本發(fā)明涉及傳感器技術(shù)領(lǐng)域的檢測兩種農(nóng)藥的方式，特別涉及了一種同時檢測水胺硫磷和啶蟲脒的電化學傳感器及其方法體系。

背景技術(shù)：

有機磷類廣泛用于農(nóng)作物的殺蟲、殺菌、除草，為我國使用量最大的一類農(nóng)藥。有機磷農(nóng)藥屬于神經(jīng)毒物，主要抑制血液和組織中乙酰膽堿酯酶的活性，導致乙酰膽堿的大量蓄積，從而阻斷了神經(jīng)傳導，引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)中毒。水胺硫磷是一種高毒有機磷殺蟲劑，能通過食道、皮膚和呼吸道引起中毒，作為一種高毒農(nóng)藥，水胺硫磷禁止用于果、茶、煙、菜、中草藥等植物或蔬菜、水果上。啶蟲脒屬硝基亞甲基雜環(huán)類化合物，是一種新型殺蟲劑，作用于昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)突觸部位的煙堿乙酰膽堿受體，干擾昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)的刺激傳導，引起神經(jīng)系統(tǒng)通路阻塞，造成神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿在突觸部位的積累，從而導致昆蟲麻痹，最終死亡。

我國是世界上第二大農(nóng)藥使用國，每年在蔬菜水果等農(nóng)作物產(chǎn)品上農(nóng)藥使用量約達100萬噸。農(nóng)藥大規(guī)模使用，使我國環(huán)境水體、土壤以及蔬菜水果都受到農(nóng)藥污染和農(nóng)藥殘留的嚴重威脅。特別是近年來，由于害蟲抗藥性的增強，使用農(nóng)藥的濃度和次數(shù)不斷增加，造成農(nóng)藥殘留超標，不僅對生態(tài)環(huán)境造成了嚴重的污染與危害，引起了環(huán)境工作者的高度重視；而且常有發(fā)生的急性、慢性中毒事件以及農(nóng)藥在人體內(nèi)的積累和富集而引發(fā)的各種疾病，直接影響到人類的健康，因而對食品及飲用水中農(nóng)藥殘留進行檢測是十分必要的。

目前，常用的農(nóng)藥殘留檢測方法主要有常規(guī)儀器法和生物分析法。常規(guī)儀器法是包括氣相色譜法、高效液相色譜法、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)等。這些方法儀器操作復雜，需要專業(yè)操作人員，往往不適于現(xiàn)場檢測，生物分析法指酶抑制技術(shù)、酶免疫分析法、生物傳感器等，這類方法易于現(xiàn)場快速測定。另一方面，農(nóng)作物中往往同時存在兩種或者更多的農(nóng)藥，高通量的檢測技術(shù)也是生物分析法的一個瓶頸。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對現(xiàn)有檢測方法中儀器操作復雜，需要專業(yè)操作人員，不能實現(xiàn)高通量的缺點，提供了一種同時檢測水胺硫磷和啶蟲脒的電化學傳感器及其方法體系，通過適配體方式對水胺硫磷和啶蟲脒實現(xiàn)電化學檢測。

本發(fā)明的技術(shù)方案是

一、一種同時檢測水胺硫磷和啶蟲脒的電化學傳感器：

從內(nèi)到外依次為電極、信標探針層、6-巰基己-1-醇(MCH)封閉層和均相反應產(chǎn)物層，信標探針層采用電化學信號互不影響的亞甲基蘭和二茂鐵修飾，亞甲基蘭的電化學信號對水胺硫磷的量有響應，二茂鐵的電化學信號對啶蟲脒有響應，通過亞甲基蘭的電化學信號對水胺硫磷的響應和二茂鐵的電化學信號對啶蟲脒的響應獲得水胺硫磷和啶蟲脒的檢測情況。

