本發(fā)明涉及分子印跡制備領(lǐng)域，尤其涉及一種用于檢測(cè)新霉素的新霉素分子印跡-量子點(diǎn)聚合物及制備方法。

背景技術(shù)：

氨基糖苷類抗生素便宜、廣譜抗菌，可預(yù)防動(dòng)物發(fā)病，并具有促進(jìn)動(dòng)物生長的作用，在我國廣泛用于畜牧業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中，最常使用的氨基糖苷類獸藥包括新霉素、慶大霉素、鏈霉素、二氫鏈霉素等。其中新霉素具有耳毒性、腎毒性、神經(jīng)肌肉阻斷等毒性，大量使用新霉素還容易產(chǎn)生耐藥性。歐盟明確規(guī)定禁止使用新霉素作為家畜的生長促進(jìn)劑。為保障人群健康，我國、美國、歐盟均確定了對(duì)動(dòng)物源性食品中新霉素獸藥最大允許殘留限量。因此，如何快速準(zhǔn)確地測(cè)定食品中新霉素獸藥的殘留，對(duì)保證食品安全、保障人群健康具有重要意義。

目前用于食品中新霉素獸藥殘留的方法有微生物法、酶聯(lián)免疫(elisa)法、色譜法、質(zhì)譜法等。微生物法利用抗生素可以抑制細(xì)菌生長的特點(diǎn)，根據(jù)細(xì)菌生長狀況判斷樣品中是否存在抗生素，簡單，無需復(fù)雜的設(shè)備，但是不能區(qū)分具體的抗生素種類。elisa法屬于免疫分析方法，利用特定的抗體測(cè)定某種抗生素，操作簡單，快速，特異性強(qiáng)，但新霉素為小分子化合物，其抗體制備困難，且抗體穩(wěn)定性差，對(duì)熱、ph、鹽濃度等有嚴(yán)格要求，食品樣品需要經(jīng)過預(yù)處理，去除干擾物后，才能保證elisa檢測(cè)的靈敏度和特異性，不宜用于現(xiàn)場(chǎng)直接快速檢測(cè)。色譜法及質(zhì)譜法均可測(cè)定具體新霉素的種類和含量，但需要復(fù)雜的樣品前處理過程和昂貴的儀器設(shè)備，無法用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。特別是新霉素的結(jié)構(gòu)缺少生色基團(tuán)，在色譜檢測(cè)中需要采用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，或進(jìn)行衍生后利用熒光進(jìn)行測(cè)定。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器復(fù)雜昂貴，一般實(shí)驗(yàn)室不配備，且檢測(cè)靈敏度低。衍生法靈敏度高，但影響因素眾多，準(zhǔn)確性較低?？梢姡壳捌惹行枰煽焖贉?zhǔn)確地測(cè)定新霉素的新方法，以有效監(jiān)測(cè)新霉素殘留，保障人群健康。

熒光檢測(cè)是常用的快速檢測(cè)方法，靈敏度高，設(shè)備簡單，但是新霉素屬于無熒光基團(tuán)的化合物，無法使用熒光直接檢測(cè)。此外，熒光測(cè)定特異性較低，食品中的很多成分會(huì)干擾熒光檢測(cè)的準(zhǔn)確性。因此，需要一種可特異性結(jié)合靶抗生素，同時(shí)有效減少背景熒光干擾，且可以使用熒光測(cè)定不含熒光的新霉素的新方法。

人工抗體(又稱分子印跡聚合物，mip)是化學(xué)合成的高分子聚合物，通過特定的空間結(jié)構(gòu)和化學(xué)鍵(包括共價(jià)鍵、離子鍵、氫鍵等)特異性識(shí)別和結(jié)合靶分子，其吸附特異性與天然抗體類似，但耐受有機(jī)溶劑、離子、酸堿、高溫和高壓。其中含熒光的mip即熒光mip，不僅可以特異性結(jié)合模板分子，同時(shí)模板分子的結(jié)合還可以導(dǎo)致熒光mip發(fā)生熒光信號(hào)的改變(如熒光波長改變，或者熒光強(qiáng)度改變)，根據(jù)熒光信號(hào)的改變，即可測(cè)定與熒光mip特異性結(jié)合的模板分子的含量?？梢姡瑹晒鈓ip可以利用熒光信號(hào)測(cè)定無熒光的化合物，且mip與模板分子的特異性結(jié)合保證了熒光mip檢測(cè)的特異性，十分適合用于快速測(cè)定非熒光化合物，如參考文獻(xiàn)“y.wu,etal.monitoringbisphenolaanditsbiodegradationinwaterusingafluorescentmolecularlyimprintedchemosensor.chemosphere,2015,119:515-523”。

