本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體而言，涉及用于檢測(cè)結(jié)核感染t細(xì)胞的抗原、試劑盒及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：結(jié)核病是主要經(jīng)呼吸道傳播的、嚴(yán)重危害我國和全世界的重要傳染病之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織，全世界有17-20億的結(jié)核分枝桿菌感染者，每年至少200萬人死于本病(謝建平，結(jié)核分枝桿菌功能基因組研究的方法學(xué)，微生物通報(bào).2001.28(5):92-97)。因此，準(zhǔn)確篩檢感染者的方法在結(jié)核病的防治甚至最終的消滅中扮演極其重要的作用?，F(xiàn)有的診斷技術(shù)對(duì)結(jié)核分枝桿菌感染者的診斷非常難。近幾十年來，臨床上采用結(jié)核菌素試驗(yàn)(tst)來診斷結(jié)核分枝桿菌感染者。但tst活性成份是純蛋白衍生物(purifiedproteinderivativeoftubercμlin，ppd)，是結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)上清液的粗提物，含有200多種成分，與卡介苗(bacilluscalmette-guerin，bcg)接種和環(huán)境分枝桿菌感染存在交叉反應(yīng)。tst檢測(cè)結(jié)果可被現(xiàn)在臨床廣泛使用的疫苗—卡介苗免疫所干擾[p.andersen，etal.lancet356(2000)1099-1104.]。從1921年及明卡介苗到現(xiàn)在為止，全世界已有35億人接種卡介苗。因此tst對(duì)感染者的診斷價(jià)值受到很大的影響，導(dǎo)致tst診斷的準(zhǔn)確性較低，因此我們無法根據(jù)其結(jié)果判斷是否真正存在結(jié)核分枝桿菌感染。對(duì)結(jié)核病病人的診斷技術(shù)中，痰涂片抗酸染色或痰菌培養(yǎng)，培養(yǎng)困難，耗時(shí)較長(zhǎng)；肺部x射線檢查肺部病理改變，也僅在具有典型的臨床癥狀后才能診斷；其他血清學(xué)診斷方法和分子診斷方法缺乏特異性，假陽性率較高。有關(guān)研究人員指出，不同診斷性檢查方法的敏感性和特異性如下：分枝桿菌培養(yǎng)(分別為73％和100％)；pcr(分別為42％和100％)；胸部x線(分別為67％～77％和66％～76％)；結(jié)核菌素試驗(yàn)(分別為94％和20％)；血清學(xué)(分別為33％和87％)。由此可見，現(xiàn)有的分枝桿菌檢測(cè)方法的敏感性和特異性無法同時(shí)達(dá)到最優(yōu)。結(jié)核分枝桿菌感染人體后，首先會(huì)被人體的免疫系統(tǒng)識(shí)別，激活機(jī)體的t細(xì)胞免疫應(yīng)答，分泌產(chǎn)生γ干擾素(ifn-γ)，后者發(fā)揮抗結(jié)核感染作用。部分t細(xì)胞轉(zhuǎn)化為免疫記憶細(xì)胞，當(dāng)再次與結(jié)核分枝桿菌相遇后，會(huì)再次分泌產(chǎn)生ifn-γ，發(fā)揮抗結(jié)核感染作用。抗原特異的ifn-γ產(chǎn)生量與機(jī)體是否感染或發(fā)病密切相關(guān)。因此，如果采用結(jié)核分枝桿菌特異的抗原在體外刺激感染者和患者的t細(xì)胞，可誘導(dǎo)這些t細(xì)胞產(chǎn)生高水平的結(jié)核分枝桿菌特異的ifn-γ，而非結(jié)核分枝桿菌感染者或非結(jié)核病患者產(chǎn)生的ifn-γ的量與未用抗原刺激產(chǎn)生的量相近，從而實(shí)現(xiàn)診斷的目的。由此可見，尋找并發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌特異性抗原，對(duì)發(fā)展新一代的診斷試劑具有重要價(jià)值和意義。1996年，stover等通過減數(shù)雜交的方法確定了bcg在體外傳代過程中丟失的域，定義為缺失區(qū)(regionofdifference，rd)，rd區(qū)域存在于結(jié)核分枝桿菌中，而在bcg和大多數(shù)環(huán)境分枝桿菌中缺失[程渝,李茂全.結(jié)核分枝桿菌的實(shí)驗(yàn)室診斷進(jìn)展.國外醫(yī)學(xué)臨床生物化學(xué)和檢驗(yàn)學(xué)分冊(cè).2002；23(6)：342-343.]。其中，rd1區(qū)域編碼的早期分抗原靶6kd(earlysecretingantigentarget6kd，esat-6)和培養(yǎng)濾液蛋白10kd(cμltufiltrateprotein10kd，cfp-10)是兩種小分子量分泌蛋白，它們是t細(xì)胞最主要的抗原之一，可以誘導(dǎo)較強(qiáng)的細(xì)胞免疫反應(yīng)。對(duì)于兒童或者免疫低下樣本，有文獻(xiàn)報(bào)道，僅以esat-6和cfp-10或其多肽作為刺激原，其靈敏度約為73.5％-88.9％(孫琳，elispot檢測(cè)技術(shù)在兒童結(jié)核病診斷中的應(yīng)用，標(biāo)記免疫分析與臨床.2008.6:349-353；鐘華清，干擾素-γ釋放試驗(yàn)在兒童結(jié)核感染中的應(yīng)用價(jià)值，檢驗(yàn)醫(yī)學(xué).2016.3:176-179；李海，應(yīng)用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法快速診斷兒童結(jié)核分枝桿菌感染的研究，中國婦幼保健，2012.11:1703-1706)。對(duì)于一些特殊樣本，如兒童、免疫低下及新近感染樣本，esat-6和cfp-10多肽及衍生物試劑盒結(jié)核分枝桿菌樣本檢出依然不高，仍不能滿足臨床需求。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對(duì)現(xiàn)有檢測(cè)方法對(duì)于一些特殊樣本，如兒童、免疫低下及新近感染結(jié)核分枝桿菌樣本的檢出不足，本發(fā)明的目的在于提供一種用于檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌感染t細(xì)胞的抗原組合物，該抗原組合物特異性刺激結(jié)核分枝桿菌感染的新鮮全血，能特異性的分泌ifn-γ，增加檢測(cè)靈敏度，有效提高檢出率，有效避免漏檢。一種用于檢測(cè)結(jié)核感染t細(xì)胞的抗原組合物，該抗原組合物包括esat-6、cfp-10和含有氨基酸序列如seqidno.1～seqidno.29中所示的任八條多肽或任八條以上的多肽組合。如上所述的的抗原組合物，優(yōu)選地，所述的八條多肽或任八條以上的多肽組合采用與所述seqidno.1～seqidno.29中任一所示序列具有85％及以上同源性的多肽，或采用esat-6-cfp-10替換所述esat-6、cfp-10。