本發(fā)明通過實施例驗證：

不加入水胺硫磷和啶蟲脒時，亞甲基蘭和二茂鐵產(chǎn)生的信號強。

僅加入水胺硫磷時，亞甲基蘭產(chǎn)生的信號低，二茂鐵產(chǎn)生的信號強。

僅加入啶蟲脒時，二茂鐵產(chǎn)生的信號信號低，亞甲基蘭產(chǎn)生的信號強。

同時加入水胺硫磷和啶蟲脒時，亞甲基蘭和二茂鐵產(chǎn)生的信號明顯都低。

所述的傳感器能同時檢測0.5到100ppb的水胺硫磷和啶蟲脒，水胺硫磷和啶蟲脒檢出限分別是0.12和0.37ppb。

所述電極采用金電極。

二、一種同時檢測水胺硫磷和啶蟲脒的電化學傳感器的方法體系：

(1)電極拋光并用體積比為3:1的H₂SO₄和H₂O₂處理；

(2)將含有信標探針XB1和信標探針XB2的兩種信標探針溶液修飾于電極表面，形成信標探針層；

(3)修飾MCH封閉未特異性結(jié)合的位點，形成6-巰基己-1-醇(MCH)封閉層；

(4)將均相反應產(chǎn)物修飾于電極表面上修飾后的信標探針，形成均相反應產(chǎn)物層；

(5)用磁力攪拌器在PBS溶液中清洗修飾后的電極；

(6)采用三電極體系，讀取電極上的電信號變化，根據(jù)電極表面產(chǎn)生的電流大小獲得水胺硫磷和啶蟲脒的檢測結(jié)果。

所述的XB1如SEQ ID NO.1，為SH-GAGGTAAGCCTCCACCTC-MB；所述的XB2如SEQ ID NO.2，為SH-GAGGGAACAACGACCCTC-Fc，其中，SH表示巰基、MB表示亞甲基藍，F(xiàn)c表示二茂鐵。

所述含有信標探針XB1的信標探針溶液和含有信標探針XB2的信標探針溶液的體積比為1:2。

所述步驟(4)的均相反應產(chǎn)物是通過以下步驟的均相反應獲得：

(4.1)將含有兩種基因序列的發(fā)卡HAP溶液加入到Phi29DNA聚合酶的緩沖溶液中；

(4.2)加入兩種待測目標物溶液，在37℃孵育30min；

(4.3)加入含有兩種引物序列的溶液，并加入Phi29DNA聚合酶溶液、dNTP溶液和NB.BbvCI溶液，在37℃孵育1h。

所述的發(fā)卡HAP溶液中兩種基因序列分別為發(fā)卡HAP1和發(fā)卡HAP2，發(fā)卡HAP1如SEQ ID NO.3，為AGCTTGCTGCAGCGATTCTTGATCGCCACAGAGCTGCTGAGGTGGAGGCAAGCT；發(fā)卡HAP2如SEQ ID NO.4，為CTGACACCATATTATGAAGAGCTGAGGGTCGTTGTCAG；兩種基因序列的含量相同。

所述的含有兩種引物序列的溶液的兩種引物序列分別為引物1和引物2，引物1如SEQ ID NO.5，為AGCTTGCCT；引物2如SEQ ID NO.6，為CTGACAACG。

所述金電極用H₂SO₄和H₂O₂的處理時間是20min。

所述方法體系的步驟(1)～(4)具體為：

(1)電極拋光后，將電極浸泡在體積比為3:1的H₂SO₄和H₂O₂的混合液中，孵育20min后用超純水徹底洗滌；

(2)將2μL的濃度為10μM的信標探針XB1溶液和4μL的濃度為10μM的信標探針XB2溶液滴加到電極表面；

(3)修飾MCH封閉未特異性結(jié)合的位點；

(4)采用以下方式制備均相反應產(chǎn)物，再修飾于電極表面上修飾后的信標探針：

(4.1)將2μL的濃度為100nM的發(fā)卡HAP1溶液和2μL的濃度為100nM的發(fā)卡HAP2溶液加入到20μL的Phi29DNA聚合酶的緩沖溶液中；