新霉素結(jié)構(gòu)上一般含兩個(gè)或兩個(gè)以上的氨基，并通過糖苷鍵進(jìn)行連接。苯硼酸及其衍生物能與糖類化合物(包括氨基糖苷類抗生素)的1,2-或1,3-二醇基團(tuán)以及多醇羥基相互共價(jià)鍵，這一反應(yīng)具有較高的特異性。量子點(diǎn)是半導(dǎo)體熒光納米材料，其熒光波譜有激發(fā)光譜寬，發(fā)射光譜窄，熒光強(qiáng)度高，不易發(fā)生熒光漂白等優(yōu)點(diǎn)。已有研究發(fā)現(xiàn)，在量子點(diǎn)表面利用苯硼酸衍生物作為功能單體，合成糖蛋白mip凝膠，可同時(shí)利用mip的空間識(shí)別力和苯硼酸-糖基親和結(jié)合力，提高mip對(duì)靶分子的結(jié)合特異性如文獻(xiàn)“wzhang,etal.afluorescencenanosensorforglycoproteinswithactivitybasedonthemolecularlyimprintedspatialstructureofthetargetandboronateaffinity.angew.chem.int.ed.2014,53,12489–12493”。但是該方法制備的mip只能測(cè)定稀釋了100倍的尿液中的靶蛋白質(zhì)，顯示該方法在存在高濃度干擾物的情況下檢測(cè)效果不佳，不適合用于復(fù)雜樣品的檢測(cè)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決以上問題，本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測(cè)新霉素的新霉素分子印跡-量子點(diǎn)聚合物及制備方法，該新霉素分子印跡-量子點(diǎn)聚合物能可特異、快速、靈敏、高通量地檢測(cè)新霉素含量，并提供用于檢測(cè)新霉素的試劑盒。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所設(shè)計(jì)技術(shù)方案包括：

用于檢測(cè)新霉素的新霉素分子印跡-量子點(diǎn)聚合物的制備方法，包括以下步驟，首先在量子點(diǎn)表面修飾二氧化硅殼層得到二氧化硅殼層量子點(diǎn)，然后在二氧化硅殼層量子點(diǎn)的表面修飾硅烷化苯硼酸和新霉素得到量子點(diǎn)復(fù)合物，最后將量子點(diǎn)復(fù)合物中新霉素洗脫下來得到具有新霉素空間識(shí)別位點(diǎn)和苯硼酸-糖基親和結(jié)合位點(diǎn)的新霉素分子印跡-量子點(diǎn)聚合物。

作為優(yōu)選方案，用于檢測(cè)新霉素的新霉素分子印跡-量子點(diǎn)聚合物的制備方法，具體包括以下步驟：

1)制備二氧化硅殼層量子點(diǎn)：

按質(zhì)量比，cdte-gsh量子點(diǎn)(qds)、水、無水乙醇、四乙氧基硅烷(teos)與氨水為0.1～1.0:4～10:35～45:0.6～1.0:1混合均勻，無氧條件下攪拌16～24h后收集顆粒，經(jīng)洗滌干燥后得到二氧化硅殼層量子點(diǎn)(qds@sio2)；

2)制備量子點(diǎn)復(fù)合物：

按摩爾比，新霉素與硅烷化苯硼酸為8～12:1溶于純水中，然后加入qds@sio2、表面活性劑、交聯(lián)劑與氨水，無氧條件下，室溫?cái)嚢?0～28h后得到量子點(diǎn)復(fù)合物；