如上所述的抗原組合物，優(yōu)選地，所述esat-6的氨基酸序列如seqidno.30所示，所述cfp-10的氨基酸序列如seqidno.31所示，所述esat-6-cfp-10的氨基酸序列如seqidno.32所示。如上所述的抗原組合物，優(yōu)選地，所述多肽是人工合成的或是天然分離的。一種用于檢測(cè)結(jié)核感染t細(xì)胞的試劑盒，包括如上所述的抗原組合物和檢測(cè)γ-干擾素的試劑。如上所述的試劑盒，優(yōu)選地，所述檢測(cè)γ-干擾素的試劑包括酶聯(lián)免疫吸附試劑、化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)試劑、免疫熒光檢測(cè)試劑。如上所述試劑盒的應(yīng)用，用于檢測(cè)t細(xì)胞經(jīng)過如上所述的抗原組合物刺激后分泌的細(xì)胞因子，所述細(xì)胞因子為γ-干擾素。如上所述試劑盒的應(yīng)用，優(yōu)選地，所述t細(xì)胞來源于外周血、腦脊液、胸水或腹水。如上所述試劑盒的應(yīng)用，優(yōu)選地，所述抗原組合物中所述esat-6和cfp-10或所述esat-6-cfp-10的終濃度各為4～200μg/ml，所述多肽的終濃度為40～1000μg/ml。如上所述試劑盒的應(yīng)用，優(yōu)選地，所述檢測(cè)γ-干擾素的試劑還包括用磷酸鹽緩沖液作陰性對(duì)照，其檢測(cè)結(jié)果記為n；用所述抗原組合物作為體外刺激物，其檢測(cè)結(jié)果記為t；用外源凝集素和牛血清白蛋白作陽性對(duì)照，其檢測(cè)結(jié)果記為p。如上所述試劑盒的應(yīng)用，優(yōu)選地，對(duì)于所述γ-干擾素的含量，檢測(cè)結(jié)果t-n≥0.15～0.5iu/ml，判斷感染結(jié)核分枝桿菌；檢測(cè)結(jié)果t-n＜0.15～0.5iu/ml，判斷未感染結(jié)核分枝桿菌。本發(fā)明提供的用于檢測(cè)結(jié)核t細(xì)胞的抗原及試劑盒，具有以下特點(diǎn)：(1)免疫低下樣本陽性檢出率高，靈敏度高。針對(duì)現(xiàn)有檢測(cè)方法對(duì)于一些特殊樣本，如兒童、免疫低下及新近感染樣本或潛伏感染者的檢出不足，本發(fā)明提供用于敏感性和特異性高的結(jié)核分枝桿菌感染的抗原多肽組合，該多肽組合合并esat-6和cfp-10，實(shí)現(xiàn)對(duì)結(jié)核病病人或早期感染者或潛伏感染者(未出現(xiàn)結(jié)核病病癥)的快速、特異的檢測(cè)，在阻斷結(jié)核病的傳播和流行，以及對(duì)結(jié)核病的控制具有重大意義。采用本發(fā)明的多肽組合結(jié)合esat-6和cfp-10進(jìn)行新鮮全血樣本刺激，具有良好的診斷符合率。(2)檢測(cè)用時(shí)短，操作方便，診斷快速。與傳統(tǒng)結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)相比，利用本發(fā)明提供的多肽組合物合并ifn-γ的特異性抗原蛋白檢測(cè)用時(shí)短，診斷快速。傳統(tǒng)結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)診斷需時(shí)間1-2月，tst檢測(cè)需要3天，本發(fā)明全部檢測(cè)時(shí)間在1-2天內(nèi)可完成。(3)對(duì)結(jié)核分枝桿菌感染能進(jìn)行早期檢測(cè)。由于結(jié)核分枝桿菌一旦感染人體，首先就被機(jī)體的免疫系統(tǒng)所識(shí)別，激活體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，發(fā)病時(shí)間在感染后1-2個(gè)月，因此，利用本發(fā)明提供的多肽池合并全血ifn-γ的特異性抗原蛋白的細(xì)胞免疫學(xué)檢測(cè)方法即可快速做出診斷，診斷出樣本是否感染結(jié)核分枝感染。而現(xiàn)有的技術(shù)中，x光片診斷只有在感染者肺部出現(xiàn)明顯的病理改變后才可做出診斷，這通常需要很長(zhǎng)的時(shí)間。抗原抗體檢測(cè)也只有在疾病癥狀處于活動(dòng)期的情況下檢測(cè)，但環(huán)境中分枝桿菌廣泛存在，其與結(jié)核分枝桿菌的共同抗原，可干擾實(shí)驗(yàn)的診斷結(jié)果。可見，本發(fā)明對(duì)結(jié)核分枝桿菌新近感染或免疫低下者的早期檢測(cè)有重要意義，對(duì)結(jié)核病的控制和消滅具有積極的意義。本發(fā)明還提供了一種用于結(jié)核分枝桿菌感染檢測(cè)的方法，實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明可直接利用外周血進(jìn)行抗原刺激，無需分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明本發(fā)明用于結(jié)核分枝桿菌感染檢測(cè)具有較高的靈敏度和特異性，有效避免假陰性，且操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)成本較低，具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。具體實(shí)施方式本發(fā)明的檢測(cè)原理：機(jī)體感染結(jié)核分枝桿菌后，血液中所形成的“記憶性”t淋巴細(xì)胞，其會(huì)在再次接觸結(jié)核分枝桿菌的特異性抗原時(shí)，產(chǎn)生和分泌相應(yīng)的細(xì)胞因子(γ-干擾素)。通過對(duì)γ-干擾素的定量檢測(cè)，可以判斷是否存在針對(duì)結(jié)核分枝桿菌特異性的t淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)。根據(jù)這個(gè)原理，選取存在于結(jié)核分枝桿菌，但在卡介苗和大多數(shù)非結(jié)核分枝桿菌中普遍缺失的esat-6、cfp-10及特異性多肽，應(yīng)用基因工程技術(shù)將esat-6和cfp-10融合表達(dá)，和特異性多肽片段共同成為檢測(cè)試劑盒中應(yīng)用的結(jié)核分枝桿菌特異性刺激抗原，與新鮮采取的淋巴細(xì)胞充分混合后孵育，收集血漿，應(yīng)用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法原理檢測(cè)淋巴細(xì)胞中γ-干擾素的濃度，計(jì)算樣品中γ-干擾素的濃度，從而判斷是否感染結(jié)核分枝桿菌。本發(fā)明提供的特異性多肽，合并esat-6和cfp-10組成試劑盒的特異性刺激部分，可以提高對(duì)一些特殊樣本，如兒童、免疫低下及新近感染樣本的檢出率。其中，t淋巴細(xì)胞來源于外周血、腦脊液、胸水或腹水，本發(fā)明以肝素抗凝的全血為例來說明本發(fā)明。以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但是本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于這些實(shí)施例。