(4.2)加入兩種待測目標物水胺硫磷和啶蟲脒溶液，在37℃下孵育30min；

(4.3)加入2μL的濃度為100nM的引物1溶液和2μL的濃度為100nM的引物2溶液，并加入1μL的濃度為10unitμL^-1的Phi29DNA聚合酶、2μL的濃度為5mM的dNTP和1μL的濃度為10unitμL^-1的NB.BbvCI，在37℃孵育1h。

所述電化學傳感器，采用傳統(tǒng)的三電極體系，以Ag/AgCl為參比電極，以Pt電極為對電極，電位設(shè)置為-0.4到0.6V，脈沖寬度0.05V，脈沖寬度掃描為0.06S，采用差分脈沖伏安技術(shù)讀取電信號的變化，根據(jù)電極表面產(chǎn)生的電流的大小起到對目標物檢測的作用。

本發(fā)明中一共用到了6條DNA鏈，其序列從5’端—3’端分別是：

(NO.1)發(fā)卡HAP1：AGCTTGCTGCAGCGATTCTTGATCGCCACAGAGCTGCTGAGGTGGAGGCAAGCT

(NO.2)發(fā)卡HAP2：CTGACACCATATTATGAAGAGCTGAGGGTCGTTGTCAG

(NO.3)引物1：AGCTTGCCT

(NO.4)引物2：CTGACAACG

(NO.5)信標探針XB1：SH-GAGGTAAGCCTCCACCTC-MB

(NO.6)信標探針XB2：SH-GAGGGAACAACGACCCTC-Fc

如圖1所示，本發(fā)明的工作原理是：

如圖1的步驟A：本發(fā)明中應用的探針NO.1、NO.2、NO.5和NO.16都存在5’端與3’端堿基互補配對(斜體部分)的情況，因此在緩沖溶液中以發(fā)卡的構(gòu)型存在。其中發(fā)卡HAP1探針的序列中，5’端畫橫線的部分為目標物水胺硫磷的適配體，發(fā)卡HAP2探針的5’端畫橫線的部分為目標物啶蟲脒的適配體。適配體可以與目標物特異性的識別并緊密結(jié)合，因此發(fā)卡HAP1和發(fā)卡HAP2在與水胺硫磷、啶蟲脒混合時將發(fā)生發(fā)卡打開的構(gòu)型變化，使得在發(fā)卡HAP1和發(fā)卡HAP2由雙鏈DNA變成單鏈的同時水胺硫磷和啶蟲脒分別與發(fā)卡HAP1和發(fā)卡HAP2打開后的單鏈基因結(jié)合，如圖1的步驟A所示。

本發(fā)明中引物1與引物2都存在8個堿基，并分別與發(fā)卡HAP1和發(fā)卡HAP2的3’端互補配對。因此引物1與引物2分別結(jié)合到被待測目標物打開的發(fā)卡HAP1和發(fā)卡HAP2的單鏈基因上，如圖1的步驟A。

引物與發(fā)卡結(jié)合后暴露出引物3’端的凹末端，在Phi29DNA聚合酶和dNTP的存在下，引物以發(fā)卡探針為模板不斷延伸直到形成完整的雙鏈，并將待測目標物擠下來，并切割下來Helper，Helper的基因序列是發(fā)卡HAP基因序列中的一部分。

被擠下的目標物可循環(huán)使用，打開下一個發(fā)卡，如圖1的步驟A中的回轉(zhuǎn)箭頭所示。

延伸生長出的雙鏈上含有限制性內(nèi)切酶(Nb.BbvCI)的識別序列(黑體序列)，在Phi29DNA聚合酶、dNTP和Nb.BbvCI的同時作用下，切割位點及之后的核酸片段(發(fā)卡HAP1產(chǎn)生的稱為Helper 1，發(fā)卡HAP2產(chǎn)生的稱為Helper2)不斷被生長和切割，每一個發(fā)卡HAP對應產(chǎn)生很多Helper，實現(xiàn)了信號放大作用。

