本發(fā)明涉及一種核酸傳感器的構(gòu)建方法，特別涉及一種高穩(wěn)定性核酸傳感器的構(gòu)建方法，屬于生物傳感技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

電化學(xué)生物傳感器通過(guò)將單鏈dna、寡核苷酸探針固定在電極表面，利用與樣品溶解液中的互補(bǔ)dna鏈或者寡聚核苷酸堿基配對(duì)來(lái)進(jìn)行識(shí)別。通過(guò)檢測(cè)電活性指示劑的電流變化，或者由于雙螺旋結(jié)構(gòu)形成而產(chǎn)生電、界面性質(zhì)的變化來(lái)監(jiān)測(cè)雜交情況。在適配體電化學(xué)傳感器的發(fā)展過(guò)程中，適配體的固定對(duì)于整個(gè)傳感器的性能具有非常重要的作用。適配體傳感器的穩(wěn)定性、結(jié)合力和對(duì)靶分子的特異性都取決于適配體在電極即傳感器表面上的固定技術(shù)。因此，減小適體的非特異性吸附，控制傳感界面，以保證適體與表面連接的穩(wěn)定性，是構(gòu)建穩(wěn)定核酸傳感器的關(guān)鍵。

現(xiàn)有技術(shù)中，比較常見(jiàn)的電極表面構(gòu)建方法有以下幾種：

1)生物素親和力固定法。這種方法借助生物素親和素、鏈霉親合素素及中性鏈親和素間的強(qiáng)親和力來(lái)進(jìn)行固定，由于是生物分子這種方法對(duì)溶液環(huán)境和操作過(guò)程要求較高，且原料昂貴，不易用于日常應(yīng)用。

2)吸附固定法。固定適配體最簡(jiǎn)單的一種方式便是吸附法，這種方法既不需要試劑也不需要對(duì)核酸進(jìn)行特殊的修飾，主要通過(guò)靜電作用相互結(jié)合。這種方法結(jié)合力不夠強(qiáng)，核酸在雜交的過(guò)程中很容易就會(huì)從電機(jī)的表面脫附，而且導(dǎo)致目標(biāo)物結(jié)合效率低。

3)化學(xué)反應(yīng)固定法。化學(xué)反應(yīng)固定法是基底表面與反應(yīng)物之間的化學(xué)反應(yīng)，典型的是巰基與金電極結(jié)合固定在電極表面，這種方法在電化學(xué)測(cè)試的過(guò)程中不穩(wěn)定而容易脫落。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的核酸傳感器存在的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的目的是在于提供一種簡(jiǎn)單、用時(shí)短，構(gòu)建穩(wěn)定性好，電子傳遞迅速的適配體傳感器的方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明提供了一種高穩(wěn)定性核酸傳感器的構(gòu)建方法，該方法包括以下步驟：

1)將金電極浸泡在含4-[(三甲基硅基)乙炔基]苯甲酸和四丁基氟化銨的四氫呋喃溶液中，在避光及室溫環(huán)境中反應(yīng)，得到4-羧基苯基乙炔基修飾的金電極；

2)將dna1與dna2進(jìn)行特異性反應(yīng)，得到dsdna(雙鏈dna)；所述dna1一端修飾氨基，另一端修飾biotin(生物素)；dna2一端修飾亞甲基藍(lán)(mb)信號(hào)分子；所述dna1與dna2完全互補(bǔ)；

3)所述4-羧基苯基乙炔基修飾的金電極與dsdna進(jìn)行酰胺化反應(yīng)后，采用mch溶液封閉金電極表面，即得。

優(yōu)選的方案，1)中的反應(yīng)時(shí)間為0.5～1.5h；最優(yōu)選為1h。

優(yōu)選的方案，dna1與dna2在緩沖溶液中，于35～39℃，反應(yīng)1～3h，得到dsdna。最優(yōu)選的反應(yīng)條件為在37℃反應(yīng)2h。緩沖溶液為tris-hcl溶液。

優(yōu)選的方案，所述酰胺化反應(yīng)的過(guò)程為：將4-羧基苯基乙炔基修飾的金電極浸泡在含dsdna、edc與nhs的混合水溶液中，在避光環(huán)境中，于室溫下反應(yīng)3～6h。

本發(fā)明的dna1和dna2可直接通過(guò)購(gòu)買得到，如生工生物工程上海(股份)有限公司。本發(fā)明采用的dna1為一端修飾-nh2，另一端修飾biotin；dna2一端修飾亞甲基藍(lán)mb信號(hào)分子。dna1與dna2完全互補(bǔ)得到dsdna。-nh2用于與-cooh縮合，使dsdna固定到電極表面。