凡是不背離本發(fā)明構(gòu)思的改變或等同替代均包括在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。下列實(shí)施例中未特別說明的具體條件的實(shí)驗(yàn)方法是按常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法；試驗(yàn)試劑如無特別說明均為市售購買產(chǎn)品。以下所用的市售試劑盒為武漢海吉力生物科技有限公司的結(jié)核分枝桿菌特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫法)；本發(fā)明所涉及的結(jié)核感染樣本為志愿者病例，其篩選標(biāo)準(zhǔn)為：根據(jù)衛(wèi)生部發(fā)布的《肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)》國家標(biāo)準(zhǔn)(ws288-2008)，臨床表現(xiàn)癥狀、體征及胸部影像學(xué)檢查診斷為肺結(jié)核的患者，其中細(xì)菌學(xué)陽性或陰性結(jié)核病患者是指臨床診斷為結(jié)核病的患者中，經(jīng)細(xì)菌學(xué)檢查(痰涂片抗酸染色顯微鏡檢查和/或羅氏固體培養(yǎng)基細(xì)菌固體培養(yǎng))陽性或陰性的結(jié)核病患者；以及肺外結(jié)核(如骨結(jié)核、腎結(jié)核、腸結(jié)核、淋巴結(jié)核等)患者。健康樣本為健康志愿者，其篩選標(biāo)準(zhǔn)為：無結(jié)核臨床癥狀、無其他疾病或感染。實(shí)施例1多肽刺激有效性篩選為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明篩選了致病結(jié)核分枝桿菌的特異性蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)中能針對(duì)淋巴細(xì)胞的結(jié)合位點(diǎn)的多肽，篩選的多肽均能特異性刺激結(jié)核分枝桿菌感染的病人新鮮全血特異性的分泌γ-干擾素(ifn-γ)。通過反復(fù)的臨床驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，這些多肽合并esat-6和cfp-10能提高檢測(cè)靈敏度，該合并刺激劑可特異性作用于結(jié)核分枝桿菌感染樣本的全血中的淋巴細(xì)胞表位，通過檢測(cè)全血中釋放的細(xì)胞因子ifn-γ，從而間接地反應(yīng)機(jī)體是否感染過結(jié)核分枝桿菌。發(fā)明人通過大量試驗(yàn)研究，最終獲得核苷酸序列如seqidno.1～seqidno.29所示的特異性多肽片段，任取其中的八種多肽與esat-6和cfp-10或esat-6-cfp-10結(jié)合使用，配制成刺激劑溶液，用于刺激新鮮全血，檢測(cè)刺激后全血中的γ-干擾素，可判斷全血是否感染結(jié)核分支桿菌。本發(fā)明的多肽片段，其氨基酸序列如下所示，這些多肽片段可通過人工合成的或是天然分離，本實(shí)施例及以下實(shí)施例中用的多肽是通過人工合成的，其中，seqidno.1～seqidno.5來自ag85b、seqidno.6來自mpt649、seqidno.7～seqidno.8來自rv1985c、seqidno.9～seqidno.10來自rv1989c、seqidno.11～seqidno.12來自rv3425、seqidno.13～seqidno.15來自rv3615，seqidno.16～seqno.19來自rv3873，seqidno.20～seqidno.22來自rv3878，seqidno.23來自rv3879c，seqidno.24～seqidno.26來自tb7.7、seqidno.27來自cfp-10，seqidno.28～seqidno.29來自esat-6。seqidno.1：rlwvycgngtpnelseqidno.2：lmigtaaavvlpglseqidno.3：vqfqsggnnspavyseqidno.4：mpvggqssfysdwyseqidno.5：saaiglsmagssamseqidno.6：yqsaipprgtqavvseqidno.7：rkafrraitrpthfseqidno.8：mvdpqldgpqlaalseqidno.9：llfpaiyladsaqaseqidno.10：avldlttpqareavseqidno.11：relaysvettaeslseqidno.12：vswtrsalsdlprwseqidno.13：algsslhtagvdlaseqidno.14：rlgvlashhdnaavseqidno.15：nvyltahnalgsslseqidno.16：alaavvelgsfdaaseqidno.17：lmagagpapmlaaaseqidno.18：aaldaqaveltarlseqidno.19：lmsqliekpvapsvseqidno.20：klaglvfpqppapiseqidno.21：qqaaqsaqggsgpmseqidno.22：vqmsqnaspiaqtiseqidno.23：msitrptgsyarqmseqidno.24：llaaadelvggppvseqidno.25：alaartllaaadelseqidno.26：ravaeshgvaavlfseqidno.27：aavvrfqeaankqkqelseqidno.28：vtsihslldegkqslseqidno.29：lldegkqsltkl。需要說明的是，與上述序列具有85％同源性的多肽均可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的。本發(fā)明所用的esat-6序列為seqidno.30:mteqqwnfagieaaasaiqgnvtsihslldegkqsltklaaawggsgseayqgvqqkwdatatelnnalqnlartiseagqamastegnvtgmfa；cfp-10序列為seqidno.31:maemktdaatlaqeagnferisgdlktqidqvestagslqgqwrgaagtaaqaavvrfqeaankqkqeldeistnirqagvqysradeeqqqalssqmgf；esat-6-cfp-10序列為seqidno.32：mteqqwnfagieaaasaiqgnvtsihslldegkqsltklaaawggsgseayqgvqqkwdatatelnnalqnlartiseagqamastegnvtgmfanvamaemktdaatlaqeagnferisgdlktqidqvestagslqgqwrgaagtaaqaavvrfqeaankqkqeldeistnirqagvqysradeeqqqalssqmgf。實(shí)施例2檢測(cè)試劑盒制備用于檢測(cè)結(jié)核感染的t細(xì)胞的試劑盒，包括如上實(shí)施例1中所述的抗原組合物和檢測(cè)γ-干擾素的試劑，其中，檢測(cè)γ-干擾素的試劑包括酶聯(lián)免疫吸附試劑、化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)試劑、免疫熒光檢測(cè)試劑。