如圖1的步驟B：信標探針1和信標探針2分別在5’端修飾有巰基(SH)，可與金電極形成穩(wěn)定的Au-S鍵，從而穩(wěn)定的修飾在金電極表面，信標探針1的3’端修飾有亞甲基藍(MB)，信標探針2的3’端修飾有二茂鐵(Fc)，亞甲基藍在-0.25V電位下發(fā)生氧化還原反應，二茂鐵在+0.38V電位下發(fā)生氧化還原反應，我們就是通過檢測這兩種可完全分離的氧化還原信號來達到定量檢測目標物的目的。當信標探針呈現(xiàn)發(fā)卡結(jié)構(gòu)，3’端修飾的信標分子離電極較近，可產(chǎn)生較大的氧化還原信號，均相反應中產(chǎn)生的Helper可打開信標探針的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，使得信標探針上修飾的亞甲基蘭和二茂鐵遠離電極表面，產(chǎn)生的電化學信號也大大降低。

因此，在本發(fā)明所述的電化學傳感器檢測過程中，通過檢測MB和Fc信號的強弱對目標物進行定量，當目標物越多時，產(chǎn)生的Helper也越多，打開的信標探針也越多，遠離電極表面的MB和Fc也越多，產(chǎn)生的信號也就越小。同時MB和Fc電化學信號相互分離互不影響，實現(xiàn)了兩種農(nóng)藥的同時檢測。

本發(fā)明的有益效果是：

1、本發(fā)明利用了核酸適配體的特異型識別，利用了水胺硫磷和啶蟲脒的適配體作為識別物質(zhì)實現(xiàn)了水胺硫磷和啶蟲脒的高特異性檢測。并且利用了聚合酶的聚合作用和核限制性核酸內(nèi)切酶對特異性序列的識別和切割作用，實現(xiàn)了目標物的循環(huán)利用，并不斷產(chǎn)生Helper探針，起到了信號放大的作用。

2、本發(fā)明傳感器的反應條件溫和，反應速度快。制備方法簡單，性能穩(wěn)定，電極的重復性好，適用于食品安全中水胺硫磷和啶蟲脒的檢測和生物傳感器產(chǎn)業(yè)化的實際應用。

3、檢測原理的主要過程均是在均相中實現(xiàn)的，提高的反應速度，降低了操作的復雜程度，實現(xiàn)了目標物的快速，簡單，靈敏的檢測。

4、由于使用金電極，其電極簡便、小型化、易攜帶、可多次使用。制作電極的工藝成本低，適用于產(chǎn)業(yè)化中價廉的要求。

綜合來說是，本發(fā)明傳感器和方法體系簡單，性能穩(wěn)定，電極的重復性好，適用于食品安全中水胺硫磷和啶蟲脒的檢測和生物傳感器產(chǎn)業(yè)化的實際應用；可實現(xiàn)對食品中水胺硫磷和啶蟲脒的快速在線檢測，水胺硫磷和啶蟲脒檢出限分別是0.12和0.37ppb。

附圖說明

圖1是本發(fā)明方法體系的原理圖。

圖2是本發(fā)明各個實施例中電極上檢測獲得的電信號結(jié)果圖，圖中A為實施例1，B為實施例2，C為實施例3，D為實施例4。

圖3是實施例5對應的標準曲線圖，其中A圖不同濃度農(nóng)藥對應的波譜圖，B是水胺硫磷與電信號響應的擬合圖，C圖是啶蟲脒與電信號響應的擬合圖。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，下述說明僅是實例性的，不限定本發(fā)明的保護范圍。

