cè)線由黃曲霉毒素全抗原形成；所述黃曲霉毒素全抗原由載體蛋白偶聯(lián)黃曲霉毒素半抗原形成。

上述試劑盒中，所述近紅外熒光標(biāo)記抗黃曲霉毒素抗體由近紅外熒光標(biāo)記基團(tuán)標(biāo)記抗黃曲霉毒素抗體得到；

或所述近紅外熒光標(biāo)記基團(tuán)為800CW dye。

或所述裝有近紅外熒光標(biāo)記抗黃曲霉毒素抗體的容器為裝有所述近紅外熒光標(biāo)記抗黃曲霉毒素抗體的酶標(biāo)板。

上述試劑盒中，所述黃曲霉毒素全抗原中的載體蛋白為BSA；

或所述黃曲霉毒素和所述BSA的偶聯(lián)比為4:1。

或所述黃曲霉毒素全抗原的結(jié)構(gòu)式如式2所示：

上述試劑盒中，所述質(zhì)控線由羊抗鼠二抗形成；

或所述黃曲霉毒素為黃曲霉毒素B₁。

上述試劑盒中，所述裝有近紅外熒光標(biāo)記抗黃曲霉毒素抗體的容器中的所述近紅外熒光標(biāo)記抗黃曲霉毒素抗體以溶液的形式加入，且濃度為0.2μg/mL；

或所述裝有近紅外熒光標(biāo)記抗黃曲霉毒素抗體的容器中的所述近紅外熒光標(biāo)記抗黃曲霉毒素抗體的體積為每孔40μL；

或所述黃曲霉毒素全抗原以溶液的形式加入，且濃度為0.8mg/mL；

或所述羊抗鼠二抗以溶液的形式加入，且濃度為0.6mg/mL。

上述的試劑盒中的試紙條也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。

上述的試劑盒或上述的試紙條在檢測(cè)黃曲霉毒素含量中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；

或上述的試劑盒或上述的試紙條在檢測(cè)待測(cè)樣品中是否含有黃曲霉毒素中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；

或上述的試劑盒或上述的試紙條在檢測(cè)待測(cè)樣品中黃曲霉毒素含量中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種檢測(cè)待測(cè)樣品中是否含有黃曲霉毒素的方法。

本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：

1)將待測(cè)樣品加入含有上述近紅外熒光標(biāo)記抗黃曲霉毒素抗體的容器中，混勻，得到待檢測(cè)樣品；

2)用上述試劑盒中的試紙條檢測(cè)待檢測(cè)樣品，若試紙條的檢測(cè)線和質(zhì)控線均顯色，則待測(cè)樣品中不含有或候選不含有黃曲霉毒素；若試紙條的檢測(cè)線不顯色，且質(zhì)控線顯色，則待測(cè)樣品有或候選含有黃曲霉毒素。

本發(fā)明第3個(gè)目的是提供一種檢測(cè)待測(cè)樣品中黃曲霉毒素含量的方法。

本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：

1)將含有不同濃度黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品的樣品基質(zhì)分別加入上述近紅外熒光標(biāo)記抗黃曲霉毒素抗體的容器不同孔中，混勻，得到裝有不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品的容器；

所述含有不同濃度黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品的樣品基質(zhì)為向以不含有黃曲霉毒素的空白樣本中添加不同濃度的黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品得到的；

所述空白樣本與所述待測(cè)樣品均來源于同一類農(nóng)作物；

2)用上述試劑盒中的試紙條分別檢測(cè)各孔中各個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)線和質(zhì)控線的熒光強(qiáng)度，計(jì)算各個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)線的相對(duì)熒光強(qiáng)度值；

所述相對(duì)熒光強(qiáng)度值為檢測(cè)線熒光強(qiáng)度與質(zhì)控線熒光強(qiáng)度的比值；

以標(biāo)準(zhǔn)品各個(gè)濃度對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品各個(gè)濃度的相對(duì)熒光強(qiáng)度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；