本發(fā)明采用的分子探針，mb是還原性物質(zhì)，于pbs中測(cè)量方波，在-0.27v左右會(huì)有明顯的亞甲基藍(lán)的峰；根據(jù)多次掃描的方波電流的變化，可以判斷界面電子傳遞快慢和穩(wěn)定與否。

本發(fā)明的核酸傳感器的構(gòu)建過(guò)程中，組裝順序是關(guān)鍵，即先生成au-c鍵，再修飾dsdna，先在四氫呋喃(thf)的疏水環(huán)境中形成au-c鍵，在四氫呋喃疏水環(huán)境有利于au-c鍵的生成，再在水環(huán)境中生成dsdna和進(jìn)行-cooh和-nh2脫水縮合，在水環(huán)境中有利于提高dna結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和組裝牢固性，對(duì)后續(xù)目標(biāo)物的結(jié)合與檢測(cè)都是有利的。如果先進(jìn)行dna的雜交和羧基氨基脫水縮合，再反應(yīng)形成au-c鍵，則dna的組裝就會(huì)在疏水的thf疏水環(huán)境，其穩(wěn)定性便會(huì)受到影響。

本發(fā)明的核酸傳感器構(gòu)建方式包括以下具體步驟：

1)先將4-[(三甲基硅基)乙炔基]苯甲酸溶液與四丁基氟化銨溶液混合，取一定量的到型離心管中，倒扣在電極上，使電極完全浸泡在溶液中；黑暗中室溫放置1h，使4-[(三甲基硅基)乙炔基]苯甲酸脫三甲基硅烷保護(hù)基，通過(guò)au-c鍵修飾在金電極表面，得到4-羧基苯基乙炔基修飾的金電極；

2)進(jìn)行dna互補(bǔ)配對(duì)反應(yīng)，將dna1與dna2混合置于37℃，反應(yīng)2h，得到dsdna；dna1為一端修飾-nh2，另一端修飾biotin；dna2一端修飾亞甲基藍(lán)mb信號(hào)分子；dna1與dna2完全互補(bǔ)；

3)4-羧基苯基乙炔基修飾的金電極用四氫呋喃thf沖洗干凈；將dsdna溶液與edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽)和nhs(n-羥基琥珀酰亞胺)溶液混合，取在小型離心管中，倒扣在電極上，使電極完全浸泡在溶液中，在黑暗中室溫放置5h，使ds-dna的-nh2與4-[(三甲基硅基)乙炔基]苯甲酸的-cooh發(fā)生脫水縮合，從而使得dsdna連接到電極表面；

4)所述dsdna連接到電極上后，加入mch溶液進(jìn)行封閉，一方面對(duì)電極表面空位點(diǎn)進(jìn)行封閉，另一方面，除去非特異性結(jié)合的dsdna。

本發(fā)明的技術(shù)方案關(guān)鍵在于通過(guò)4-[(三甲基硅基)乙炔基]苯甲酸作為“橋鍵”將含亞甲基藍(lán)信號(hào)分子的dsdna鍵接到金電極表面，大大提高了核酸傳感器界面的穩(wěn)定性，同時(shí)提高了電子傳遞，有利于獲得更寬檢測(cè)范圍和提高靈敏度。4-[(三甲基硅基)乙炔基]苯甲酸通過(guò)脫保護(hù)基后通過(guò)碳-金鍵結(jié)合在金電極表面，大量實(shí)驗(yàn)表面，通過(guò)碳-金鍵穩(wěn)定性特別好，能夠大大提高界面穩(wěn)定性，同時(shí)將dsdna與金電極之間引入了具有大共軛體系基團(tuán)，能夠加速電子傳遞，使電流增大，有利于獲得更寬檢測(cè)范圍和檢測(cè)靈敏度。

相對(duì)現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的技術(shù)方案優(yōu)點(diǎn)在于：

1)本發(fā)明的傳感界面穩(wěn)定性好，電化學(xué)測(cè)試不會(huì)對(duì)信號(hào)產(chǎn)生影響；

2)本發(fā)明的傳感界面電子速度較快，有利于高靈敏性檢測(cè)；

3)本發(fā)明的傳感界面構(gòu)造用時(shí)較短，效率高。

4)本發(fā)明的傳感界面用于生物檢測(cè)，條件溫和，且上端修飾靈活可用于多種目標(biāo)物檢測(cè)。

附圖說(shuō)明

【圖1】為核酸傳感器合成路線；

【圖2】本發(fā)明的方波伏安法swv電化學(xué)檢測(cè)曲線；

【圖3】為對(duì)照組方波伏安法swv電化學(xué)檢測(cè)曲線。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例旨在進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明內(nèi)容，而不是限制本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1