本發(fā)明的實施例如下：

以下實施例用到的溶液的制備是：

PBS緩沖液是由方法配制：Na₂HPO₄(10mM)，NaH₂PO₄(10mM)，NaCl(140mM)，KCl(1mM)，MgCl₂(1mM)，CaCl₂(1mM)，最終溶液的pH值為7.4。

配置的PBS緩沖液與超純水均需進行滅菌處理。具體方法是，將PBS和超純水分別放置在不同的錐形瓶中，然后用錫箔紙和報紙進行封口。在高壓滅菌鍋中在120℃的溫度下滅菌20min。

本發(fā)明中所用發(fā)卡、信標探針和引物均為人工合成，合成后的溶解方法為：3000轉(zhuǎn)/min離心3min，用滅菌后的PBS(pH＝7.4)溶解為所需濃度。

實施例1

a、金電極首先在粒徑為0.3μm的氧化鋁漿和粒徑為0.05μm的氧化鋁漿中依次進行拋光處理，直到呈鏡面，并將電極浸泡在20mL體積比為3:1的H₂SO₄和H₂O₂的混合液中，孵育20min后用超純水徹底洗滌；

b、將共6μL的XB溶液(10μM的XB1：2μL和10μM的XB2：4μL)滴加到步驟a處理后的電極表面，在常溫下孵育2h，信標探針XB通過Au-S鍵將巰基鏈固定到電極表面。

c、用MCH修飾來封閉未特異性結(jié)合的位點，具體是：將6μL的1mM的MCH溶液滴加到電極表面，孵育30min后用PBS洗滌。

d、進行均相反應，主要步驟為：

1、將2μL 100nM的HAP1和2μL 100nM的HAP2和20μL的濃度1×的Phi29DNA聚合酶的緩沖溶液分別加入到離心管中，37℃孵育30min；

原始制備附帶10倍濃度(10×)的緩沖液，使用時稀釋10倍，原始10倍濃度(10×)的緩沖液包含40.0mM pH 7.5Tris-HCl,50.0mM KCl,10.0mMMgCl₂和5.0mM(NH₄)₂SO₄。

2、繼續(xù)向上一步的離心管中加入2μL 100nM引物1與2μL 100nM引物2，加入1μL的濃度為10unitμL^-1的Phi29DNA聚合酶、2μL的濃度為5mM的dNTP和1μL的濃度為10unitμL^-1的NB.BbvCI。震蕩30s放入37℃的恒溫箱中孵育1h。

e、將均相反應后的溶液滴加到預先修飾好XB的電極上。然后將電極繼續(xù)放在37℃的恒溫箱中孵育2h。

f、用磁力攪拌器在PBS溶液中清洗電極，每次10min，共清洗3次。

g、以Ag/AgCl為參比電極，以Pt電極為對電極，電位設(shè)置為-0.4到0.6V，脈沖寬度0.05V，脈沖寬度掃描為0.06S，采用差分脈沖伏安技術(shù)讀取MB和Fc電信號的變化。

h、其結(jié)果如附圖2的A圖所示，因沒有加入目標物，也就沒有產(chǎn)生能打開信標探針發(fā)夾構(gòu)型的Helper，信標探針呈發(fā)卡構(gòu)型，MB和Fc距離電極較近，產(chǎn)生的信號很大，電信號具體分別為1.43μA和1.01μA，對應檢測到的濃度分別為0ppb和0ppb。

實施例2

a、金電極首先在粒徑為0.3μm的氧化鋁漿和粒徑為0.05μm的氧化鋁漿中依次進行拋光處理，直到呈鏡面，將電極浸泡在20mL體積比為3:1的H₂SO₄和H₂O₂的混合液中，孵育20min后用超純水徹底洗滌；

b、將共6μL的XB溶液(10μM的XB1：2μL和10μM的XB2：4μL)滴加到步驟a處理后的電極表面，在常溫下孵育2h，信標探針XB通過Au-S鍵將巰基鏈固定到電極表面。

c、修飾MCH用以封閉未特異性結(jié)合的位點。

d、均相反應中的主要步驟：

1、將2μL 100nM的HAP1和2μL 100nM的HAP2和20μL的濃度1×的Phi29DNA聚合酶的緩沖溶液分別加入到離心管中，加入過量的水胺硫磷(500ppb)，37℃孵育30min；