3)洗脫新霉素：

利用ph為4.0～5.0的鹽酸溶液洗脫量子點(diǎn)復(fù)合物6～12次，每次洗脫30～50min，洗脫完畢后用純水洗滌，最后離心干燥即得新霉素分子印跡-量子點(diǎn)聚合物(新霉素mip-量子點(diǎn))。

作為優(yōu)選方案，所述表面活性劑為十六烷基三甲基溴化銨(ctab)，所述交聯(lián)劑為正硅酸乙酯(teos)。

用于檢測(cè)新霉素的新霉素分子印跡-量子點(diǎn)聚合物，所述新霉素分子印跡-量子點(diǎn)聚合物為根據(jù)以上新霉素分子印跡-量子點(diǎn)聚合物的制備方法制備獲得的。

新霉素檢測(cè)試劑盒，它包括新霉素分子印跡-量子點(diǎn)聚合物、新霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液以及硼酸硼砂緩沖液。

新霉素檢測(cè)試劑盒使用方法為：

步驟一：將新霉素分子印跡-量子點(diǎn)聚合物溶解于檢測(cè)液中得到新霉素mip-量子點(diǎn)溶液(0.025g/l),加入96孔酶標(biāo)板中，立刻在多功能酶標(biāo)儀上測(cè)定620nm處熒光強(qiáng)度(i0)。

步驟二：每孔加入10μl新霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品，反應(yīng)3h后在在多功能酶標(biāo)儀上測(cè)定620nm處熒光強(qiáng)度(i)。

步驟三：以i0/i為縱坐標(biāo)，新霉素濃度為橫坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)i0/i與新霉素濃度之間的線性關(guān)系，即可確定新霉素的濃度。

新霉素分子印跡-量子點(diǎn)聚合物在檢測(cè)樣品中新霉素含量的應(yīng)用。尤其是在檢測(cè)食品中新霉素含量的應(yīng)用。

本發(fā)明制備新霉素分子印跡-量子點(diǎn)聚合物的原理為：

在量子點(diǎn)表面修飾透明的多孔硅膠殼層，并在其上進(jìn)行分子印跡，得到多孔硅膠形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，可起到類似分子篩的功能，不僅可以有效地保護(hù)量子點(diǎn)在復(fù)雜體系中的熒光穩(wěn)定性(youngdokimetal.cdsequantumdot-encapsulatedmolecularlyimprintedmesoporoussilicaparticlesforfluorescentsensingofbisphenola.j.mater.chem.,2012,22,24075-24080)，還可以阻止大分子的蛋白質(zhì)等物質(zhì)進(jìn)入。為此，本發(fā)明采用的制備方案為：首先在量子點(diǎn)表面修飾二氧化硅殼層，然后利用硅烷化苯硼酸為功能單體，在二氧化硅殼層表面制備同時(shí)具有空間識(shí)別位點(diǎn)和苯硼酸-糖基親和結(jié)合位點(diǎn)的新霉素分子印跡-量子點(diǎn)聚合物，該新霉素分子印跡-量子點(diǎn)聚合物同時(shí)識(shí)別新霉素的空間結(jié)構(gòu)和其表面的糖苷鍵，并根據(jù)新霉素與新霉素分子印跡-量子點(diǎn)聚合物結(jié)合前后的熒光改變，準(zhǔn)確測(cè)定樣品中的新霉素含量。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：

該方法同時(shí)利用具有新霉素空間識(shí)別位點(diǎn)以及苯硼酸-糖基親和結(jié)合位點(diǎn)等多種結(jié)合力來提高熒光檢測(cè)的特異性，量子點(diǎn)熒光保證了檢測(cè)的靈敏度，并利用二氧化硅殼層的分子篩效應(yīng)，有效減少生物單分子進(jìn)入，從而提高熒光新霉素分子印跡-量子點(diǎn)聚合物檢測(cè)食品等復(fù)雜基質(zhì)中痕量的新霉素的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性，有效克服目前新霉素檢測(cè)靈敏度和穩(wěn)定性低、操作復(fù)雜等缺點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)快速、靈敏準(zhǔn)確地測(cè)定食品中新霉素含量，在農(nóng)業(yè)、食品、環(huán)境等學(xué)科中將有很大的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為本發(fā)明合成新霉素分子印跡-量子點(diǎn)聚合物的流程圖；