下面具體介紹這幾種試劑盒：一種體外釋放酶聯(lián)免疫法檢測(cè)機(jī)體是否感染結(jié)核分枝桿菌的檢測(cè)試劑盒，該試劑盒以實(shí)施例1中的esat-6和cfp-10或esat-6-cfp-10分別與實(shí)施例1中特異性多肽為結(jié)核分枝桿菌特異性刺激抗原(即esat-6和cfp-10與實(shí)施例1中的特異性多肽，或esat-6-cfp-10與實(shí)施例1中的特異性多肽作為結(jié)核分枝桿菌特異性刺激抗原)，與新鮮采取的肝素抗凝全血充分混合后孵育，收集血漿，應(yīng)用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法原理檢測(cè)人血漿中γ-干擾素的濃度，計(jì)算樣品中γ-干擾素的濃度，從而判斷是否感染結(jié)核分枝桿菌，首先，采集全血，分裝于刺激培養(yǎng)管中(刺激部分(陰性對(duì)照培養(yǎng)管(n)、結(jié)核刺激培養(yǎng)管(t)、陽性對(duì)照培養(yǎng)管(p))，培養(yǎng)之后，用檢測(cè)部分檢測(cè)γ干擾素含量。其由以下成分組成:刺激部分包括：陰性對(duì)照培養(yǎng)管(n)：濃度為20mm的磷酸鹽緩沖液、結(jié)核刺激培養(yǎng)管(t)：終濃度為4～200μg/ml的esat-6-cfp-10融合抗原或esat-6和cfp-10分別與濃度為40～1000μg/ml的實(shí)施例1中所述的seqidno.1～seqidno.29任意八條多肽、陽性對(duì)照培養(yǎng)管(p)為濃度為0.5mg/ml～5mg/ml的外源凝集素，10％的牛血清白蛋白；檢測(cè)部分包被酶標(biāo)板、γ-干擾素校準(zhǔn)品、校準(zhǔn)品稀釋液、酶標(biāo)試劑、濃縮洗滌液、顯色劑a液、顯色劑b液和終止液，其中，酶標(biāo)板包被有抗人γ-干擾素抗體、γ-干擾素校準(zhǔn)品含有重組人γ-干擾素和牛血清白蛋白、校準(zhǔn)品稀釋液為濃度為加有酪蛋白(鈉)的磷酸鹽緩沖、酶標(biāo)試劑為辣根過氧化物標(biāo)記的抗人γ-干擾素單克隆抗體和牛血清、濃縮洗滌液(20倍比)：為含有吐溫-20的磷酸鹽緩沖液、顯色劑a液為過氧化氫、顯色劑b液為四甲基聯(lián)苯胺鹽酸，終止液為10％硫酸。一種體外釋放化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)機(jī)體是否感染結(jié)核分枝桿菌的試劑盒，本試劑盒以esat-6-cfp-10或esat-6和cfp-10分別與實(shí)施例1中的特異性多肽為結(jié)核分枝桿菌特異性刺激抗原，與新鮮采取的肝素抗凝全血充分混合后孵育，收集血漿，應(yīng)用雙抗體夾心免疫法原理檢測(cè)人血漿中γ-干擾素的濃度，計(jì)算樣品中γ-干擾素的濃度，從而判斷是否感染結(jié)核分枝桿菌，首先采集全血，分裝于刺激培養(yǎng)管中(刺激部分(陰性對(duì)照培養(yǎng)管(n)、結(jié)核刺激培養(yǎng)管(t)、陽性對(duì)照培養(yǎng)管(p))，進(jìn)行培養(yǎng)，之后用檢測(cè)部分檢測(cè)γ干擾素含量。其由以下成分組成：刺激部分：陰性對(duì)照培養(yǎng)管(n)中為濃度為20mm的磷酸鹽緩沖液、結(jié)核刺激培養(yǎng)管(t)為終濃度為4～200μg/ml的esat-6-cfp-10融合抗原及濃度為40～1000μg/ml的實(shí)施例1中所述seqidno.1～seqidno.29任意八條多肽，和濃度為20mg/ml～100mg/ml的人血白蛋白、陽性對(duì)照培養(yǎng)管(p)為0.5mg/ml～5mg/ml的外源凝集素，10％的牛血清白蛋白；檢測(cè)部分包被發(fā)光板、γ-干擾素校準(zhǔn)品、校準(zhǔn)品稀釋液、酶標(biāo)試劑、濃縮洗滌液、發(fā)光劑a液和發(fā)光劑b液，其中，發(fā)光板為可拆卸微孔板條發(fā)光板包被有抗人γ-干擾素抗體，γ-干擾素校準(zhǔn)品為含有重組人γ-干擾素和牛血清白蛋白，校準(zhǔn)品稀釋液為含有酪蛋白(鈉)的磷酸鹽緩沖液、酶標(biāo)試劑為辣根過氧化物標(biāo)記的抗人γ-干擾素單克隆抗體和牛血清、濃縮洗滌液(20倍)含有吐溫-20的磷酸鹽緩沖液、發(fā)光劑a液為過氧化脲和發(fā)光劑b液為魯米諾。一種體外釋放免疫熒光法檢測(cè)機(jī)體是否感染結(jié)核分枝桿菌的檢測(cè)試劑盒，本試劑盒以esat-6-cfp-10或esat-6和cfp-10分別與實(shí)施例1中的特異性多肽為結(jié)核分枝桿菌特異性刺激抗原，與新鮮采取的肝素抗凝全血充分混合后孵育，收集血漿，應(yīng)用雙抗體夾心免疫法原理檢測(cè)人血漿中γ-干擾素的濃度，計(jì)算樣品中γ-干擾素的濃度，從而判斷是否感染結(jié)核分枝桿菌，首先采集全血，分裝于刺激培養(yǎng)管中(刺激部分(陰性對(duì)照培養(yǎng)管(n)、結(jié)核刺激培養(yǎng)管(t)、陽性對(duì)照培養(yǎng)管(p))，培養(yǎng)之后用檢測(cè)部分檢測(cè)γ干擾素含量。其由以下成分組成：刺激部分(陰性對(duì)照培養(yǎng)管(n)：濃度為20mm的磷酸鹽緩沖液、結(jié)核刺激培養(yǎng)管(t)：終濃度為4～200μg/ml的esat-6-cfp-10或esat-6和cfp-10分別與40～1000μg/ml的實(shí)施例1中seqidno.1～seqidno.29中的任意八條多肽、陽性對(duì)照培養(yǎng)管(p)為濃度為0.5mg/ml～5mg/ml的外源凝集素，10％的牛血清白蛋白)，檢測(cè)部分包括：測(cè)試卡、熒光免疫試劑、id芯片，其中，測(cè)試卡的t線包被有抗人γ-干擾素抗體，c線包被羊抗兔抗體，熒光免疫試劑為熒光微球標(biāo)記的抗人γ-干擾素單克隆抗體，兔igg抗體，含有酪蛋白(鈉)的tris-hcl緩沖液保存。實(shí)施例3用本發(fā)明試劑盒對(duì)體外全血檢測(cè)的檢測(cè)方法采用實(shí)施例2中制備的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，先進(jìn)行體外全血刺激：在檢測(cè)前，要確保恒溫培養(yǎng)箱37℃，將陰性對(duì)照培養(yǎng)管(n)、結(jié)核刺激培養(yǎng)管(t)、陽性對(duì)照培養(yǎng)管(p)進(jìn)行3000～5000轉(zhuǎn)/分鐘離心1分鐘，分別在3種培養(yǎng)管上做好標(biāo)記，建議加上樣本編號(hào)或姓名。然后打開生物安全柜的紫外燈，照射15～20分鐘。1、采集：采用靜脈穿刺術(shù)，使用肝素鋰抗凝的真空采血管采集全血標(biāo)本，采集量不低于4ml。2、分裝：將采集全血樣本的采血管顛倒混勻5～10次，按1ml/管順序分裝于“n”、“t”、“p”管中。3、培養(yǎng)：將培養(yǎng)管輕柔顛倒混勻5～10次，迅速放入37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)16～24小時(shí)，培養(yǎng)過程中保持培養(yǎng)管直立。