3)將待測(cè)樣品替換步驟1)-步驟2)中的不同濃度黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品，計(jì)算待測(cè)樣品檢測(cè)線的相對(duì)熒光強(qiáng)度值；將所述待測(cè)樣品檢測(cè)線的相對(duì)熒光強(qiáng)度值代入步驟2)得到的所述標(biāo)準(zhǔn)曲線中，得到待測(cè)樣品中黃曲霉毒素含量。

上述空白樣品和上述待測(cè)樣品均采用甲醇-水溶液從農(nóng)作物中提取獲得，提取方法見實(shí)施例。

所述中，所述黃曲霉毒素為黃曲霉毒素B₁。

本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種檢測(cè)黃曲霉毒素的近紅外熒光免疫層析試紙條，可用于樣品中黃曲霉毒素的定量和定性檢測(cè)，具有操作簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高等特點(diǎn)。

附圖說明

圖1為近紅外熒光試紙條檢測(cè)示意圖(A)和結(jié)果判定圖(B)。

圖2為黃曲霉毒素全抗原合成示意圖。

圖3為典型的黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實(shí)施例1、檢測(cè)黃曲霉毒素的近紅外熒光免疫層析試劑盒

一、裝有近紅外熒光標(biāo)記抗體的微孔板的制備

1、近紅外熒光標(biāo)記物-抗體復(fù)合物(近紅外熒光標(biāo)記抗體)的制備

磷酸鹽緩沖溶液(PBS)配制：取8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na₂HPO₄、0.24g KH₂PO₄，溶于蒸餾水定容至1L。

含1％(w/v)BSA,3％(w/v)sucrose和0.5％(v/v)Triton-100的PBS溶液：取1g BSA、3g sucrose和0.5mL Triton-100溶于100mL PBS溶液。

取1mg 800CW dye(貨號(hào)：929-7002，美國Licor公司)溶于0.5mL二甲基亞砜，使800CW dye的濃度為2mg/mL，得到800CW dye溶液。

將抗黃曲霉毒素抗體(北京中檢維康生物科技有限公司提供)用0.01M PBS(pH7.4)稀釋至1mg/mL，得到抗黃曲霉毒素抗體溶液。

取0.5mL抗黃曲霉毒素抗體溶液與50μL 800CW dye溶液混合，其中，抗黃曲霉毒素抗體和800CW dye的質(zhì)量比為5：1；避光孵育2小時(shí)，得到800CW-抗體復(fù)合物。

用Hitrap^TM脫鹽柱(GE healthcare Bio-Sciences Corp,NJ,USA)將多余的未結(jié)合的染料除去，得到純化的800CW-抗體復(fù)合物。

將純化的800CW-抗體復(fù)合物用含1％BSA,3％sucrose和0.5％Triton-100的PBS溶液稀釋至0.2μg/mL，得到800CW-抗體復(fù)合物溶液，即為近紅外熒光標(biāo)記抗體。

2、裝有近紅外熒光標(biāo)記抗體的微孔板的制備

將上述1制備0.2μg/mL的800CW-抗體復(fù)合物溶液按照40μL/孔體積加入酶標(biāo)板(美國Costar公司，貨號(hào)：2592)的每個(gè)孔中，得到裝有近紅外熒光標(biāo)記抗體的微孔板。最后整個(gè)裝有近紅外熒光標(biāo)記抗體的微孔板凍干保存?zhèn)溆谩?/p>

二、檢測(cè)黃曲霉毒素試紙條的制備

1、包被抗原的制備

制備流程圖如圖2所示。

1)半抗原黃曲霉毒素B₁-O-CMO的合成

取4mg的黃曲霉毒素B₁(德國FERMENTEK公司，貨號(hào)：AF022)和8mg的羧甲基羥胺半鹽酸鹽(CMO，美國sigma公司，貨號(hào)：C13408)溶于4mL的吡啶:甲醇:水(體積比1:4:1)溶液中，回流反應(yīng)4h。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)將溶劑蒸干，加入2mL水，調(diào)pH至4左右，得到溶液A；用6mL乙酸乙酯萃取溶液A 2次，合并有機(jī)相，旋轉(zhuǎn)蒸干得到黃色油狀物質(zhì)即為半抗原Aflatoxin B₁-O-CMO(式1)。

