本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種直腸腫瘤標(biāo)志物及其應(yīng)用、試劑盒。

背景技術(shù)：

細胞自噬(autophagy)是多細胞生物的一種“自食”現(xiàn)象，細胞通過包裹胞漿內(nèi)容物將其運送到溶酶體系降解以循環(huán)使用降解產(chǎn)物供正?；顒又瑁摤F(xiàn)象具有進化保守性。自噬是機體重要的防御和保護機制，在許多生理和病理過程中扮演著復(fù)雜而多效的角色。在細胞生存受到威脅時，如缺氧或營養(yǎng)缺失，自噬可通過溶酶體降解生存非緊急的蛋白和細胞器等，循環(huán)使用新陳代謝營養(yǎng)原料以促進細胞存活；自噬還可以降解和消除有毒性傾向的陳舊蛋白以及蛋白聚集體，形成保護機制以抵抗神經(jīng)退行性病變；此外，自噬亦能吞噬入侵的細菌和病毒，將其鎖定在自噬體內(nèi)，最終運送到溶酶體消除以起到免疫防御的作用。自噬作用的紊亂會引起許多病理反應(yīng)，腫瘤即是其功能紊亂的結(jié)果之一。

自噬需要多個信號通路和酶復(fù)合物的協(xié)同作用，beclin1(bcl2-bindingmyosin-likeprotein1)為自噬分子機制的核心成分，是beclin1-vps34復(fù)合體中的骨架蛋白。vps34是哺乳動物iii型磷脂酰肌醇3激酶(pi3k)，它特異性地磷酸酯化肌糖環(huán)三位的磷脂酸肌醇并將其轉(zhuǎn)化為磷脂酸肌醇3磷酸酯(pi3ps)。vps34胞質(zhì)激酶活性的激活是自噬啟動機制中的關(guān)鍵步驟，因為自噬過程的標(biāo)志成員-用來包裹胞漿內(nèi)容物的雙膜自噬體-的形成需要大量由vps34產(chǎn)生的pi3ps。beclin1與vps34緊密結(jié)合，為自噬調(diào)節(jié)因子提供相互作用的平臺，因此它在自噬調(diào)控中扮演著獨特的角色。就目前所知，多個自噬調(diào)節(jié)因子均通過與beclin1相互作用而形成功能獨特的beclin1-vps34次級復(fù)合體以調(diào)節(jié)vps34的活性，從而發(fā)揮各自對自噬過程的調(diào)節(jié)作用。beclin1-vps34復(fù)合體活性的調(diào)節(jié)除了通過與自噬調(diào)控因子的結(jié)合來實現(xiàn)以外，還可以通過beclin1磷酸化實現(xiàn)，從而改變自噬強度。beclin1可在某些部位被磷酸化，從而影響beclin1-vps34復(fù)合體的形成，繼而敏銳而準(zhǔn)確地針對細胞內(nèi)諸多影響因素產(chǎn)生應(yīng)答。

直腸腫瘤是由直腸組織細胞發(fā)生惡變而形成的從齒狀線至乙狀結(jié)腸交界處之間的腫瘤，其位置深入盆腔，手術(shù)后復(fù)發(fā)率高。其成因未明，目前認為的高危因素涉及營養(yǎng)不均衡，即動物脂肪和蛋白質(zhì)攝入過高而食物纖維攝入不足。直腸腫瘤的發(fā)病率逐年增加，僅次于肺癌及胃癌，未來或可超過肺癌及胃癌，躍居第一，因此直腸腫瘤的診斷及治療是當(dāng)今世界極為重要的研究課題。當(dāng)前直腸腫瘤通行的診斷流程所涉及的特異性生物標(biāo)志物有癌胚抗原(cea)和糖鏈抗原19-9(ca19-9)兩種，前者用于診斷和檢測，后者用于預(yù)后評估，兩者須聯(lián)合應(yīng)用，但失誤率依然存在，需要更多檢測手段以佐證，如影像學(xué)和內(nèi)窺鏡檢查，而這些檢查手段均有各自的缺點，如耗時、有創(chuàng)傷性、價格昂貴等，對病人構(gòu)成身體、精神加經(jīng)濟等多重分擔(dān)。尤其值得注意的是，直腸腫瘤中的中下段腫瘤因接近于肛管括約肌，導(dǎo)致術(shù)后保留肛門成為一個難題，這也使得直腸腫瘤成為手術(shù)方法上爭議最大的一種疾病，臨床醫(yī)師采取的策略通常是“先保命，再保肛”。但由于人工肛門通過腹壁結(jié)腸造瘺而成，患者必須永久性地于腹壁位置排便，因心理及社會原因，由此帶來極大的精神痛苦，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和生命尊嚴(yán)，以至于很多患者寧肯選擇死亡也不愿接受腹壁人造肛門。