4、離心：將培養(yǎng)后的培養(yǎng)管于3000～5000轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘，取血漿于ep管中(注意不可吸到細(xì)胞層)，做好標(biāo)記，為待檢血漿樣品，血漿可于4℃條件保存一周，-20℃可保存一年。采用三種檢測(cè)試劑盒時(shí)，刺激部分相同。下面分別介紹三種試劑盒檢測(cè)部分的使用：(一).體外釋放酶聯(lián)免疫法使用前，請(qǐng)將試劑盒平衡至室溫(約30分鐘)。將液體試劑輕輕振蕩混合，使用后立即密封，放回2～8℃保存。未用完的微孔板條須蓋上封板膜與干燥劑一起用自封袋密封，試劑盒開封后于2～8℃保存不超過1個(gè)月。復(fù)溶后的γ-干擾素校準(zhǔn)品稀釋為各濃度后可于2～8℃保存不超過1個(gè)月。1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)備γ-干擾素校準(zhǔn)品工作液的配制：根據(jù)標(biāo)簽上標(biāo)示的體積，向裝有γ-干擾素校準(zhǔn)品(凍干粉)的西林瓶中加入對(duì)應(yīng)的校準(zhǔn)品稀釋液，混勻，配制成80iu/ml的γ-干擾素校準(zhǔn)品工作液。注意：溶解不同批次γ-干擾素校準(zhǔn)品所需加入校準(zhǔn)品稀釋液的體積可能不同。取6個(gè)1.5mlep管，分別標(biāo)記為sd1、sd2、sd3、sd4、sd5和sd6，sd1管中加入900μl校準(zhǔn)品稀釋液(酶聯(lián))，sd2～sd6每管加入300μl校準(zhǔn)品稀釋液(酶聯(lián))。取100μl的80iu/ml的干擾素校準(zhǔn)品工作液(西林瓶中)，加入到900μl的sd1中，震蕩混勻，得到8iu/ml工作液。更換新吸頭，取300μl的sd1，加入到300μl的sd2中，震蕩混勻，得到4iu/ml工作液。更換新吸頭，取300μl的sd2，加入到300μl的sd3中，震蕩混勻，得到2iu/ml工作液。更換新吸頭，取300μl的sd3，加入到300μl的sd4中，震蕩混勻，得到1iu/ml工作液。更換新吸頭，取300μl的sd4，加入到300μl的sd5中，震蕩混勻，得到0.5iu/ml工作液。更換新吸頭，取300μl的sd5，加入到300μl的sd6中，震蕩混勻，得到0.25iu/ml工作液。2、1×洗滌液的制備：將20ml的濃縮洗滌液(20倍)加入裝有380ml的純水的燒杯中，混勻，備用。3、加樣(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線：各取50μl的sd1、sd2、sd3、sd4、sd5和sd6，按順序加入板孔中，平行做兩孔。(2)樣品：每孔加入50μl待檢血漿樣品，輕微震蕩混勻。注意：血漿樣品在溫育前需要混合均勻，以保證γ-干擾素在包被板孔內(nèi)均勻分布。(3)每孔加入酶標(biāo)試劑50μl。4、溫育：輕輕混合均勻，于37℃的恒溫培養(yǎng)箱中溫育2小時(shí)。5、洗滌：甩掉孔內(nèi)的液體，每孔加入300μl的1×洗滌液洗滌，拍干，重復(fù)5次。6、顯色：每孔加入顯色劑a、b液各50μl，輕輕振蕩混勻；或者每孔加入100μl顯色劑混合液(顯色劑混合液臨用前配制，取等體積的顯色劑a液與顯色劑b液混合均勻)。7、溫育：于37℃的恒溫培養(yǎng)箱中避光溫育15分鐘。8、終止：每孔加入50μl終止液。(二).體外釋放化學(xué)發(fā)光法使用前，將試劑盒平衡至室溫(約30分鐘)。將液體試劑輕輕振蕩混合，使用后立即密封，放回2～8℃保存。未用完的微孔板條須蓋上封板膜與干燥劑一起用自封袋密封，試劑盒開封后于2～8℃保存不超過1月。復(fù)溶后的γ-干擾素校準(zhǔn)品稀釋為各濃度后可于2～8℃保存不超過1個(gè)月。1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)備γ-干擾素校準(zhǔn)品工作液的配制：根據(jù)標(biāo)簽上標(biāo)示的體積，向裝有γ-干擾素校準(zhǔn)品(凍干粉)的西林瓶中加入校準(zhǔn)品稀釋液(發(fā)光)，混勻，配制成80iu/ml的γ-干擾素校準(zhǔn)品工作液。取6個(gè)1.5mlep管，分別標(biāo)記為sd1、sd2、sd3、sd4、sd5和sd6，sd1管中加入900μl校準(zhǔn)品稀釋液(發(fā)光)，sd2～sd6每管加入300μl校準(zhǔn)品稀釋液(發(fā)光)。取100μl的80iu/ml的干擾素校準(zhǔn)品工作液(西林瓶中)，加入到900μl的sd1中，震蕩混勻，得到8iu/ml工作液。更換新吸頭，取300μl的sd1，加入到300μl的sd2中，震蕩混勻，得到4iu/ml工作液。更換新吸頭，取300μl的sd2，加入到300μl的sd3中，震蕩混勻，得到2iu/ml工作液。更換新吸頭，取300μl的sd3，加入到300μl的sd4中，震蕩混勻，得到1iu/ml工作液。更換新吸頭，取300μl的sd4，加入到300μl的sd5中，震蕩混勻，得到0.5iu/ml工作液。更換新吸頭，取300μl的sd5，加入到300μl的sd6中，震蕩混勻，得到0.25iu/ml工作液。2、1×洗滌液的制備：將20ml的濃縮洗滌液(20倍)加入裝有380ml的純水的燒杯中，混勻，備用。3、加樣(1)樣品：每孔加入50μl待檢血漿樣品，輕微震蕩混勻。注意：血漿樣品在溫育前需要混合均勻，以保證γ-干擾素在發(fā)光板孔內(nèi)均勻分布。(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線：各取50μl的sd1、sd2、sd3、sd4、sd5和sd6，按順序加入板孔中，平行做兩孔。空白對(duì)照1孔(加校準(zhǔn)品稀釋液(發(fā)光)50μl)。(3)每孔加入酶標(biāo)試劑50μl。4、溫育：輕輕混合均勻，于37℃的恒溫培養(yǎng)箱中溫育1小時(shí)。5、洗滌：甩掉孔內(nèi)的液體，每孔加入300μl的1×洗滌液洗滌，使用洗板機(jī)洗滌6次，最后一次拍干。6、發(fā)光：每孔加入100μl發(fā)光劑混合液。(發(fā)光劑混合液臨用前配制，取等體積的發(fā)光劑a液與發(fā)光劑b液混合均勻)7、溫育：避光于室溫或37℃的恒溫培養(yǎng)箱中反應(yīng)5分鐘。8、測(cè)定：在10分鐘內(nèi)用化學(xué)發(fā)光免疫分析儀讀取發(fā)光值(rlu)。(三).體外釋放免疫熒光法1、取出所需測(cè)試卡和熒光免疫試劑，將熒光免疫試劑10μl/管分裝到ep管(建議0.65ml清潔ep管)中，平衡至室溫(約30分鐘)。在未使用時(shí)請(qǐng)不要打開測(cè)試卡包裝，一旦打開請(qǐng)立刻使用。2、檢查/插入id芯片到儀器中，讀取數(shù)據(jù)，確保試劑盒與id芯片批號(hào)相匹配。3、分別取每例樣本“n”、“t”、“p”血漿100μl，加入到分裝好的熒光免疫試劑中，做好標(biāo)記，混合均勻，為待測(cè)樣本。