2、繼續(xù)向1步的離心管中加入2μL 100nM引物1與2μL 100nM引物2，加入1μL的濃度為10unitμL^-1的聚合酶、2μL的濃度為5mM的dNTP和1μL濃度為10unitμL^-1的Nb.BbvCI。震蕩30s放入37℃的恒溫箱中孵育1h。

e、將均相反應后的溶液滴加到預先修飾好XB的電極上。然后將電極繼續(xù)放在37℃的恒溫箱中孵育2h。

f、用磁力攪拌器在PBS溶液中清洗電極，每次10min，共清洗3次。

g、以Ag/AgCl為參比電極，以Pt電極為對電極，電位設(shè)置為-0.4到0.6V，脈沖寬度0.05V，脈沖寬度掃描為0.06S，采用差分脈沖伏安技術(shù)讀取MB和Fc電信號的變化。

h、其結(jié)果如附圖2的B圖所示，因加入過量的水胺硫磷，也就產(chǎn)生能打開HAP1發(fā)卡構(gòu)型，同時產(chǎn)生打開MB修飾的XB1發(fā)夾構(gòu)型的Helper1，使得MB遠離電極表面，MB信號明顯降低，而信標探針2呈發(fā)卡構(gòu)型，F(xiàn)c距離電極較近，產(chǎn)生的信號很大，電信號具體分別為0.14μA(MB)和0.98μA(Fc)，對應檢測到的濃度分別為500ppb(水胺硫磷)和0ppb(啶蟲脒)。

實施例3

a、金電極首先在粒徑為0.3μm的氧化鋁漿和粒徑為0.05μm的氧化鋁漿中依次進行拋光處理，直到呈鏡面，將電極浸泡在20mL體積比為3:1的H₂SO₄和H₂O₂的混合液中，孵育20min后用超純水徹底洗滌；

b、將共6μL的XB溶液(10μM的XB1：2μL和10μM的XB2：4μL)滴加到步驟a處理后的電極表面，在常溫下孵育2h，信標探針XB通過Au-S鍵將巰基鏈固定到電極表面。

c、修飾MCH用以封閉未特異性結(jié)合的位點。

d、均相反應中的主要步驟：

1、將2μL 100nM的HAP1和2μL 100nM的HAP2和20μL的濃度1×的Phi29DNA聚合酶的緩沖溶液分別加入到離心管中，加入過量的啶蟲脒(500ppb)，37℃孵育30min；

2、繼續(xù)向1步的離心管中加入2μL 100nM引物1與2μL 100nM引物2，加入1μL的濃度為10unitμL^-1的聚合酶、2μL的濃度為5mM的dNTP和1μL濃度為10unitμL^-1的Nb.BbvCI。震蕩30s放入37℃的恒溫箱中孵育1h。。

e、將均相反應后的溶液滴加到預先修飾好XB的電極上。然后將電極繼續(xù)放在37℃的恒溫箱中孵育2h。

f、用磁力攪拌器在PBS溶液中清洗電極，每次10min，共清洗3次。

g、以Ag/AgCl為參比電極，以Pt電極為對電極，電位設(shè)置為-0.4到0.6V，脈沖寬度0.05V，脈沖寬度掃描為0.06S，采用差分脈沖伏安技術(shù)讀取MB和Fc電信號的變化。

h、其結(jié)果如附圖2的C圖所示，因加入過量的啶蟲脒，也就產(chǎn)生能打開HAP2的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，同時產(chǎn)生打開Fc修飾的XB2發(fā)夾構(gòu)型的Helper2，使得Fc遠離電極表面，F(xiàn)c信號明顯降低，而信標探針1呈發(fā)卡構(gòu)型，MB距離電極較近，產(chǎn)生的信號很大，電信號具體分別為1.42μA(MB)和0.094(Fc)μA，對應檢測到的濃度分別為0ppb(水胺硫磷)和500ppb(啶蟲脒)。