(1)在電極上固定au-c鍵

先將10μl50μm的4-[(三甲基硅基)乙炔基]苯甲酸t(yī)hf溶液與100μl20μm的四丁基氟化銨thf溶液混合，取55μl與小型離心管中，倒扣在電極上，使電極完全浸泡在混合溶液中。黑暗中室溫放置1h，使之形成au-c鍵。

(2)雙鏈dna(dsdna)的形成

分別配制50μm的dna1tris-hcl溶液和10μm的dna2tris-hcl溶液，將兩種溶液混合置于37℃，反應(yīng)2h，因?yàn)閮蓷ldna是完全互補(bǔ)的，所以可以得到dsdna。

(3)dsdna與電極表面的連接

將電極用四氫呋喃thf沖洗干凈。將dsdna溶液與100μmedc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽)和100μmnhs(n-羥基琥珀酰亞胺)溶液等體積混合，取在小型離心管中，倒扣在電極上，使電極完全浸泡在溶液中。黑暗中室溫放置5h，使ds-dna的-nh2與4-[(三甲基硅基)乙炔基]苯甲酸的-cooh發(fā)生脫水縮合，從而使得dsdna連接到電極表面。之后，加入1mmmch溶液進(jìn)行封閉。一方面對(duì)電極表面空位點(diǎn)進(jìn)行封閉，另一方面，除去非特異性結(jié)合的dsdna。

(4)電化學(xué)檢測(cè)傳感界面

傳感界面構(gòu)建完成后，再進(jìn)行方波伏安法swv電化學(xué)檢測(cè)。通過(guò)mb電化學(xué)信號(hào)的大小及連續(xù)多次測(cè)試信號(hào)的穩(wěn)定性。

本發(fā)明采用現(xiàn)在電極組裝用的最多的au-s鍵做為對(duì)照組進(jìn)行比較，具體實(shí)驗(yàn)如下：將本實(shí)驗(yàn)中dna1的-nh2換成-sh-(ch2)6其他部分不變，將dna1與dna2在含有tcep的溶液中靜置，以打開(kāi)二硫鍵，之后在37℃混合孵育2h，得到雜交雙鏈dna。對(duì)金電極進(jìn)行預(yù)處理，將處理好的金電極浸在預(yù)處理后的雙鏈dna的混合液中，室溫靜置過(guò)夜，之后用二次蒸餾水和清洗液清洗；然后將電極浸在含有mch的溶液中，以封閉電極，之后用二次蒸餾水清洗；將上述步驟處理后的電極作為工作電極，和參比電極、對(duì)電極連接在化學(xué)工作站上，用方波伏安法檢測(cè)制備好的傳感器的亞甲基藍(lán)信號(hào)，并連續(xù)掃描多次。

圖2為本方法的swv電化學(xué)檢測(cè)曲線。圖2中五條曲線從上到下依次是連續(xù)掃描5次swv得到的曲線，可以看到在-0.27處的mb還原峰很高，峰電流很大，說(shuō)明這種方案的結(jié)合方式有利于mb與電極表面的電子傳遞；并且在連續(xù)多次掃描后，曲線仍然較穩(wěn)定，mb電流減弱很少，說(shuō)明這種方案的結(jié)合方式也很穩(wěn)定。

圖3為對(duì)照組的swv電化學(xué)檢測(cè)曲線。圖3中三條曲線從上到下依次是連續(xù)掃描3次swv得到的曲線，可以看到在-0.27處的mb還原峰很低，峰電流很小，說(shuō)明這種方案的結(jié)合方式不利于mb與電極表面的電子傳遞；并且在連續(xù)多次掃描后，曲線很不穩(wěn)定，mb電流減弱很多，說(shuō)明這種方案的結(jié)合方式是不穩(wěn)定的。

對(duì)照兩圖可知，圖2的方案多次掃描后仍然很穩(wěn)定，掃描對(duì)界面的影響可以忽略不計(jì)，而且mb的電流比圖3的更大，說(shuō)明本發(fā)明的這種界面構(gòu)建方式是成功的。