4、取100μl混合均勻的待檢樣本加入到測(cè)試卡的加樣孔中，每個(gè)樣本需點(diǎn)三張測(cè)試卡，分別是“n”、“t”、“p”刺激血漿。5、測(cè)試卡于室溫水平放置25～30分鐘，將測(cè)試卡插入到熒光免疫分析儀的樣本卡槽中，按鍵開始掃描。確保測(cè)試卡方向正確并使其完全插入。6、從熒光免疫分析儀的顯示屏幕上讀取數(shù)據(jù)或者直接打印結(jié)果。對(duì)由結(jié)核感染樣本50例，其中65歲年齡及以上樣本20例，健康樣本20例，采集的全血樣本。采用本發(fā)明的試劑盒與市售試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。市售試劑盒為武漢海吉力生物科技有限公司的結(jié)核分枝桿菌特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫法)。其中結(jié)核刺激培養(yǎng)管中采用分別用刺激劑1(esat-6和cfp-10濃度各為10μg/ml，混合多肽(seqidno.21～seqidno.28，各100μg/ml)、刺激劑2(esat-6和cfp-10濃度各為3μg/ml，混合多肽(seqidno.21～seqidno.28，濃度各為100μg/ml)、市售試劑盒刺激混合均勻后于37℃烘箱20±4小時(shí)，混合血液后，6000rpm離心1min，取上清分別用上述檢測(cè)方法進(jìn)行。根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件選擇刺激劑1的陽性判斷值：當(dāng)檢測(cè)結(jié)果t-n≥0.25iu/ml，可判斷感染結(jié)核分枝桿菌，檢測(cè)結(jié)果t-n＜0.25iu/ml，可判斷未感染結(jié)核分枝桿菌根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件選擇刺激劑2的陽性判斷值：當(dāng)檢測(cè)結(jié)果t-n≥0.5iu/ml，可判斷是感染結(jié)核分枝桿菌，檢測(cè)結(jié)果t-n＜0.5iu/ml，可判斷未感染結(jié)核分枝桿菌。對(duì)50例陽性樣本和20例健康的未感染的陰性樣本的檢測(cè)結(jié)果如表1、2、3所示。表1.體外釋放酶聯(lián)免疫法檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)刺激劑1刺激劑2市售試劑盒陽性樣本48/50(96％)48/50(96％)45/50(90％)陰性樣本20/20(100％)20/20(100％)20/20(100％)表2.體外釋放化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)刺激劑1刺激劑2市售試劑盒陽性樣本48/50(96％)48/50(96％)45/50(90％)陰性樣本20/20(100％)20/20(100％)20/20(100％)表3.體外釋放免疫熒光法檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)刺激劑1刺激劑2市售試劑盒陽性樣本49/50(98％)49/50(98％)45/50(90％)陰性樣本20/20(100％)20/20(100％)20/20(100％)檢測(cè)結(jié)果說明本發(fā)明制備的試劑盒，隨esat-6和cfp-10刺激劑濃度的增加，其t刺激值會(huì)有所增加，因此結(jié)果判斷值有一定的變化，故參考值會(huì)存在一定范圍，所以，檢測(cè)結(jié)果t-n≥0.15～0.5iu/ml，判斷為感染結(jié)核分枝桿菌；檢測(cè)結(jié)果t-n＜0.15～0.5iu/ml，判斷為未感染結(jié)核分枝桿菌。本發(fā)明制備的試劑盒靈敏度比現(xiàn)有技術(shù)的檢測(cè)市售試劑盒的靈敏度高。實(shí)施例4特異性多肽合并esat-6和cfp-10刺激效果對(duì)實(shí)施例1中多肽的不同組合進(jìn)行檢測(cè)，均獲得較好的檢測(cè)效果，下面例舉對(duì)實(shí)施例1中的多肽不同組合檢測(cè)的幾種情況，來說明檢測(cè)效果。配制結(jié)核刺激劑3～6(下面濃度均為終濃度)：結(jié)核刺激劑3配方為esat-6和cfp-10各10μg/ml，多肽seqidno.1～8各100μg/ml；結(jié)核刺激劑4配方為esat-6和cfp-10各10μg/ml，多肽seqidno.9～16各100μg/ml；結(jié)核刺激劑5配方為esat-6和cfp-10各10μg/ml，多肽seqidno.17～24各100μg/ml；結(jié)核刺激劑6配方為esat-6和cfp-10各10μg/ml，多肽seqidno.22～29各100μg/ml。取20例樣本，結(jié)核感染樣本10例，健康樣本10例，其中年齡65歲以上12例，男12例，女8例，采用上配方配置的結(jié)核刺激劑1～4，進(jìn)行實(shí)施例3中所述方法的檢測(cè)。同時(shí)對(duì)20例樣本，采用市售試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如表4、5、6所示。市售試劑盒為武漢海吉力生物科技有限公司的結(jié)核分枝桿菌特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫法)。表4.特異性多肽合并esat-6和cfp-10酶聯(lián)免疫法檢測(cè)結(jié)果表5.特異性多肽合并esat-6和cfp-10化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)結(jié)果表6.特異性多肽合并esat-6和cfp-10免疫熒光法檢測(cè)結(jié)果檢測(cè)結(jié)果說明本發(fā)明的檢測(cè)方法及試劑盒，靈敏度比現(xiàn)有技術(shù)的檢測(cè)市售試劑盒的靈敏度高。實(shí)施例5特異性多肽合并esat-6-cfp-10刺激效果本實(shí)施例中采用的是esat-6-cfp-10和特異性多肽seqidno.1～29中任8條及以上的組合，來說明檢測(cè)效果。具體地:配制結(jié)核刺激劑7～10(下面的濃度為終濃度):結(jié)核刺激劑7配方為esat-6-cfp-10，10μg/ml，多肽seqidno.1～8各100μg/ml；結(jié)核刺激劑8配方為esat-6-cfp-10，10μg/ml，多肽seqidno.9～16各100μg/ml；結(jié)核刺激劑9配方為esat-6-cfp-10，10μg/ml，多肽seqidno.17～24各100μg/ml；結(jié)核刺激劑10配方為esat-6-cfp-10，10μg/ml，多肽seqidno.22～29各100μg/ml。取20例樣本，結(jié)核感染樣本10例，健康樣本10例，其中年齡65歲以上13例，男13例，女7例，采用上配方配置的結(jié)核刺激劑5～8，進(jìn)行實(shí)施例3中所述方法的檢測(cè)。同時(shí)對(duì)上述20例樣本，采用市售試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如表7、8、9所示。