直腸腫瘤的防治難點包括：1)早期診斷，由于患者病情的個體性，用于早期篩查的生物標(biāo)志物的選取頗為困難，使得多數(shù)病人查出時已是中晚期；2)保肛，手術(shù)治療能否保住肛門，成為患者的主要關(guān)注點；3)耐藥性，化療藥物由于分子靶標(biāo)特異性差，使得耐藥性和藥物副作用明顯。因此尋找個性化靶標(biāo)對于直腸腫瘤的防治非常關(guān)鍵。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種直腸腫瘤標(biāo)志物及其應(yīng)用、試劑盒，旨在解決現(xiàn)有直腸腫瘤的特異性生物標(biāo)志物有限及直腸腫瘤防治困難的技術(shù)問題。

為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一方面，本發(fā)明提供一種直腸腫瘤標(biāo)志物，所述直腸腫瘤標(biāo)志物為beclin1蛋白。

另一方面，本發(fā)明提供一種用于檢測上述beclin1蛋白的表達水平和/或磷酸化水平的試劑在制備用于檢測和/或診斷直腸腫瘤或用于對直腸腫瘤患者的治療和/或預(yù)后評價的試劑盒中的應(yīng)用。

最后，本發(fā)明還提供一種檢測和/或診斷直腸腫瘤或?qū)δc腫瘤患者的治療和/或預(yù)后評價的試劑盒，所述試劑盒包括檢測上述beclin1蛋白的表達水平和/或磷酸化水平的試劑。

本發(fā)明提供的直腸腫瘤標(biāo)志物為beclin1蛋白，該beclin1蛋白的表達水平和/或磷酸化水平與直腸腫瘤具有相關(guān)性。我們從細胞自噬角度出發(fā)，以該通路中的骨架蛋白beclin1為研究對象，首次對直腸腫瘤臨床樣本中的beclin1水平及磷酸化水平表征。beclin1的狀態(tài)可以分為自噬促進型和自噬抑制型，自噬的狀態(tài)可以分為腫瘤細胞有益型和腫瘤細胞有害型。腫瘤處于不同分期(形成與發(fā)展，轉(zhuǎn)移與浸潤，以及放化療)時，自噬處于不同的狀態(tài)中，因此可以通過監(jiān)測beclin1的狀態(tài)(蛋白總水平與磷酸化修飾水平)來調(diào)整腫瘤患者的治療方案，如對于自噬促進-腫瘤細胞有益型(處于腫瘤生長過程中)和自噬抑制-腫瘤細胞有害型(處于有效治療過程中)患者，應(yīng)該選擇自噬抑制型化療藥物；對于自噬促進-腫瘤細胞有害型(處于有效治療過程中)和自噬抑制-腫瘤細胞有益型(處于腫瘤生長過程中)患者，應(yīng)該選擇自噬促進型化療藥物。因此，beclin1的狀態(tài)可以用作直腸腫瘤的早期診斷、以及治療效果跟蹤以及預(yù)后評價提供參考。

