一種用于快速檢測(cè)淋巴細(xì)胞表面分子cd45分布的試劑盒的制作方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種用于快速檢測(cè)淋巴細(xì)胞表面分子CD45分布的試劑盒
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及細(xì)胞表面分子的觀察技術(shù)，尤其涉及一種用于快速檢測(cè)淋巴細(xì)胞表面分子CD45分布的試劑盒。
[0003]
【背景技術(shù)】
[0004]植物凝集素是一類(lèi)具高度特異的糖結(jié)合活性的蛋白，其最大的特點(diǎn)在于識(shí)別糖蛋白和糖脂，特別是細(xì)胞膜中復(fù)雜結(jié)構(gòu)的糖鏈:即細(xì)胞膜表面決定簇。植物凝集素能與動(dòng)物、植物、微生物細(xì)胞發(fā)生特異的作用，引起或增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)吞作用或細(xì)胞間轉(zhuǎn)運(yùn)，誘發(fā)一定的生理效應(yīng)。它可以?xún)?chǔ)存物質(zhì);抵御細(xì)菌、真菌、病毒等病原體的入侵;還作為促有絲分裂因子，調(diào)節(jié)細(xì)胞的分裂和生長(zhǎng)。由于凝集素能選擇性地識(shí)別細(xì)胞膜糖脂或糖蛋白糖鏈的不同糖基，在生化、醫(yī)學(xué)上，植物凝集素常用于細(xì)胞的分型、分離、糖蛋白和有絲分裂原的純化、癌化學(xué)的研究等。隨著基因工程的發(fā)展，植物凝集素已成為一種很有潛力對(duì)抗疾病的工具，在免疫學(xué)、腫瘤、生物學(xué)等方面得到諸多應(yīng)用。紅桂木凝集素(Artocarpus LingnanensisLectin，ALL)是我們的相關(guān)研究人員對(duì)30多種生長(zhǎng)在廣西東南部地區(qū)的植物種子經(jīng)過(guò)精心篩選出來(lái)的植物凝集素，前期研究表明它特異識(shí)別可特異性結(jié)合D-半乳糖和α-乙酰氨基半乳糖，并具有很強(qiáng)的促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖活性。通過(guò)進(jìn)一步深入機(jī)制的研究，我們發(fā)現(xiàn)ALL是通過(guò)與T淋巴細(xì)胞表面分子⑶45胞外區(qū)段Gall-3GalNAc的相互作用而誘導(dǎo)T細(xì)胞的活化和增殖(文章待發(fā)表)。
[0005]CD45由一類(lèi)結(jié)構(gòu)相似，分子量較大的跨膜蛋白組成，廣泛存在于白細(xì)胞表面，其胞漿區(qū)段具有蛋白質(zhì)酷氨酸磷酸酶活性，通過(guò)脫磷酸作用激活Src激酶，進(jìn)而激活Fyn、Hck、Lck和Lyn，導(dǎo)致⑶3、ZAP-70和Cbl的活化，最終活化MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的合成和分泌。因此CD45是細(xì)胞膜上信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵分子，在淋巴細(xì)胞的發(fā)育成熟，功能調(diào)節(jié)中具有重要作用。此外CD45在細(xì)胞表面存在與否可作為某些T細(xì)胞亞群的分類(lèi)標(biāo)志。
[0006]目前CD45分子的檢測(cè)依靠CD45抗體，但抗體試劑非常昂貴，為解決這一問(wèn)題，我們利用紅桂木凝集素與特定糖基的特異性結(jié)合特點(diǎn)，成功檢測(cè)到淋巴細(xì)胞表面的CD45分子。經(jīng)檢索，紅桂木凝集素用于檢測(cè)⑶45分子未見(jiàn)報(bào)道。
[0007]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是為克服已有淋巴細(xì)胞表面分子CD45的檢測(cè)技術(shù)的不足，提供一種用于快速檢測(cè)淋巴細(xì)胞表面分子CD45分布的試劑盒，利用紅桂木凝集素探針，該熒光探針可以快速、準(zhǔn)確的得到診斷結(jié)果，且檢測(cè)成本低。
[0009]本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的:
一種用于快速檢測(cè)淋巴細(xì)胞表面分子CD45分布的試劑盒，試劑盒包括: 1)紅桂木凝集素探針；
2)DAPI(lmg/ml)；
3)0.1%TritonX-1OO；
4)4%多聚甲醛；
5)0.0lMPBS；
6 )50%甘油。
[0010]以上所述的紅桂木凝集素探針采用熒光染料標(biāo)記。
[0011 ]以上所述的熒光染料選自異硫氰酸熒光素。
[0012]以上所述的紅桂木凝集素探針濃度為lOyg/ml。
[0013]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果:
1.本發(fā)明的試劑盒在紅桂木凝集素分離純化中，與已有技術(shù)使用的3000rpm離心15或20min不同，本次的離心條件為4°C，5000rpm離心lOmin。在低溫離心機(jī)中，離心速度的加大可使沉淀更快更徹底。