用已上市的γ干擾素檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫法)檢測(cè)做對(duì)照(市售試劑盒為武漢海吉力生物科技有限公司的結(jié)核分枝桿菌特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫法)。表7.混合多肽合并esat-6-cfp-10酶聯(lián)免疫法檢測(cè)結(jié)果表8.混合多肽合并esat-6-cfp-10化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)結(jié)果表9.混合多肽合并esat-6-cfp-10免疫熒光法檢測(cè)結(jié)果檢測(cè)結(jié)果說明本發(fā)明的檢測(cè)方法及試劑盒，靈敏度比現(xiàn)有技術(shù)的檢測(cè)市售試劑盒的靈敏度高。實(shí)施例6合并混合多肽檢測(cè)靈敏度和特異性樣本：結(jié)核感染樣本20例，結(jié)核陰性樣本20例。采集全血樣本，分別用刺激劑11(esat-6(10μg/ml)和cfp-10(10μg/ml)+混合多肽(seqidno.12～seqidno.19，各100μg/ml))、刺激劑12(esat-6-cfp-10(10μg/ml)+混合多肽(seqidno.12～seqidno.19，各100μg/ml))、刺激劑13(esat-6(10μg/ml)和cfp-10(10μg/ml))、刺激劑14(esat-6-cfp-10(10μg/ml))和刺激劑15(市售試劑盒：武漢海吉力生物科技有限公司的結(jié)核分枝桿菌特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫法))各20μl于無菌培養(yǎng)管中，每管加入1ml新鮮采集全血刺激，按實(shí)施例3中所述的方法進(jìn)行檢測(cè)，市售試劑盒(酶聯(lián)免疫法)按其說明書進(jìn)行操作。檢測(cè)結(jié)果見表10、11、12。表10.合并混合多肽靈敏度和特異性酶聯(lián)免疫法檢測(cè)結(jié)果表11.合并混合多肽靈敏度和特異性化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)結(jié)果表12.合并混合多肽靈敏度和特異性免疫熒光法檢測(cè)結(jié)果檢測(cè)結(jié)果說明本發(fā)明制備的試劑盒用于檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌感染的全血，其檢測(cè)靈敏度可達(dá)95％，靈敏度和特異性較強(qiáng)，有效避免現(xiàn)有技術(shù)檢測(cè)的假陰性和漏檢。實(shí)施例7試劑盒靈敏度和特異性檢測(cè)樣本：結(jié)核感染樣本100例，其中65歲年齡及以上樣本37例，6歲以下年齡樣本數(shù)23例，hiv樣本33例，男61例，女39例。結(jié)核陰性樣本50例，其中65歲年齡及以上樣本12例，6歲以下年齡樣本數(shù)5例，hiv樣本33例，男28例，女22例。采集全血樣本，分別用刺激劑(esat-6和cfp-10+混合多肽(seqidno.15～seqidno.22，各100μg/ml))、市售試劑盒刺激，混合均勻后于37℃烘箱20±4小時(shí)，混合血液后，6000rpm離心1min，取上清分別用實(shí)施例2制備的體外釋放酶聯(lián)免疫法的檢測(cè)試劑盒、體外釋放化學(xué)發(fā)光法的檢測(cè)試劑盒)和體外釋放免疫熒光法的檢測(cè)試劑盒按照實(shí)施例3中的方法進(jìn)行檢測(cè)，市售試劑盒為武漢海吉力生物科技有限公司的結(jié)核分枝桿菌特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫法)，市售試劑盒按其說明書進(jìn)行操作。檢測(cè)結(jié)果見表13～18。表13.結(jié)核感染樣本酶聯(lián)免疫法檢測(cè)結(jié)果表14.健康樣本酶聯(lián)免疫法檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)表15.結(jié)核感染樣本化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)表16健康樣本化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)表17結(jié)核感染樣本免疫熒光法檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)表18健康樣本免疫熒光法檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)上述結(jié)果表明本發(fā)明的試劑盒對(duì)兒童、免疫低下及新近感染結(jié)核分枝桿菌樣本的檢出率較高，靈敏度和特異性較強(qiáng)，有效避免現(xiàn)有技術(shù)檢測(cè)的假陰性和漏檢。本發(fā)明對(duì)結(jié)核分枝桿菌新近感染或免疫低下者的早期檢測(cè)有重要意義，對(duì)結(jié)核病的控制和消滅具有積極的意義。3sequencelisting<110>武漢海吉力生物科技有限公司<120>用于檢測(cè)結(jié)核感染t細(xì)胞的抗原、試劑盒及應(yīng)用<130><160>32<170>patentinversion3.5<210>1<211>14<212>prt<213>人工合成<400>1argleutrpvaltyrcysglyasnglythrproasngluleu1510<210>2<211>14<212>prt<213>人工合成<400>2leumetileglythralaalaalavalvalleuproglyleu1510<210>3<211>14<212>prt<213>人工合成<400>3valglnpheglnserglyglyasnasnserproalavaltyr1510<210>4<211>14<212>prt<213>人工合成<400>4metprovalglyglyglnserserphetyrserasptrptyr1510<210>5<211>14<212>prt<213>人工合成<400>5seralaalaileglyleusermetalaglyserseralamet1510<210>6<211>14<212>prt<213>人工合成<400>6tyrglnseralaileproproargglythrglnalavalval1510<210>7<211>14<212>prt<213>人工合成<400>7arglysalapheargargalailethrargprothrhisphe1510<210>8<211>14<212>prt<213>人工合成<400>8metvalaspproglnleuaspglyproglnleualaalaleu1510<210>9<211>14<212>prt<213>人工合成<400>9leuleupheproalailetyrleualaaspseralaglnala