本發(fā)明提供在一種用于檢測上述beclin1蛋白的表達水平和/或磷酸化水平的試劑在制備用于檢測和/或診斷直腸腫瘤或?qū)χ蹦c腫瘤患者的治療和/或預(yù)后評價的試劑盒中的應(yīng)用，該應(yīng)用體現(xiàn)在產(chǎn)品上為一種檢測和/或診斷直腸腫瘤或?qū)δc腫瘤患者的治療和/或預(yù)后評價的試劑盒。通過收集臨床直腸腫瘤組織樣本，研究病患個性化表達beclin1的情況，在beclin1磷酸化的個體化與腫瘤個體化之間建立可供臨床參考的聯(lián)系，為臨床診斷和治療提供幫助。該試劑盒可對直腸腫瘤臨床樣本中的beclin1蛋白水平以及beclin1磷酸化水平兩個層次的檢測，考察beclin1表達與修飾個性化與直腸腫瘤表征個性化之間的關(guān)系，通過聯(lián)合評估，可以作為直腸腫瘤早期檢測和/或診斷的參考，以及直腸腫瘤患者的用藥監(jiān)測、耐藥性預(yù)測的參考。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例1中利用恒溫量熱滴定法測定體外蛋白beclin1_wt、beclin1_229e233e與atg14l相互作用結(jié)果數(shù)據(jù)圖；

圖2為本發(fā)明實施例2中beclin1磷酸化條件測試的免疫印跡分析結(jié)果圖；

圖3為本發(fā)明實施例3中臨床直腸腫瘤lc3-i/ii及beclin1/beclin1磷酸化表達水平的免疫印記分析結(jié)果圖；

圖4為本發(fā)明實施例4中直腸腫瘤臨床樣本中不同組織部位beclin1表達水平的免疫組化分析結(jié)果圖；

圖5為本發(fā)明實施例5中經(jīng)抗直腸腫瘤藥物處理后的hela細胞中l(wèi)c3-i/ii及p62表達水平的免疫印記分析結(jié)果圖。

具體實施方式

為了使本發(fā)明要解決的技術(shù)問題、技術(shù)方案及有益效果更加清楚明白，以下結(jié)合實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

一方面，本發(fā)明實施例提供了一種直腸腫瘤標(biāo)志物，該直腸腫瘤標(biāo)志物為beclin1蛋白。該beclin1蛋白的表達水平和/或磷酸化水平與直腸腫瘤具有相關(guān)性。通過研究，自噬狀態(tài)的個性化與直腸腫瘤的個性化一一對應(yīng)，提出beclin1表達及修飾化狀態(tài)，可從分子水平上判斷直腸腫瘤病人的個體特征，為直腸腫瘤個性化治療提供理論依據(jù)。

本發(fā)明一實施例中，用beclin1突變蛋白模擬beclin1磷酸化與自噬活化因子atg14l之間的結(jié)合力。完整的beclin1一共有三個功能區(qū)(bh3區(qū)、ccd區(qū)、ecd區(qū))，本發(fā)明實施例以人源beclin1的部分氨基酸序列，即bh3區(qū)和ccd區(qū)的序列(編號為102-268的氨基酸序列)作為野生型beclin1蛋白(簡稱beclin1_wt)，將該野生型beclin1蛋白中的兩個酪氨酸(氨基酸編號分別229和233)同時突變?yōu)楣劝彼嵝纬赏蛔凅w(簡稱beclin1_229e233e，e為谷氨酸，glutamicacid，三字母簡寫為glu，單字母簡寫為e，谷氨酸酸性氨基酸，可從電荷上模擬磷酸化后的原子微環(huán)境)，即該突變體長度為起始氨基酸編號102，終止氨基酸編號268，一共167個氨基酸，再引入連接表達載體的4個氨基酸(即最開始的4個氨基酸“gpgs”)，因此一共171個氨基酸組成本發(fā)明的beclin1突變蛋白，該beclin1突變蛋白的氨基酸序列為seqidno:1：gpgseasdggtmenlsrrlkvtgdlfdimsgqtdvdhplceectdtlldqldtqlnvtenecqnykrcleileqmneddseqlqmelkelaleeerliqeledveknrkivaenlekvqaeaerldqeeaqeqreesefkrqqlelddelksvenqmryaqtqldklkktn。