2)全抗原的合成

將半抗原Aflatoxin B₁-oxime溶于2mL乙醇水溶液，得到濃度為2mg/mL的半抗原Aflatoxin B₁-oxime溶液。

稱取5mg牛血清白蛋白(BSA)溶于2mL 0.1M的MES緩沖液(pH5.5，配制：取19.5g MES，溶于800mL水，調(diào)pH至5.5，定容至1L)中，得到濃度為2.5mg/mL的BSA溶液。

將1mL濃度為2mg/mL的半抗原Aflatoxin B₁-oxime溶液和1mL濃度為2.5mg/mL的BSA溶液等體積混勻，攪拌條件下加入50mg的碳二亞胺(EDC)，室溫避光攪拌反應(yīng)8h，得到偶聯(lián)載體蛋白的全抗原(式2，載體蛋白和半抗原的偶聯(lián)比為1:4)。

將偶聯(lián)載體蛋白的全抗原用PBS中透析24h后冷凍保存?zhèn)溆?，得到Aflatoxin B₁-BSA溶液(濃度為0.8mg/mL，溶劑為PBS，配制：取8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na₂HPO₄、0.24g KH₂PO₄，溶于蒸餾水定容至1L)。

2、包被抗原和二抗的固定

取0.8mg/mL的Aflatoxin B₁-BSA溶液和0.6mg/mL羊抗鼠二抗(美國SIGMA公司，貨號(hào)：M4155)分別噴涂于硝酸纖維素膜(美國MILLIPORE公司，貨號(hào)：HF180)上，作為檢測(cè)線和質(zhì)控線，噴涂體積為1μL/cm，得到包被抗原的硝酸纖維素膜，最后，將包被抗原的硝酸纖維素膜置于37℃干燥1h，干燥環(huán)境下冷藏備用。

3、黃曲霉毒素試紙條的組裝

如圖1A所示，近紅外熒光試紙條依次包括位于襯板上的4個(gè)組件：樣品墊、包被抗原的硝酸纖維素膜和吸收墊。

近紅外熒光試紙條制備方法如下：

首先將上述2制備的噴涂有包被抗原和二抗的硝酸纖維素膜粘貼于襯板中央；隨后將樣品墊(上海杰一生物技術(shù)公司，貨號(hào)：GF2-II)粘貼于襯板的一端，覆蓋于硝酸纖維素膜上約2cm；再將吸收墊(上海杰一生物技術(shù)公司，貨號(hào)：CH37)粘貼于襯板的另一端，同樣與硝酸纖維素膜重疊約2cm；最后將襯板切成4cm寬的試紙條，冷藏干燥保存?zhèn)溆?，得到檢測(cè)黃曲霉毒素的試紙條。

三、檢測(cè)黃曲霉毒素的近紅外熒光免疫層析試劑盒的制備

檢測(cè)黃曲霉毒素的近紅外熒光免疫層析試劑盒包括上述二制備的試紙條和上述一制備的近紅外熒光標(biāo)記抗體；

或檢測(cè)黃曲霉毒素的近紅外熒光免疫層析試劑盒包括上述二制備的試紙條和上述一制備的裝有近紅外熒光標(biāo)記抗體的微孔板。

四、檢測(cè)黃曲霉毒素的近紅外熒光免疫層析試劑盒的檢測(cè)原理和判斷標(biāo)準(zhǔn)