[0014]2.本發(fā)明的試劑盒在制備ALL-FITC中，與已有技術(shù)使用的Sepharose 4B不同，本次所用的瓊脂糖凝膠為Sepharose 6B0Sepharose 6B更適合紅桂木凝集素的分離。
[0015]3.本發(fā)明的試劑盒所染色的淋巴細(xì)胞不受種屬限制，可以是人的淋巴細(xì)胞，也可以是其他物種的淋巴細(xì)胞；
4.本發(fā)明的試劑盒所染色的淋巴細(xì)胞不受種類(lèi)限制，可以是T淋巴細(xì)胞，也可以B淋巴細(xì)胞或NK細(xì)胞。
[0016]5.本發(fā)明的試劑盒染色結(jié)果，既可用激光共聚焦顯微鏡觀察，看到染成藍(lán)色的細(xì)胞核和染成綠色的細(xì)胞膜表面分子CD45;還可以用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞膜表面分子CD45的含量。
[0017]6.本發(fā)明的試劑盒，能夠準(zhǔn)確快速地檢測(cè)到淋巴細(xì)胞表面分子CD45的分布或含量，具有較高的特異性和靈敏度，不需要抗體，結(jié)果清晰，經(jīng)濟(jì)、方便，而且檢測(cè)對(duì)象淋巴細(xì)胞不受種屬和種類(lèi)的限制，具有較好的應(yīng)用前景。
[0018]
【附圖說(shuō)明】
[0019]圖1:淋巴細(xì)胞表面ALL與⑶45共定位；
DAPI:即4’，6-二脒基-2-苯基卩引噪(4’ ,6-diamidino-2-pheny I indole)，是一種染細(xì)胞核的藍(lán)色熒光染料；
FITC-ALL:偶聯(lián)異硫氰酸焚光素(Fluorescein isoth1cyanate)的紅桂木凝集素，呈綠色熒光；
PE-OM5:偶聯(lián)Phycoerythrin的⑶45抗體，呈紅色焚光；
Merge:兩種顏色的的疊加，呈橙黃色。
[0020]圖2:ALL_FITC與PE-CD45雙染淋巴細(xì)胞后的流式分析圖；
FITC-ALL:偶聯(lián)異硫氰酸焚光素(Fluorescein isoth1cyanate)的紅桂木凝集素。[0021 ] PE-CD45:偶聯(lián) Phycoerythr in 的CD45 抗體。
[0022]圖3:CD45抗體抑制ALL與淋巴細(xì)胞結(jié)合的流式分析圖； FITC-ALL:偶聯(lián)異硫氰酸焚光素(Fluorescein isoth1cyanate)的紅桂木凝集素；右邊的曲線(xiàn)Ant1-CD45 antibody:無(wú)抗CD45抗體時(shí)，ALL與淋巴細(xì)胞的結(jié)合情況圖；左邊的曲線(xiàn):+ Ant1-CD45 antibody:當(dāng)加入抗CD45抗體后，曲線(xiàn)往左移，表明ALL與淋巴細(xì)胞的結(jié)合能力下降。
[0023]圖4:GalNAc抑制ALL與淋巴細(xì)胞的結(jié)合；
ALL binding:紅桂木凝集素與淋巴細(xì)胞的結(jié)合能力；
左邊的曲線(xiàn):FITC-Control:異硫氰酸熒光素對(duì)照；
右邊的曲線(xiàn):FITC-ALL:偶聯(lián)異硫氰酸焚光素(Fluorescein isoth1cyanate)的紅桂木凝集素，反映ALL與淋巴細(xì)胞的結(jié)合情況；
中間的曲線(xiàn):GalNac + FITC-ALL:反映加入N乙酰氨基半乳糖后，ALL與淋巴細(xì)胞的結(jié)合能力下降。
[0024]圖5:淋巴細(xì)胞膜蛋白染色結(jié)果圖；
A為:淋巴細(xì)胞膜蛋白經(jīng)ALL- agarose柱后，收集到的ALL受體蛋白經(jīng)聚丙烯酰氨凝膠電泳后考馬斯亮藍(lán)染色圖譜；
B為:淋巴細(xì)胞表面蛋白經(jīng)ALL- agarose柱后，收集到的ALL受體蛋白經(jīng)聚丙稀酰氨凝膠電泳后進(jìn)行凝集素印跡分析的圖譜；
C為:淋巴細(xì)胞表面蛋白經(jīng)ALL- agarose柱后，收集到的ALL受體蛋白經(jīng)聚丙稀酰氨凝膠電泳后用抗CD45抗體進(jìn)行免疫印跡分析的圖譜。
[0025]
【具體實(shí)施方式】
[0026]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0027]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0028]下述中的取血均經(jīng)過(guò)供血者同意。
[0029]實(shí)施例1紅桂木凝集素的獲得
紅桂木凝集素的分離純化的所有操作，均在4°C下進(jìn)行。方法是:先取紅桂木種子30g，粉碎研磨，按1: 5的比例加入0.0 Imo 1/L含0.1moI/L NaCl，pH7.2的磷酸鹽(I3BS)緩沖溶液150mL，浸泡抽提24h ；將抽提液過(guò)濾，濾液以5000rpm離心1min，過(guò)濾，于上清液中加入硫酸銨至30%飽和度；再以5000rpm離心1min，過(guò)濾，將上清液加入硫酸銨至60%飽和度，放置12h;以5000rpm離心1min，棄上清液