因自噬的啟動需要經(jīng)歷三個步驟：第一步，beclin1_wt-beclin1_wt同源二聚體解離，變?yōu)閎elcin1_wt單體；第二步，beclin1_wt單體與atg14l形成beclin1_wt-atg14l異源二聚體；第三步，beclin1_wt-atg14l異源二聚體作為結(jié)合平臺，募集相應(yīng)活化因子，啟動自噬?；谶@種蛋白相互作用的分子機制，在已解析的beclin1_wt-beclin1_wt同源二聚體三維結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，通過基因突變手段，設(shè)計了人源beclin1_229e233e突變，旨在模擬beclin1229、233兩個位點的酪氨酸磷酸化。結(jié)果顯示，229、233兩個位點的酪氨酸被磷酸化后，將下調(diào)beclin1_wt與atg14l之間的相互作用，進一步暗示其產(chǎn)生自噬抑制作用。

另一方面，本發(fā)明實施例提供一種用于檢測上述beclin1蛋白的表達水平和/或磷酸化水平的試劑在制備用于檢測和/或診斷直腸腫瘤或用于對直腸腫瘤患者的治療和/或預(yù)后評價的試劑盒中的應(yīng)用。本發(fā)明實施例以beclin1蛋白總水平及beclin1磷酸化水平作為檢測指標(biāo)應(yīng)用于直腸腫瘤早期診斷與研究，以制備檢測和/或診斷直腸腫瘤或?qū)χ蹦c腫瘤患者的治療和/或預(yù)后評價的試劑盒。

優(yōu)選地，beclin1蛋白的磷酸化水平為beclin1蛋白的229位點和233位點的酪氨酸磷酸化水平。在本發(fā)明一實施例中，對beclin1磷酸化的條件測試，表明229、233這兩個位點或為egfr的主要底物位點，證明其擔(dān)任重要的由結(jié)構(gòu)修飾引起功能改變的角色。

優(yōu)選地，檢測beclin1蛋白的表達水平的試劑包括抗beclin1蛋白抗體或熒光探針修飾的beclin1蛋白抗體，檢測述beclin1蛋白的磷酸化水平的試劑包括抗磷酸化酪氨酸抗體。在本發(fā)明一實施例中，用抗beclin1抗體對臨床直腸癌癌組織及癌旁組織進行免疫組化實驗分析；在本發(fā)明另一實施例中，用抗beclin1抗體和抗磷酸化酪氨酸抗體對臨床直腸腫瘤beclin1/beclin1磷酸化表達水平的免疫印記分析。

優(yōu)選地，檢測所述的beclin1蛋白的表達水平和/或磷酸化水平的方法為免疫學(xué)方法。在本發(fā)明實施例中，免疫學(xué)方法包括免疫印跡法、免疫組化法和免疫共沉淀法。

優(yōu)選地，對直腸腫瘤患者的治療和/或預(yù)后評價的試劑盒可與抗直腸腫瘤藥物聯(lián)合用藥。抗直腸腫瘤藥物包括卡培他濱、伊立替康、奧沙利鉑、氟尿嘧啶和亞葉酸鈣中的至少一種。在本發(fā)明一實施例中，通過對臨床抗直腸腫瘤藥物自噬能力分類，“奧沙利鉑+氟尿嘧啶+亞葉酸鈣”聯(lián)用有自噬促進作用；而卡培他濱和伊立替康未有自噬促進作用，該試劑盒通過beclin1蛋白的表達水平和/或磷酸化水平，獲得相關(guān)信息作為直腸腫瘤用藥監(jiān)測、耐藥性預(yù)測的參考。

最后，本發(fā)明實施例提供一種檢測和/或診斷直腸腫瘤或?qū)δc腫瘤患者的治療和/或預(yù)后評價的試劑盒，該試劑盒包括上述beclin1蛋白的表達水平和/或磷酸化水平的試劑。具體地，beclin1蛋白的磷酸化水平是指beclin1蛋白的229位點和233位點的酪氨酸磷酸化水平，這兩個位點或為egfr的主要底物位點。具體地，檢測beclin1蛋白的表達水平的試劑包括抗beclin1蛋白抗體或熒光探針修飾的beclin1蛋白抗體，檢測beclin1蛋白的磷酸化水平的試劑包括抗磷酸化酪氨酸抗體。