檢測(cè)原理：如圖1A和1B所示，將樣品溶液加入裝有近紅外熒光標(biāo)記抗體的微孔板中，再將試紙條的樣品墊端插入微孔板的樣品溶液中，當(dāng)樣品溶液中不含有黃曲霉毒素時(shí)，樣品孔中的近紅外標(biāo)記-抗體復(fù)合物將與硝酸纖維素膜上的包被原結(jié)合，在近紅外熒光檢測(cè)儀中呈現(xiàn)一條綠色的檢測(cè)線；當(dāng)樣品溶液中含有黃曲霉毒素時(shí)，黃曲霉毒素會(huì)與樣品孔中的近紅外標(biāo)記-抗體復(fù)合物結(jié)合，導(dǎo)致未飽和的近紅外標(biāo)記-抗體復(fù)合物數(shù)量降低，從而當(dāng)近紅外標(biāo)記-抗體復(fù)合物到達(dá)檢測(cè)線位置時(shí)，更少的近紅外標(biāo)記-抗體復(fù)合物與包被原結(jié)合，因此檢測(cè)線綠色變淺；當(dāng)樣品溶液中含有足夠多的黃曲霉毒素時(shí)，黃曲霉毒素會(huì)飽和樣品孔的近紅外標(biāo)記-抗體復(fù)合物，從而使近紅外標(biāo)記-抗體復(fù)合物不能與檢測(cè)線上的包被原結(jié)合，檢測(cè)線沒有綠色；無論樣品中是否含有黃曲霉毒素，正常情況下質(zhì)控線上的二抗都會(huì)與近紅外標(biāo)記-抗體復(fù)合物結(jié)合，形成綠色質(zhì)控線。質(zhì)控線不顯色時(shí)，表明測(cè)定結(jié)果不合格。

圖1B所示定性分析：當(dāng)檢測(cè)線顯示為綠色時(shí)，表明樣品為陰性；當(dāng)檢測(cè)線不顯綠色時(shí)，表明樣品為陽性；當(dāng)質(zhì)控線不顯色時(shí)，表明試紙條失效，當(dāng)質(zhì)控線顯示為綠色時(shí)，表明試紙條有效。

定量分析：1)建立黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線：用試紙條測(cè)定系列稀釋的黃曲霉毒素基質(zhì)加標(biāo)溶液，采用近紅外熒光讀數(shù)儀(LI-COR Biosciences,Lincoln,USA)測(cè)定檢測(cè)線和質(zhì)控線熒光強(qiáng)度，計(jì)算相對(duì)熒光強(qiáng)度值。

以黃曲霉毒素B₁濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以黃曲霉毒素B1不同濃度的相對(duì)熒光強(qiáng)度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。檢測(cè)未知毒素含量樣品時(shí)，樣品經(jīng)前處理后用試紙條檢測(cè)，將檢測(cè)線的相對(duì)熒光強(qiáng)度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，乘以稀釋倍數(shù)即可算出樣品中含有黃曲霉毒素的量。

實(shí)施例2、檢測(cè)黃曲霉毒素的近紅外熒光免疫層析試劑盒的靈敏度和特異性

一、檢測(cè)黃曲霉毒素的近紅外熒光免疫層析試劑盒的臨界值和靈敏度

1、樣品前處理：

將空白樣品(玉米、大米、小麥)粉碎，分別稱取5.0g玉米、大米和小麥粉碎樣品，加入25mL 70％甲醇水溶液，振搖3min，4000rpm離心5min，取上清，得到玉米提取液、大米提取液和小麥提取液；再用0.01M PBS(pH 7.4)稀釋4倍，得到玉米樣品稀釋液、大米樣品稀釋液和小麥樣品稀釋液；

向玉米樣品稀釋液、大米樣品稀釋液和小麥樣品稀釋液中分別添加黃曲霉毒素B₁至毒素濃度分別為0、0.00125、0.0025、0.005、0.01、0.02、0.04、0.05、0.06ng/mL，得到含有不同濃度黃曲霉毒素B₁的基質(zhì)加標(biāo)溶液。

2、定性檢測(cè)臨界值

分別取200μL含有不同濃度黃曲霉毒素B1的基質(zhì)加標(biāo)溶液加入實(shí)施例1的制備的裝有近紅外熒光標(biāo)記抗體的微孔板的孔中，混勻，孵育4分鐘，得到加樣微孔板；

再將實(shí)施例1的二制備的試紙條插入加樣微孔板中，室溫反應(yīng)10min后，采用近紅外熒光讀條儀(LI-COR Biosciences,Lincoln,USA)進(jìn)行測(cè)定。