實施例4

a、金電極首先在粒徑為0.3μm的氧化鋁漿和粒徑為0.05μm的氧化鋁漿中依次進行拋光處理，直到呈鏡面，將電極浸泡在20mL體積比為3:1的H₂SO₄和H₂O₂的混合液中，孵育20min后用超純水徹底洗滌；

b、將共6μL的XB溶液(10μM的XB1：2μL和10μM的XB2：4μL)滴加到步驟a處理后的電極表面，在常溫下孵育2h，信標探針XB通過Au-S鍵將巰基鏈固定到電極表面。

c、修飾MCH用以封閉未特異性結(jié)合的位點。

d、均相反應中的主要步驟：

1、將2μL 100nM的HAP1和2μL100nM的HAP2和20μL的濃度1×的Phi29DNA聚合酶的緩沖溶液分別加入到離心管中，加入過量的水胺硫磷和啶蟲脒，37℃孵育30min；

2、繼續(xù)向1步的離心管中加入2μL 100nM引物1與2μL 100nM引物2，加入1μL的濃度為10unitμL^-1的聚合酶、2μL的濃度為5mM的dNTP和1μL濃度為10unitμL^-1的Nb.BbvCI。震蕩30s放入37℃的恒溫箱中孵育1h。

e、將均相反應后的溶液滴加到預先修飾好XB的電極上。然后將電極繼續(xù)放在37℃的恒溫箱中孵育2h。

f、用磁力攪拌器在PBS溶液中清洗電極，每次10min，共清洗3次。

g、以Ag/AgCl為參比電極，以Pt電極為對電極，電位設(shè)置為-0.4到0.6V，脈沖寬度0.05V，脈沖寬度掃描為0.06S，采用差分脈沖伏安技術(shù)讀取MB和Fc電信號的變化。

h、其結(jié)果如附圖2的D圖所示，因加入過量的水胺硫磷和啶蟲脒，也就產(chǎn)生能打開HAP1和HAP2的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，同時產(chǎn)生打開信標探針發(fā)夾構(gòu)型的Helper1和Helper2，使得MB和Fc遠離電極表面，MB和Fc信號都明顯降低，電信號具體分別為0.13μA(MB)和0.097μA(Fc)，對應檢測到的濃度分別為500ppb(水胺硫磷)和500ppb(啶蟲脒)。

實施例5

a、10支金電極首先在粒徑為0.3μm的氧化鋁漿和粒徑為0.05μm的氧化鋁漿中依次進行拋光處理，直到呈鏡面，將電極浸泡在20mL體積比為3:1的H₂SO₄和H₂O₂的混合液中，孵育20min后用超純水徹底洗滌；

b、將共6μL的XB溶液(10μM的XB 1：2μL和10μM的XB 2：4μL)滴加到步驟a處理后的10支電極表面，在常溫下孵育2h，信標探針XB通過Au-S鍵將巰基鏈固定到電極表面。

c、修飾MCH用以封閉未特異性結(jié)合的位點。

d、均相反應中的主要步驟：

1、將2μL 100nM的HAP1和2μL 100nM的HAP2和20μL的濃度1×的Phi29DNA聚合酶的緩沖溶液分別加入到10支離心管中，向10支離心管中加入不同量的的水胺硫磷和啶蟲脒(0ppb和0ppb(a)，0.5ppb和0.5ppb(b)，1.0ppb和1.0ppb(c)，5ppb和5ppb(d)，10ppb和10ppb(e)，50ppb和50ppb(f)，100ppb和100ppb(g)，500ppb和500ppb(h))，37℃孵育30min；