本發(fā)明先后進行過多次試驗，現(xiàn)舉一部分試驗結(jié)果作為參考對發(fā)明進行進一步詳細描述，下面結(jié)合具體實施例進行詳細說明。

實施例1beclin1磷酸化的作用模擬

恒溫量熱滴定法測定體外蛋白beclin1_wt、beclin1_229e233e與自噬調(diào)節(jié)因子atg14l相互作用，用beclin1突變蛋白模擬beclin1磷酸化與自噬活化因子atg14l之間的結(jié)合力。具體過程如下：

先在大腸桿菌中實現(xiàn)人源beclin1_wt、beclin1_229e233e、atg14l蛋白的可溶表達，并分離純化得到足量的目的蛋白；beclin1_wt、beclin1_229e233e及atg14l均被透析至緩沖液(含有50mmtris，150mmnacl；ph8.0)中；在等溫量熱滴定儀的滴定注射器分別上樣40μl的beclin1_wt(濃度12mg/ml)和40μl的beclin1_229e233e(濃度12mg/ml)，并在等溫量熱滴定儀之樣品池上樣220μl的atg14l(濃度500μg/ml)，利用等溫量熱滴定儀itc200(microcal)分別測定自噬骨架蛋白beclin1_wt與atg14l、beclin1_229e233e與atg14l之間的相互作用所引起的熱轉(zhuǎn)化；每次測定具有10-40次進樣，每兩次進樣之間平衡180秒，其數(shù)據(jù)用origin7.0采集和分析。

通過測定結(jié)合常數(shù)并進行定量計算，結(jié)果如圖1所示：從圖中數(shù)據(jù)可知，較之野生型beclin1_wt與atg14l之間的相互作用(圖1a為恒溫量熱滴定測定beclin1_wt與atg14l相互作用)，突變型beclin1_229e233e與atg14l之間的相互作用(圖1b為恒溫量熱滴定測定beclin1_229e233e與atg14l相互作用)減弱，暗示229、233兩個位點的酪氨酸被磷酸化后，將下調(diào)beclin1_wt與atg14l之間的相互作用，進一步說明其產(chǎn)生自噬抑制作用。

實施例2beclin1磷酸化的條件測試

利用大腸桿菌對beclin1野生型(beclin1_wt)及突變型(針對229、233酪氨酸位點進行突變)進行異源表達，分離純化，測試磷酸化條件。在egf、egfr的作用下，beclin1_wt及三種突變(beclin1mutanta：beclin1_229e，只對229酪氨酸位點進行突變；beclin1mutantb：beclin1_233e，只對233酪氨酸位點進行突變；beclin1mutantc：beclin1_229e223e，針對229和233兩個酪氨酸位點進行突變)，分別在4℃、16℃、30℃下進行磷酸化測試，采用免疫印跡法(westernblot)進行表征，其中，一抗為抗磷酸化酪氨酸抗體。

實驗結(jié)果如圖2所示：beclin1_wt的酪氨酸可以被egfr磷酸化，且受溫度的影響較?。欢鴅eclin1_229e和beclin1_233e則明顯信號減弱，這表明229、233這兩個位點為egfr的底物，而且其敏感性受溫度影響明顯；而beclin1_229e233e沒有檢測到信號，表明229、233這兩個位點或為egfr的主要底物位點。此試驗結(jié)果說明，該兩個位點擔(dān)任重要的由結(jié)構(gòu)修飾引起功能改變的角色。

實施例3臨床直腸腫瘤lc3-i/ii、beclin1總水平和磷酸化水平分析

獲取五份直腸腫瘤臨床樣本(iii期，手術(shù)所獲樣本，編號a、b、c、d、e)，用免疫印跡法(westernblot)對五份樣本中l(wèi)c3-i/ii及beclin1總水平進行表征：即先從石蠟組織中提取對應(yīng)的目的蛋白，并用對應(yīng)的抗體直接檢測；同時，也對五份樣本中的beclin1磷酸化水平進行表征：即先用抗beclin1抗體進行免疫共沉淀后，再用抗磷酸化酪氨酸抗體檢測。

