本發(fā)明涉及動(dòng)物細(xì)胞實(shí)驗(yàn)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種克氏原螯蝦染色體的制備方法。

背景技術(shù)：

克氏原螯蝦(procambarusclarkii)，隸屬于甲殼綱，十足目，螯蝦科，原螯蝦屬，原產(chǎn)于墨西哥北部和美國(guó)南部。于1929年左右引入我國(guó)，目前該蝦已成為我國(guó)一種重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物，為我國(guó)的經(jīng)濟(jì)作出了一定的貢獻(xiàn)。了解該蝦的染色體組型特征可以為進(jìn)一步研究該蝦的遺傳育種與品種改良以及控制奠定一定的理論基礎(chǔ)。

由于克氏原螯蝦的染色體形態(tài)較小、數(shù)目較多，一般的染色體制備方法很難得到分散好、形態(tài)清晰可辨的染色體圖片，這給克氏原螯蝦的組型分析帶來(lái)一定的困難。已有三篇文獻(xiàn)報(bào)道了克氏原螯蝦的染色體研究情況，其中只有最早的一篇文獻(xiàn)給出了該蝦染色體的組型分析結(jié)果(murofushietal.karyologicalstudyoftheredswampcrayfishandthejapaneselobsterbyair-dryingmethod.proc.japanacad.,ser.b,1984,60(b):306-309)，另兩篇文獻(xiàn)只給出了染色體分裂相的圖片，因染色體形態(tài)可辨性差沒(méi)有進(jìn)一步給出組型分析結(jié)果(朱越雄等，克氏原螯蝦染色體研究.水產(chǎn)養(yǎng)殖，1997，3：1-13；2.radwanetal.cytogeneticcharacterizationandgeneticvariationsbetweenfreshwatercrayfishprocambarusclarkiiinegypt.rjpbcs,2014,5(2):1801-1816)。這三篇文獻(xiàn)給出的克氏原螯蝦染色體數(shù)目上存在一定的出入，文獻(xiàn)提到的制備染色體的組織多為精巢，而只有當(dāng)精巢處于生殖發(fā)育期才易得到中期分裂相?，F(xiàn)有的方法限制了采樣的時(shí)間。因此，尋找一種更適合該蝦染色體的制備方法，且樣本采集時(shí)間不受季節(jié)限制，可為該蝦染色體數(shù)目的確定及其組型分析等研究奠定基礎(chǔ)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對(duì)克氏原螯蝦染色體較小、數(shù)量較多、不易得到分散好的染色體分裂中期相、樣本采集時(shí)間受限制等問(wèn)題，提供一種染色體分散好，形態(tài)可辨且可數(shù)的改進(jìn)的克氏原螯蝦染色體的制備方法，本發(fā)明涉及的樣本采集時(shí)間不受季節(jié)的限制。

實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種克氏原螯蝦染色體制備方法，包括以下步驟：

(1)前期處理：按照克氏原螯蝦蝦體重6ug/g的劑量向肌肉內(nèi)注射植物血凝素(pha)，間隔12h后按同樣劑量注射第二次，間隔3h后按5ug/g克氏原螯蝦蝦體重的劑量注射1mg/ml的秋水仙素，注射秋水仙素4h后取樣；

(2)利用離心法制備細(xì)胞：取蝦的觸角腺組織，置于生理鹽水中漂洗，然后放入有500ul生理鹽水的1.5ml離心管中，用小剪子將組織剪碎成泥狀，全部移入10ml試管，在500r/min下離心3min，離心后取上清液，在1000r/min下離心10min，棄上清液；

(3)低滲、預(yù)固定：用滴管將細(xì)胞吹散，緩慢加入0.75％kcl溶液至5ml，室溫下放置30min后加1ml的固定液-1，在1000r/min下離心10min，棄去上清液，留少許上清液，將細(xì)胞吹散；

(4)固定：加入5ml的固定液-1固定1.5h，中間更換3次固定液-1，每次在1000r/min下離心10min，最后一次留少許上清液，將細(xì)胞緩慢吹散后，加入適量固定液-2，將細(xì)胞混合均勻，30min后制片；

(5)噴片：將預(yù)冷的載玻片斜放，用滴管吸取適量的細(xì)胞懸液，垂直快而有力的噴到載玻片上，酒精燈火焰上快速烤2-3s后，在空氣下干燥；

(6)染色：采用瑞士-姬姆薩染色套組(購(gòu)自武漢谷歌生物科技有限公司)，該染色套組分a液和b液，按a液和b液體積比為1:2配制)對(duì)附著有染色體的玻片進(jìn)行染色；

(7)在顯微鏡下觀察和拍照；

其中：

步驟(2)中的生理鹽水組分為：nacl7.5g/l，cacl20.2g/l，kcl0.2g/l，nahco20.02g/l；

步驟(4)中的固定液-1為甲醇和冰醋酸按3:1體積比進(jìn)行配制；固定液-2為甲醇和冰醋酸按照1:1體積比進(jìn)行配制。固定液-1和固定液-2現(xiàn)用現(xiàn)配，置于冰上備用。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1.本發(fā)明采用的是觸角腺樣本制備細(xì)胞，克服了取樣的時(shí)間限制，一年四季均可以制備染色體，不需要等到克氏原螯蝦性腺發(fā)育成熟期采樣進(jìn)行制備。