定性檢測(cè)的臨界值(Cut-off值)定義為使檢測(cè)線完全消失的最低檢測(cè)濃度。若試紙條的檢測(cè)線和質(zhì)控線均顯色(綠色)，則待測(cè)樣品中不含有或含有黃曲霉毒素濃度低于臨界值(Cut-off值)；若試紙條的檢測(cè)線不顯色，且質(zhì)控線顯色(綠色)，則待測(cè)樣品含有的黃曲霉毒素濃度大于Cut-off值。

經(jīng)測(cè)定，試劑盒檢測(cè)玉米和大米中黃曲霉毒素的Cut-off值為1μg/kg(樣品溶液的消線濃度(ng/mL)乘以樣品稀釋倍數(shù)(20倍))；檢測(cè)小麥中黃曲霉毒素的Cut-off值為1.2μg/kg。

3、定量檢測(cè)靈敏度

用試紙條測(cè)定系列濃度的黃曲霉毒素基質(zhì)加標(biāo)溶液，采用近紅外熒光讀數(shù)儀(LI-COR Biosciences,Lincoln,USA)測(cè)定檢測(cè)線和質(zhì)控線熒光強(qiáng)度，計(jì)算相對(duì)熒光強(qiáng)度值。

以黃曲霉毒素B₁不同濃度對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以黃曲霉毒素B₁不同濃度的相對(duì)熒光強(qiáng)度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以20％的抑制率(80％B/B₀)對(duì)應(yīng)的濃度作為檢測(cè)靈敏度。結(jié)果表明試劑盒檢測(cè)玉米中黃曲霉毒素的靈敏度為0.04μg/kg(樣品溶液的靈敏度(ng/mL)乘以樣品稀釋倍數(shù)(20倍)；檢測(cè)大米黃曲霉毒素的靈敏度為0.05μg/kg；用試劑盒檢測(cè)小麥種黃曲霉毒素的靈敏度為0.07μg/kg。

二、檢測(cè)黃曲霉毒素的近紅外熒光免疫層析試劑盒的特異性

向玉米樣品稀釋液分別添加黃曲霉毒素B₁(德國FERMENTEK Ltd.,SSAF)、玉米赤霉烯酮(德國FERMENTEK Ltd.,SSZ)、嘔吐毒素(德國FERMENTEK Ltd.,SSZ)、伏馬毒素(德國FERMENTEK Ltd.,SSFB)、赭曲霉毒素(德國FERMENTEK Ltd.,SSOC)、T-2毒素(德國FERMENTEK Ltd.,SST)至終濃度均為10ng/mL，得到不同待測(cè)樣品溶液。

按照上述一的2的方法檢測(cè)不同待測(cè)樣品溶液，結(jié)果表明僅含有黃曲霉毒素B₁的待測(cè)樣品溶液測(cè)定的試紙條檢測(cè)線不顯綠色，其余毒素溶液均不會(huì)使檢測(cè)線消失或顏色變淺，說明制備的近紅外熒光抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)黃曲霉毒素的特異性高。

三、與現(xiàn)有膠體金試紙條的對(duì)比

1、樣品前處理：

將空白樣品(玉米、大米、小麥)粉碎，分別稱取5.0g玉米、大米和小麥粉碎樣品，加入25mL 70％甲醇水溶液，振搖3min，4000rpm離心5min，取上清，得到玉米提取液、大米提取液和小麥提取液；再用0.01M PBS(pH 7.4)稀釋4倍，得到玉米樣品稀釋液、大米樣品稀釋液和小麥樣品稀釋液；

向玉米樣品稀釋液、大米樣品稀釋液和小麥樣品稀釋液中分別添加黃曲霉毒素B1至毒素濃度分別為0、0.04、0.05、0.06、0.08、0.1、0.2、0.25、0.3、0.4ng/mL，得到含有不同濃度黃曲霉毒素B₁的基質(zhì)加標(biāo)溶液。