圖2a為量子點(diǎn)(qds)的掃描電鏡圖，圖2b為包被了二氧化硅的量子點(diǎn)(qds@sio2)的掃描電鏡圖，圖2c為新霉素mip-量子點(diǎn)的掃描電鏡圖，圖2d為nip-量子點(diǎn)(陰性對(duì)照)的掃描電鏡圖；

圖3為新霉素mip-量子點(diǎn)的傅里葉變換紅外光譜(ft-ir)圖。其中a線為量子點(diǎn)，b線為qds@sio2，c線為新霉素mip-量子點(diǎn)，d線為nip-量子點(diǎn)。其縱坐標(biāo)為透光度，橫坐標(biāo)為波數(shù)(厘米^-1)；

圖4為新霉素mip-量子點(diǎn)對(duì)不同氨基糖苷類抗生素的吸附特異性圖；縱坐標(biāo)為新霉素mip-量子點(diǎn)的熒光變化(i0/i)，橫坐標(biāo)為加入分析物的種類；

圖5新霉素mip-量子點(diǎn)在含空間干擾物時(shí)對(duì)新霉素的檢測(cè)特異性圖；

圖6為新霉素mip-量子點(diǎn)在含糖基位點(diǎn)干擾物時(shí)對(duì)新霉素的檢測(cè)特異性圖；

圖7為新霉素檢測(cè)試劑盒檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖8為多種干擾物(慶大霉素、阿米卡星、鏈霉素和d-葡萄糖)同時(shí)存在條件下，新霉素檢測(cè)試劑盒檢測(cè)新霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

具體實(shí)施方式

為更好地理解本發(fā)明，以下將結(jié)合附圖和具體實(shí)例對(duì)發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說明。

實(shí)施例1

結(jié)合圖1所示，新霉素分子印跡-量子點(diǎn)聚合物的制備方法是：

首先在量子點(diǎn)表面修飾二氧化硅殼層得到二氧化硅殼層量子點(diǎn)，然后在二氧化硅殼層量子點(diǎn)的表面修飾硅烷化苯硼酸和新霉素得到量子點(diǎn)復(fù)合物，最后將量子點(diǎn)復(fù)合物中新霉素洗脫下來得到具有新霉素空間識(shí)別位點(diǎn)和苯硼酸-糖基親和結(jié)合位點(diǎn)的新霉素分子印跡-量子點(diǎn)聚合物。具體方法包括以下步驟：

1)制備二氧化硅殼層量子點(diǎn)：

稱取0.4gcdte-gsh量子點(diǎn)(qds)溶于16ml純水中，然后加入80g無水乙醇、1.6g四乙氧基硅烷與2g氨水混合均勻，無氧條件下攪拌20h后收集顆粒，經(jīng)洗滌干燥后得到二氧化硅殼層量子點(diǎn)(qds@sio2)；

2)制備量子點(diǎn)復(fù)合物：

取10mol新霉素與1mol硅烷化苯硼酸，溶于純水中混合均勻后，加入20mgqds@sio2、0.2933gctab、20μlteos與300μl氨水，無氧條件下，室溫?cái)嚢?4h后得到量子點(diǎn)復(fù)合物；

3)洗脫新霉素：

利用ph為4.5的鹽酸溶液洗脫量子點(diǎn)復(fù)合物10次，每次洗脫40min，洗脫完畢后用純水洗滌6次，最后離心干燥即得新霉素分子印跡-量子點(diǎn)聚合物(新霉素mip-量子點(diǎn))。

制備對(duì)比例：空白印跡聚合物(nip-量子點(diǎn))的方法與以上新霉素mip-量子點(diǎn)的制備方法相同，不同在于步驟2)中不加入新霉素。

使用水熱法合成親水性cdte-gsh量子點(diǎn)(qds)：將cdcl2、gsh、na2teo3按摩爾比5:6:1的比例，加入過量nabh4，在ph＝10.5，溫度為110℃的蒸餾水中攪拌1h后，終止反應(yīng)，加入兩倍體積無水乙醇，混合后離心10min(4500rpm)，棄去上清，重復(fù)3次后置于真空干燥箱中干燥，得到粉末即為cdte-gsh量子點(diǎn)(qds)