1510<210>10<211>14<212>prt<213>人工合成<400>10alavalleuaspleuthrthrproglnalaargglualaval1510<210>11<211>14<212>prt<213>人工合成<400>11arggluleualatyrservalgluthrthralagluserleu1510<210>12<211>14<212>prt<213>人工合成<400>12valsertrpthrargseralaleuseraspleuproargtrp1510<210>13<211>14<212>prt<213>人工合成<400>13alaleuglyserserleuhisthralaglyvalaspleuala1510<210>14<211>14<212>prt<213>人工合成<400>14argleuglyvalleualaserhishisaspasnalaalaval1510<210>15<211>14<212>prt<213>人工合成<400>15asnvaltyrleuthralahisasnalaleuglyserserleu1510<210>16<211>14<212>prt<213>人工合成<400>16alaleualaalavalvalgluleuglyserpheaspalaala1510<210>17<211>14<212>prt<213>人工合成<400>17leumetalaglyalaglyproalaprometleualaalaala1510<210>18<211>14<212>prt<213>人工合成<400>18alaalaleuaspalaglnalavalgluleuthralaargleu1510<210>19<211>14<212>prt<213>人工合成<400>19leumetserglnleuileglulysprovalalaproserval1510<210>20<211>14<212>prt<213>人工合成<400>20lysleualaglyleuvalpheproglnproproalaproile1510<210>21<211>14<212>prt<213>人工合成<400>21glnglnalaalaglnseralaglnglyglyserglypromet1510<210>22<211>14<212>prt<213>人工合成<400>22valglnmetserglnasnalaserproilealaglnthrile1510<210>23<211>14<212>prt<213>人工合成<400>23metserilethrargprothrglysertyralaargglnmet1510<210>24<211>14<212>prt<213>人工合成<400>24leuleualaalaalaaspgluleuvalglyglyproproval1510<210>25<211>14<212>prt<213>人工合成<400>25alaleualaalaargthrleuleualaalaalaaspgluleu1510<210>26<211>14<212>prt<213>人工合成<400>26argalavalalagluserhisglyvalalaalavalleuphe1510<210>27<211>17<212>prt<213>人工合成<400>27alaalavalvalargpheglnglualaalaasnlysglnlysglnglu151015leu<210>28<211>15<212>prt<213>人工合成<400>28valthrserilehisserleuleuaspgluglylysglnserleu151015<210>29<211>12<212>prt<213>人工合成<400>29leuleuaspgluglylysglnserleuthrlysleu1510<210>30<211>95<212>prt<213>esat-6<400>30metthrgluglnglntrpasnphealaglyileglualaalaalaser151015alaileglnglyasnvalthrserilehisserleuleuaspglugly202530lysglnserleuthrlysleualaalaalatrpglyglyserglyser354045glualatyrglnglyvalglnglnlystrpaspalathralathrglu505560leuasnasnalaleuglnasnleualaargthrileserglualagly65707580glnalametalaserthrgluglyasnvalthrglymetpheala859095<210>31<211>100<212>prt<213>cfp-10<400>31metalaglumetlysthraspalaalathrleualaglnglualagly151015asnphegluargileserglyaspleulysthrglnileaspglnval202530gluserthralaglyserleuglnglyglntrpargglyalaalagly354045thralaalaglnalaalavalvalargpheglnglualaalaasnlys505560glnlysglngluleuaspgluileserthrasnileargglnalagly65707580valglntyrserargalaaspglugluglnglnglnalaleuserser859095glnmetglyphe100<210>32<211>198<212>prt<213>esat-6-cfp-10<400>32metthrgluglnglntrpasnphealaglyileglualaalaalaser151015alaileglnglyasnvalthrserilehisserleuleuaspglugly202530lysglnserleuthrlysleualaalaalatrpglyglyserglyser354045glualatyrglnglyvalglnglnlystrpaspalathralathrglu505560leuasnasnalaleuglnasnleualaargthrileserglualagly65707580glnalametalaserthrgluglyasnvalthrglymetphealaasn859095valalametalaglumetlysthraspalaalathrleualaglnglu100105110alaglyasnphegluargileserglyaspleulysthrglnileasp115120125glnvalgluserthralaglyserleuglnglyglntrpargglyala130135140alaglythralaalaglnalaalavalvalargpheglnglualaala145150155160asnlysglnlysglngluleuaspgluileserthrasnilearggln165170175alaglyvalglntyrserargalaaspglugluglnglnglnalaleu180185190serserglnmetglyphe195當(dāng)前第1頁12