檢測結(jié)果如圖3的所示：結(jié)果表明，直腸腫瘤晚期自噬水平與beclin1的總水平之間無明顯關(guān)聯(lián)。結(jié)合該五份樣本的臨床化療實情，化療藥物影響了beclin1的磷酸化調(diào)控通路，如化療靶向聯(lián)用中的西妥昔單抗與帕尼單抗為靶向egfr的抗體，其對egfr酪氨酸激酶活性的抑制作用使得beclin1磷酸化水平下調(diào)，從而解除自噬抑制，所以結(jié)果顯示：beclin1磷酸化(圖中的p-beclin1)水平越低，lc3-ii條帶強度增加。然而自噬增強對于抗直腸腫瘤治療是利是弊有待商榷，我們發(fā)現(xiàn)圖3中的樣本d的臨床評價不及樣本c，這提示beclin1磷酸化水平可以作為用藥監(jiān)測的參考。因此，beclin1表達水平及其與p-beclin1的比值聯(lián)合評估，可以作為用藥監(jiān)測、耐藥性預(yù)測的參考。

實施例4臨床直腸腫瘤不同組織中beclin1表達水平分析

選取20例臨床直腸癌病人的組織樣本(iii期，手術(shù)所獲樣本)，并用抗beclin1抗體對每個直腸癌病人的直腸癌癌組織及癌旁組織進行免疫組化實驗分析。

其結(jié)果如圖4所示：從圖可知，beclin1在直腸癌癌細胞中的表達水平(圖4b：癌組織免疫組化結(jié)果)明顯高于直腸癌癌旁組織的表達水平(圖4a：癌旁組織免疫組化結(jié)果)，這說明從正常細胞向直腸腫瘤發(fā)展的過程中，beclin1的表達水平升高。因此，beclin1的表達水平可以作為直腸腫瘤早期診斷的參考。

實施例5臨床抗直腸腫瘤藥物自噬能力分類

用免疫印記分析法分析抗直腸腫瘤藥物處理后的hela細胞中l(wèi)c3-i/ii及p62的表達水平，根據(jù)lc3-ii的轉(zhuǎn)化率以及p62的移除率分類直腸腫瘤藥物的自噬能力。具體過程如下：

先將hela細胞分四組進行培養(yǎng)，每組轉(zhuǎn)染lc3及p62進入hela細胞后進行過量表達；其中三組分別用三類直腸腫瘤化療的常規(guī)藥物(druga：卡培他濱；drugb：伊立替康；drugc：“奧沙利鉑+氟尿嘧啶+亞葉酸鈣”聯(lián)用)處理hela細胞，另外一組做空白對照(control)；對四組hela細胞于37℃培養(yǎng)箱中孵育24小時，并將hela細胞用pbs清洗，lysisbuffer裂解，最后提取細胞蛋白。將提取的細胞蛋白經(jīng)過煮沸變性后，利用免疫印跡實驗進行目標(biāo)蛋白表征：即表征lc3-ii的轉(zhuǎn)化率以及p62的移除率。

最終結(jié)果如圖5所示：實驗結(jié)果表明，“奧沙利鉑+氟尿嘧啶+亞葉酸鈣”聯(lián)用組(drugc)相對未用抗直腸腫瘤藥物處理組(control)，其lc3-ii的轉(zhuǎn)化率顯著提高，同時p62蛋白移除率(降解速率)提高，即表明drugc有自噬促進作用；而在卡培他濱組(druga)和伊立替康組(drugb)中，lc3-ii的轉(zhuǎn)化率以及p62的移除率未見明顯變化，即druga和drugb未有自噬促進作用，顯影后掃描定量分析，drugc的lc3-ii轉(zhuǎn)化率為druga和drugb的兩倍。同過對直腸腫瘤藥物進行以自噬能力為標(biāo)準(zhǔn)的分類，將對臨床直腸腫瘤患者治療提供指導(dǎo)。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

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<110>深圳人仁生物醫(yī)藥科技有限公司

<120>直腸腫瘤標(biāo)志物及其應(yīng)用、試劑盒

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