2.本發(fā)明采用離心法獲得細(xì)胞，可以避免制片時(shí)因細(xì)胞碎屑較多引起的染色體的背景干染。

3.本發(fā)明方法得到的染色體分散較好，形態(tài)可辨且可數(shù)，分裂相背景淺，易于觀察，得出的染色體數(shù)目準(zhǔn)確度高。

4.本發(fā)明的方法簡(jiǎn)便，一般實(shí)驗(yàn)室均可以操作。

附圖說(shuō)明

圖1：本發(fā)明制備的克氏原螯蝦成年蝦的染色體分裂相圖片。

圖2：本發(fā)明制備的克氏原螯蝦青年蝦的染色體分裂相圖片。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明提供的具體實(shí)施方式作詳細(xì)說(shuō)明。

實(shí)施例1克氏原螯蝦成年蝦的染色體的制備

1.試劑配制及相關(guān)材料的準(zhǔn)備：

(1)生理鹽水的配制：

7.5gnacl；

0.2gcacl2；

0.2gkcl；

0.02gnahco2；

用去離子水定容至1000ml。

(2)植物血凝素(pha)：濃度2mg/ml，溶劑是滅菌的生理鹽水。

(3)秋水仙素：1mg/ml，溶劑是滅菌的生理鹽水。

(4)0.75％kcl溶液：將0.75g的kcl溶于100ml滅菌的ddh2o中；

(5)固定液-1：按甲醇和冰醋酸體積比為3:1配制，現(xiàn)用現(xiàn)配，冰上預(yù)冷。

(6)固定液-2：按甲醇和冰醋酸體積比為1:1配制，現(xiàn)用現(xiàn)配，冰上預(yù)冷。

(7)吉姆薩染液：采用的是瑞士-姬姆薩染色套組(購(gòu)自武漢谷歌生物科技有限公司，該姬姆薩染色套組分a液b液，按照a液:b液的體比為1:2進(jìn)行配制，現(xiàn)用現(xiàn)配。

(8)載玻片處理：用洗潔精將載玻片清洗干凈，在65℃恒溫箱中干燥2h，沒(méi)有水漬后自然冷卻后浸泡于95％酒精中過(guò)夜，取出后在超凈臺(tái)內(nèi)晾干，漿干燥后的載玻片密封起來(lái)置于4℃冰箱內(nèi)貯藏。

2.選取健康無(wú)傷、活力好的克氏原螯蝦成年蝦，體重在35-40g左右；按以下步驟對(duì)染色體進(jìn)行制備：

(1)前期處理：按照6ug/g蝦體重向克氏原螯蝦成年蝦肌肉注射植物血凝素(pha)，間隔12h后按同樣劑量注射第二次，再間隔3h后注射1mg/ml秋水仙素(劑量為5ug/g蝦體重)，注射秋水仙素4h后取樣；

(2)細(xì)胞制備：取克氏原螯蝦蝦的觸角腺，置于生理鹽水中漂洗，然后放入有500ul生理鹽水的1.5ml離心管中，用小剪子將組織剪碎成泥狀，全部移入10ml試管，在500r/min下離心3min，離心后取上清液，在1000r/min下離心10min，棄上清液；

(3)低滲、預(yù)固定：用滴管將細(xì)胞吹散，緩慢加入0.75％kcl溶液至5ml，室溫低滲處理30min后加1ml固定液-1，在1000r/min下離心10min，棄去上清液，留少許上清液，將細(xì)胞吹散；

(4)固定：加入5ml的固定液-1固定1.5h，中間更換3次固定液-2，每次1000r/min離心10min，最后一次留少許上清液，將細(xì)胞緩慢吹散后，加入適量的固定液-2，將細(xì)胞混合均勻，30min后制片；

(5)噴片：將預(yù)冷的載玻片斜放，用滴管吸取適量的細(xì)胞懸液，垂直快而有力的噴到載玻片上，酒精燈火焰上快速烤兩下后(2-3s)，在空氣下干燥；

(6)染色：瑞士-姬姆薩染色套組(購(gòu)自武漢谷歌生物科技有限公司，其中：姬姆薩染色套組分a液和b液，按體積比＝1:2混合)染色5-10min后用蒸餾水沖洗，附著有染色體的玻片涼干后即可觀察。

(7)觀察：在顯微鏡的油鏡下選擇分散良好，形態(tài)清晰，數(shù)目完整的中期分裂相，進(jìn)行顯微拍照，結(jié)果見(jiàn)圖1。

實(shí)施例2克氏原螯蝦青年蝦的染色體制備

選取健康無(wú)傷、活力好的克氏原螯蝦青年蝦，體重在15-20g左右。實(shí)驗(yàn)試劑配制和相關(guān)材料的準(zhǔn)備以及實(shí)驗(yàn)步驟同實(shí)施例1，鏡檢結(jié)果見(jiàn)圖2。