實(shí)施例2

以下新霉素分子印跡-量子點(diǎn)聚合物簡寫新霉素mip-量子點(diǎn)。

新霉素mip-量子點(diǎn)的性能評(píng)價(jià)

1)形態(tài)評(píng)價(jià)：如圖2a～2d所示，透射電鏡分析顯示量子點(diǎn)的直徑約為3nm，qds@sio2的直徑約為9nm，新霉素mip-量子點(diǎn)的直徑約為25nm，mip層的厚度約為8nm。如圖3中a～d線所示，ft-ir顯示qds@sio2在1068cm^-1，795cm^-1和463cm^-1處有明顯的的吸收峰，分別代表si–o–si的非對(duì)稱伸縮振動(dòng)、對(duì)稱拉伸振動(dòng)和彎曲振動(dòng)，說明在量子點(diǎn)表面成功合成了sio2殼層。新霉素mip-量子點(diǎn)在在1402cm^-1(b-o)和1602cm^-1(c＝c)的吸收峰提示硅烷化苯硼酸功能單體的存在，證明本發(fā)明在qds@sio2的表面成功制備了mip層。

2)新霉素mip-量子點(diǎn)吸附容量評(píng)價(jià)：以scatchard曲線的斜率為平衡解離常數(shù)kd，以公式：[bond]/[free]＝-([bond]/kd)+(bmax/kd)，計(jì)算最大吸附容量bmax。

3)新霉素mip-量子點(diǎn)結(jié)合特異性評(píng)價(jià)：采用ipb(imprinting-inducedpromotionofbinding)值評(píng)價(jià)：ipb＝(cmip-cnip)/cnip×100％。其中，cmip為與新霉素mip-量子點(diǎn)結(jié)合的靶抗生素量，cnip為與nip-量子點(diǎn)結(jié)合的靶抗生素量。結(jié)果見下表1:

表1新霉素mip-量子點(diǎn)的吸附特性

從表1可見，新霉素mip-量子點(diǎn)可以特異性識(shí)別新霉素，顯示本方法可以用于制備測(cè)定新霉素的mip-量子點(diǎn)。

實(shí)施例3

新霉素mip-量子點(diǎn)對(duì)新霉素的檢測(cè)特異性

各種氨基糖苷類抗生素結(jié)構(gòu)類似，有可能會(huì)干擾mip與模板分子的結(jié)合特異性。為此，進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)：

新霉素mip-量子點(diǎn)對(duì)不同抗生素的檢測(cè)特異性：首先將190μl新霉素mip-量子點(diǎn)溶液(0.025g/l)加入96孔酶標(biāo)板中，立刻在多功能酶標(biāo)儀上測(cè)定620nm處熒光強(qiáng)度(i0)。每孔加入10μl新霉素(500μg/l)，或慶大霉素+阿米卡星+鏈霉素+混合溶液，反應(yīng)3小時(shí)后在多功能酶標(biāo)儀上測(cè)定在620nm處的熒光強(qiáng)度(i)。計(jì)算加樣前后的熒光變化值(i0/i)。結(jié)果如圖4所示，新霉素對(duì)新霉素mip-量子點(diǎn)具有最強(qiáng)的熒光猝滅能力，而其它類似物所引起新霉素mip-量子點(diǎn)的熒光變化值(i0/i)與nip-量子點(diǎn)無顯著差別，同時(shí)，新霉素mip-量子點(diǎn)的熒光變化值(i0/i)較nip-量子點(diǎn)大，且小于新霉素所導(dǎo)致的熒光變化，說明新霉素mip-量子點(diǎn)可特異性結(jié)合新霉素，對(duì)其他結(jié)構(gòu)類似的抗生素吸附力很低。