2、近紅外熒光檢測(cè)試劑盒檢測(cè)

分別取200μL含有不同濃度黃曲霉毒素B₁的基質(zhì)加標(biāo)溶液加入實(shí)施例1制備的裝有近紅外熒光標(biāo)記抗體的微孔板的孔中，混勻，孵育4分鐘，得到加樣微孔板；

再將實(shí)施例1的二制備的試紙條插入加樣微孔板中，室溫反應(yīng)10min后，采用近紅外熒光讀條儀(LI-COR Biosciences,Lincoln,USA)進(jìn)行測(cè)定。

如實(shí)施例2第一項(xiàng)所示(表1)，近紅外熒光檢測(cè)試劑盒檢測(cè)玉米、大米、小麥中黃曲霉毒素的Cut-off值分別為為1μg/kg、1μg/kg和1.2μg/kg(樣品溶液的消線濃度(ng/mL)乘以樣品稀釋倍數(shù)(20倍))。

3、現(xiàn)有膠體金試紙條檢測(cè)

分別取200μL含有不同濃度黃曲霉毒素B1的待測(cè)樣品溶液，用現(xiàn)有膠體金試紙條(北京中檢維康生物科技有限公司提供，AF-001)檢測(cè)。定性檢測(cè)的臨界值(Cut-off值)定義為使檢測(cè)線完全消失的最低檢測(cè)濃度。結(jié)果如表1所示，現(xiàn)有的膠體金試紙條檢測(cè)玉米、大米、小麥等的Cut-off值在4-5ug/kg之間。因近紅外熒光檢測(cè)試劑盒檢測(cè)玉米、大米、小麥中黃曲霉毒素的Cut-off值為1-1.2μg/kg，表明近紅外熒光試紙條靈敏度比膠體金試紙條靈敏度高5倍左右。

表1為近紅外熒光免疫層析試劑盒和膠體金試紙條測(cè)定的Cut-off值

實(shí)施例3、近紅外熒光免疫層析試劑盒定量檢測(cè)黃曲霉毒素的準(zhǔn)確度和精密度

一、黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

1、樣品前處理：

將已知不含有黃曲霉毒素的空白樣品(玉米、大米、小麥)粉碎，分別稱取5.0g粉碎樣品，加入25mL 70％甲醇水溶液，振搖3min，4000rpm離心5min，取上清，得到玉米提取液、大米提取液和小麥提取液；再用0.01M PBS(pH 7.4)稀釋4倍，得到玉米樣品稀釋液、大米樣品稀釋液和小麥樣品稀釋液；

向玉米樣品稀釋液、大米樣品稀釋液和小麥樣品稀釋液中分別添加黃曲霉毒素B₁至毒素濃度分別為0、0.00125、0.0025、0.005、0.01、0.02、0.04、0.05、0.06ng/mL，得到含有不同濃度黃曲霉毒素B₁的基質(zhì)加標(biāo)溶液。

2、檢測(cè)黃曲霉毒素的近紅外熒光免疫層析試劑盒檢測(cè)

按照實(shí)施例2的一的2的方法檢測(cè)含有不同濃度黃曲霉毒素B₁的基質(zhì)加標(biāo)溶液，采用近紅外熒光讀數(shù)儀(LI-COR Biosciences,Lincoln,USA)測(cè)定檢測(cè)線和質(zhì)控線熒光強(qiáng)度，計(jì)算相對(duì)熒光強(qiáng)度值。

以黃曲霉毒素B₁不同濃度對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以黃曲霉毒素B₁不同濃度的相對(duì)熒光強(qiáng)度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

得到的典型標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示，其中A為黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線(玉米)，B為黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線(大米)，C為黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線(小麥)。

二、添加回收試驗(yàn)

1、樣品前處理

將空白樣品(玉米、大米、小麥)粉碎，分別稱取5.0g玉米、大米和小麥粉碎樣品。分別往空白樣品添加高濃度的黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，使玉米、大米和小麥樣品中的添加濃度分別為0.1、0.2、0.4μg/kg。每個(gè)添加樣品中分別加入25mL 70％甲醇水溶液，振搖3min，4000rpm離心5min，取上清，再用0.01M PBS(pH 7.4)稀釋4倍，得到不同待測(cè)樣品溶液。