2、繼續(xù)向1步的離心管中加入2μL 100nM引物1與2μL 100nM引物2，加入1μL的濃度為10unitμL^-1的聚合酶、2μL的濃度為5mM的dNTP和1μL濃度為10unitμL^-1的Nb.BbvCI。震蕩30s放入37℃的恒溫箱中孵育1h。

e、將均相反應后的溶液滴加分別依次修飾到到c步驟處理好的10支電極上。然后將電極繼續(xù)放在37℃的恒溫箱中孵育2h。

f、用磁力攪拌器在PBS溶液中清洗電極，每次10min，共清洗3次。

g、以Ag/AgCl為參比電極，以Pt電極為對電極，電位設(shè)置為-0.4到0.6V，脈沖寬度0.05V，脈沖寬度掃描為0.06S，采用差分脈沖伏安技術(shù)讀取MB和Fc電信號的變化。

h、其結(jié)果如附圖3所示，因加入不同量的水胺硫磷和啶蟲脒，也就產(chǎn)生能打開不同量HAP1和HAP2的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，同時產(chǎn)生不同量的打開信標探針發(fā)夾構(gòu)型的Helper1和Helper2，使得MB和Fc遠離電極表面的程度也不同，MB和Fc信號隨水胺硫磷和啶蟲脒量的增多而依次降低，水胺硫磷電信號具體分別為1.43μA,1.40μA,1.14μA,0.89μA,0.67μA,0.36μA,0.16μA和0.13μA，對應檢測到的濃度分別為0ppb,0.5ppb，1.0ppb，5ppb，10ppb，50ppb，100ppb，500ppb。啶蟲脒電信號具體分別為1.01μA,0.96μA,0.81μA,0.63μA,0.46μA,0.26μA,0.12μA和0.097μA，對應檢測到的濃度分別為0ppb,0.5ppb，1.0ppb，5ppb，10ppb，50ppb，100ppb，500ppb。

在附圖3中同時可看出，該傳感器可同時檢測0.5到100ppb的水胺硫磷和啶蟲脒，水胺硫磷和啶蟲脒檢出限分別是0.12和0.37ppb。

本發(fā)明上述涉及的基因和氨基酸序列具體如下：

SEQ ID NO.1：發(fā)卡HAP1的基因序列

來源：人工合成

AGCTTGCTGCAGCGATTCTTGATCGCCACAGAGCTGCTGAGGTGGAGGCAAGCT

SEQ ID NO.2：發(fā)卡HAP2的基因序列

來源：人工合成

CTGACACCATATTATGAAGAGCTGAGGGTCGTTGTCAG

SEQ ID NO.3：引物1的基因序列

來源：人工合成

AGCTTGCCT

SEQ ID NO.4：引物2的基因序列

來源：人工合成

CTGACAACG

SEQ ID NO.5：信標探針XB1

來源：人工合成

SH-GAGGTAAGCCTCCACCTC-MB

SEQ ID NO.6：信標探針XB2

來源：人工合成

SH-GAGGGAACAACGACCCTC-Fc

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受實施例的限制，其它任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所做的改變、修飾、組合、替代、簡化均應為等效替換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江省農(nóng)業(yè)科學院

<120> 同時檢測水胺硫磷和啶蟲脒的電化學傳感器及其方法體系

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

agcttgctgc agcgattctt gatcgccaca gagctgctga ggtggaggca agct 54

<210> 2

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

ctgacaccat attatgaaga gctgagggtc gttgtcag 38

<210> 3

<211> 9

<212> DNA

<213> 引物2

<400> 3

agcttgcct 9

<210> 4

<211> 9

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

ctgacaacg 9

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

gaggtaagcc tccacctc 18

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

gagggaacaa cgaccctc 18