實(shí)施例4

新霉素mip-量子點(diǎn)在含結(jié)構(gòu)類似物時(shí)，檢測(cè)新霉素的特異性

實(shí)施例3在分析了新霉素mip-量子點(diǎn)單獨(dú)對(duì)某種抗生素結(jié)合特異性的基礎(chǔ)上，分析新霉素mip-量子點(diǎn)在多種結(jié)構(gòu)類似的抗生素(即存在空間結(jié)構(gòu)干擾物時(shí))，新霉素mip-量子點(diǎn)與新霉素的結(jié)合特異性。

新霉素mip-量子點(diǎn)在含空間干擾物時(shí)對(duì)新霉素的檢測(cè)特異性：將190μl新霉素mip-量子點(diǎn)溶液(0.025g/l)加入96孔酶標(biāo)板中，立刻在多功能酶標(biāo)儀上測(cè)定620nm處熒光強(qiáng)度(i0)。每孔加入不同組合的抗生素混合液10μl(其中新霉素100μg/l，慶大霉素分別為0,10,100,500μg/l)，反應(yīng)3小時(shí)后在多功能酶標(biāo)儀上測(cè)定在620nm處的熒光強(qiáng)度(i)。如圖5所示，結(jié)果表明在不同濃度慶大霉素存在條件下，新霉素mip-量子點(diǎn)的熒光改變(i0/i)無明顯差異，說明慶大霉素的存在不影響新霉素mip-量子點(diǎn)對(duì)新霉素的準(zhǔn)確定量。

實(shí)施例5

新霉素mip-量子點(diǎn)在含不同濃度糖基位點(diǎn)干擾物時(shí)，檢測(cè)新霉素的特異性。

糖類化合物可能會(huì)干擾新霉素mip上苯硼酸-糖基親和結(jié)合力，為此，分析存在糖基干擾物時(shí)，新霉素mip-量子點(diǎn)與模板分子的結(jié)合特異性。

新霉素mip-量子點(diǎn)在含糖基位點(diǎn)干擾物時(shí)對(duì)新霉素的檢測(cè)特異性：將190μl新霉素mip-量子點(diǎn)溶液(0.025g/l)加入96孔酶標(biāo)板中，立刻在多功能酶標(biāo)儀上測(cè)定620nm處熒光強(qiáng)度(i0)。然后每孔分別加入10μl含新霉素和(100μg/l)和不同濃度的d-葡糖溶液(0,10,100,500μg/l)的混合液，反應(yīng)3小時(shí)后在多功能酶標(biāo)儀上測(cè)定在620nm處的熒光強(qiáng)度(i)。比較加入混合液前后的熒光變化值(i0/i)。圖6所示，含d-葡萄糖的存在不影響新霉素mip-量子點(diǎn)對(duì)新霉素的特異性結(jié)合。

實(shí)施例6

新霉素檢測(cè)試劑盒的靈敏度分析

(1)新霉素檢測(cè)試劑盒對(duì)新霉素檢測(cè)的靈敏度

將新霉素mip-量子點(diǎn)用硼酸硼砂緩沖液(ph＝9.0,0.02mol/l)稀釋至0.025g/l，取190μl新霉素mip-量子點(diǎn)溶液加入96孔酶標(biāo)板中，立刻在多功能酶標(biāo)儀上測(cè)定620nm處熒光強(qiáng)度(i0)。每孔加入10μl新霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液(0,2,10,50,100,250,500,1000μg/l)，反應(yīng)3h后在在多功能酶標(biāo)儀上測(cè)定620nm處熒光強(qiáng)度(i)。如圖7，i0/i與新霉素濃度在2-1000μg/l范圍內(nèi)存線性關(guān)系，檢測(cè)靈敏度為0.7μg/l，說明利用本發(fā)明制備的試劑盒檢測(cè)線性范圍廣，靈敏度高，有望直接用于食品、環(huán)境和生物等實(shí)際樣品中低濃度新霉素含量的檢測(cè)分析(圖7)。