2、檢測(cè)黃曲霉毒素的近紅外熒光免疫層析試劑盒檢測(cè)

按照實(shí)施例2的一的2的方法檢測(cè)不同待測(cè)樣品，采用近紅外熒光讀數(shù)儀(LI-COR Biosciences,Lincoln,USA)測(cè)定檢測(cè)線熒光強(qiáng)度，計(jì)算相對(duì)熒光強(qiáng)度值。

將各種待測(cè)樣品的檢測(cè)線相對(duì)熒光強(qiáng)度值代入上述一得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程中，計(jì)算得到待測(cè)樣品中黃曲霉毒素含量。

結(jié)果如表2所示，在0.1-0.4μg/kg添加濃度范圍內(nèi)，回收率在82.1％至108.9之間，變異系數(shù)小于15.8％(n＝4)。表明近紅外熒光免疫層析試劑盒檢測(cè)黃曲霉毒素的準(zhǔn)確度和精密度滿足定量分析的要求。

表2近紅外熒光免疫層析試劑盒測(cè)定樣品中黃曲霉毒素添加回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝4)

實(shí)施例4、近紅外熒光免疫層析試劑盒定量檢測(cè)實(shí)際樣品中黃曲霉毒素

1、樣品前處理

從河南和北京等地農(nóng)場(chǎng)和超市收集16個(gè)玉米、小麥和大米樣品，粉碎后，分別稱取5.0g粉碎樣品，加入25mL 70％甲醇水溶液，振搖3min，4000rpm離心5min，取上清，再用0.01M PBS(pH 7.4)稀釋4倍，得到16個(gè)待測(cè)樣品稀釋液。

2、檢測(cè)黃曲霉毒素的近紅外熒光免疫層析試劑盒檢測(cè)

按照實(shí)施例2的一的2的方法分別檢測(cè)16個(gè)待測(cè)樣品稀釋液，采用近紅外熒光讀數(shù)儀(LI-COR Biosciences,Lincoln,USA)測(cè)定檢測(cè)線熒光強(qiáng)度，計(jì)算相對(duì)熒光強(qiáng)度值。

分別將16個(gè)待測(cè)樣品稀釋液的檢測(cè)線相對(duì)熒光強(qiáng)度值代入實(shí)施例3的一得到的各種標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程中，計(jì)算得到待測(cè)樣本中黃曲霉毒素含量。

3、商品化ELISA試劑盒測(cè)定實(shí)際樣品中黃曲霉毒素

收集的16個(gè)實(shí)際樣品粉碎后，分別稱取5.0g粉碎樣品，加入1g NaCl，加入25mL70％甲醇水溶液，振搖3min，4000rpm離心5min，取上清。按照商品化試劑盒(意大利Tecna Ltd.，MA220)的操作程序進(jìn)行測(cè)定。取上清50μL，與試劑盒提供的酶標(biāo)記抗原100μL在微孔塑料孔中充分混勻。移取100μL混合溶液至已包被有抗黃曲霉毒素單抗的微孔中(商品化試劑盒提供)，孵育10min，用洗滌液(商品化試劑盒提供)洗滌3次，加入顯色試劑(商品化試劑盒提供)，顯色5min，用酶標(biāo)儀讀取450nm吸收值，代入試劑盒提供的軟件中計(jì)算樣品中黃曲霉毒素的濃度。

近紅外熒光免疫層析試劑盒和商品化ELISA試劑盒測(cè)定實(shí)際樣品的結(jié)果如表3所示。結(jié)果表明，本免疫層析試劑盒測(cè)定結(jié)果與商品化ELISA試劑盒測(cè)定結(jié)果基本一致。

表3近紅外熒光免疫層析試劑盒和商品化試劑盒測(cè)定實(shí)際樣本的結(jié)果對(duì)比