(2)干擾物對(duì)新霉素檢測(cè)試劑盒檢測(cè)靈敏度的影響

將190μl新霉素mip-量子點(diǎn)溶液(0.025g/l)加入96孔酶標(biāo)板中，立刻在多功能酶標(biāo)儀上測(cè)定620nm處熒光強(qiáng)度(i0)。每孔加入10μl不同濃度新霉素(0,2,10,50,100,250,500,1000μg/l)與干擾物(慶大霉素、阿米卡星和鏈霉素均為100μg/l，d-葡萄糖為25μg/l)的混合液，反應(yīng)3小時(shí)后在多功能酶標(biāo)儀上測(cè)定在620nm處的熒光強(qiáng)度(i)。比較加入混合液前后的熒光變化值(i0/i)。如圖8，結(jié)果表明干擾物不影響新霉素mip-量子點(diǎn)對(duì)新霉素的檢測(cè)靈敏度(圖8)。

實(shí)施例7

新霉素檢測(cè)試劑盒的穩(wěn)定性分析

新霉素檢測(cè)試劑盒檢測(cè)不同濃度新霉素標(biāo)準(zhǔn)液，新霉素的加標(biāo)回收率在94.2-106.7％，日內(nèi)偏差為8.1-9.5％(n＝6)，日間偏差為2.1-8.3％(n＝5)，組間差異為2.3-5.6％。

實(shí)施例8

利用新霉素檢測(cè)試劑盒測(cè)定各種樣品中的新霉素；

1)牛奶樣品：

方法1：牛奶樣品中加入10％三氯乙酸(tca)作用3h，離心后，部分上清液氮?dú)獯蹈珊螅门鹚崤鹕熬彌_液(ph＝9.0,0.02mol/l)定容后，用新霉素mip-量子點(diǎn)法檢測(cè)新霉素含量。部分上清液利用商品化固相萃取(spe)進(jìn)行固相萃取凈化樣品后，衍生后用hplc-fld測(cè)定新霉素含量。如表2所示，新霉素mip-量子點(diǎn)法可測(cè)定20μg/kg-400μg/kg的新霉素、而hplc-fld僅能測(cè)定100μg/kg-400μg/kg的新霉素?？梢姡m然樣品未經(jīng)過固相萃取凈化，新霉素mip-量子點(diǎn)法仍然可以測(cè)定樣品中低濃度的新霉素，其檢測(cè)靈敏度高于hplc-fld法。新霉素mip-量子點(diǎn)可以快速準(zhǔn)確地測(cè)定不同濃度的新霉素。(表2)

方法2：牛奶樣品離心后去除上層脂肪，再用3mol/l鹽酸調(diào)節(jié)樣品ph＝4.6，離心后使用mip-量子點(diǎn)法測(cè)定上清中新霉素的含量。由于本方法僅通過調(diào)節(jié)ph使牛奶中大部分的酪蛋白沉淀，但上清液中仍有少量的其他蛋白存在，不能直接使用hplc測(cè)定，以免造成hplc管路堵塞。結(jié)果表明新霉素mip-量子點(diǎn)法的加標(biāo)回收率為75.9-110.7％，rsd為10.4-15.9％?？梢?，新霉素mip-量子點(diǎn)法可準(zhǔn)確測(cè)定僅經(jīng)簡單處理、無法使用hplc測(cè)定的牛奶樣品，新霉素mip-量子點(diǎn)法可用于快速測(cè)定食品中的痕量新霉素(表2)

肌肉類樣品(雞肉、豬肉、魚肉)

肌肉組織中含有肌糖原，可以干擾mip上的苯硼酸-糖基親和位點(diǎn)與新霉素含量的結(jié)合。雞肉、豬肉、魚肉勻漿樣品中，分別加入10％三氯乙酸(tca)作用3h，離心后，部分上清液氮?dú)獯蹈珊?，用硼酸硼砂緩沖液(ph＝9.0,0.02mol/l)定容，用新霉素mip-量子點(diǎn)法檢測(cè)新霉素含量。部分上清液，利用商品化固相萃取柱(安捷倫ppl固相萃取柱)凈化樣品后，衍生后用hplc-fld測(cè)定新霉素含量。如表2所示，新霉素mip-量子點(diǎn)法可測(cè)定20μg/kg-400μg/kg的新霉素，而hplc-fld僅能測(cè)定100μg/kg-400μg/kg的新霉素?？梢姡m然樣品未經(jīng)過固相萃取凈化，新霉素mip-量子點(diǎn)法在多種干擾物存在時(shí)仍然可以測(cè)定肌肉樣品中低濃度的新霉素含量，其檢測(cè)靈敏度高于hplc-fld法。新霉素mip-量子點(diǎn)可以快速準(zhǔn)確地測(cè)定肌肉組織中不同濃度的新霉素。(表2)

動(dòng)物肝臟樣品

動(dòng)物肝臟中含有大量的肝糖原，可以干擾新霉素mip-量子點(diǎn)中的苯硼酸-糖基親和位點(diǎn)與新霉素的結(jié)合。為此，在豬肝、魚肝的勻漿樣品中，分別加入10％三氯乙酸(tca)作用3h，離心后，部分上清液氮?dú)獯蹈珊?，用硼酸硼砂緩沖液(ph＝9.0,0.02mol/l)定容，用新霉素mip-量子點(diǎn)法檢測(cè)新霉素含量。部分上清液，利用商品化固相萃取柱(安捷倫ppl固相萃取柱)凈化樣品后，衍生后用hplc-fld測(cè)定新霉素含量。如表2所示，新霉素mip-量子點(diǎn)法可測(cè)定20μg/kg-400μg/kg的新霉素，而hplc-fld僅能測(cè)定100μg/kg-400μg/kg的新霉素?？梢姡m然樣品未經(jīng)過固相萃取凈化，新霉素mip-量子點(diǎn)法仍然可以測(cè)定肝臟樣品中低濃度的新霉素含量，其檢測(cè)靈敏度高于hplc-fld法(表2)

動(dòng)物腎樣品

在豬腎勻漿樣品中，分別加入10％三氯乙酸(tca)作用3h，離心后，部分上清液氮?dú)獯蹈珊?，用硼酸硼砂緩沖液(ph＝9.0,0.02mol/l)定容，用新霉素mip-量子點(diǎn)法檢測(cè)新霉素含量。部分上清液，利用商品化固相萃取柱(安捷倫ppl固相萃取柱)凈化樣品后，衍生后用hplc-fld測(cè)定新霉素含量。結(jié)果顯示，新霉素mip-量子點(diǎn)法可測(cè)定20μg/kg-400μg/kg的新霉素含量，而hplc-fld僅能測(cè)定100μg/kg-400μg/kg的新霉素含量?？梢?，雖然樣品未經(jīng)過固相萃取凈化，新霉素mip-量子點(diǎn)法仍然可以測(cè)定腎臟樣品中低濃度的新霉素含量，其檢測(cè)靈敏度高于hplc-fld法。新霉素mip-量子點(diǎn)可以快速準(zhǔn)確地測(cè)定豬腎中不同濃度的新霉素含量(表2)

具體結(jié)果見下表2。從表中可以看出，在加標(biāo)濃度為100-400μg/kg時(shí)，新霉素檢測(cè)試劑盒與hplc-fld法檢測(cè)結(jié)果相當(dāng)(經(jīng)配對(duì)t檢驗(yàn)，p>0.05，兩種方法測(cè)定結(jié)果無顯著性差異)。新霉素檢測(cè)試劑盒可以檢測(cè)出低濃度(20μg/kg)樣品中的新霉素，而hplc-fld無法檢測(cè)出，說明新霉素mip-量子點(diǎn)法的檢測(cè)靈敏度高于hplc-fld。

表2不同方法測(cè)定各種樣品中的新霉素

本發(fā)明的范圍不受所述具體實(shí)施方案的限制，所述實(shí)施方案只作為闡明本發(fā)明各個(gè)方面的單個(gè)例子，本發(fā)明范圍內(nèi)還包括功能等同的方法和組分。實(shí)際上，除了本文所述的內(nèi)容外，本領(lǐng)域技術(shù)人員參照上文的描述和附圖可以容易地掌握對(duì)本發(fā)明的多種改進(jìn)。所述改進(jìn)也落入所附權(quán)利要求書的范圍之內(nèi)。上文提及的每篇參考文獻(xiàn)皆全文列入本文作為參考。