本發(fā)明屬于復(fù)雜樣品中手性異構(gòu)體分離、分析檢測(cè)技術(shù)研究，具體涉及一種卷煙主流煙氣中煙堿旋光異構(gòu)體的正相液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法，主要是劍橋?yàn)V片捕集卷煙主流煙氣總粒相物，用naoh溶液-正己烷提取濾片上的煙堿，采用手性色譜柱分離煙堿旋光異構(gòu)體，柱后高壓輸液泵引入異丙醇并進(jìn)行分流，結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜分析。
背景技術(shù)：
：煙堿是煙草和煙氣中含量最豐富的生物堿，是人類(lèi)吸煙的主要?jiǎng)恿Α焿A有兩個(gè)旋光異構(gòu)體，即s-(-)-煙堿和r-(+)-煙堿。二者具有完全不同的代謝機(jī)理和生理特性，s-(-)-煙堿的生理活性和毒性比r-(+)-煙堿更強(qiáng)。因此，煙堿旋光異構(gòu)體的分離分析在藥學(xué)和吸煙與健康方面具有重要意義。天然煙草中的煙堿主要是s-(-)-煙堿，而r-(+)-煙堿僅占煙堿總量的0.2~0.3%。卷煙煙氣中r-(+)-煙堿比煙草中略高，占煙堿總量的3.0%左右。目前文獻(xiàn)報(bào)道煙堿旋光異構(gòu)體的分析方法主要是手性色譜柱-二維氣相色譜法、手性色譜柱-液相色譜法等。手性色譜柱-二維氣相色譜法存在的問(wèn)題分析時(shí)間長(zhǎng)；而手性色譜柱-液相色譜法存在的問(wèn)題是靈敏度較低，對(duì)含量較低的r-(+)-煙堿難以實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確定量。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是針對(duì)以上問(wèn)題，提出了一種正相液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析卷煙主流煙氣中煙堿旋光異構(gòu)體。采用手性色譜柱-正相液相色譜法實(shí)現(xiàn)了煙堿旋光異構(gòu)體的分離；為滿(mǎn)足串聯(lián)質(zhì)譜分析的要求，采用高壓輸液泵柱后引入異丙醇并進(jìn)行分流，有利于離子化效率及方法靈敏度的提高，從而實(shí)現(xiàn)卷煙煙氣中煙堿旋光異構(gòu)體的測(cè)定。本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：一種卷煙主流煙氣中煙堿旋光異構(gòu)體的正相液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法，是采用劍橋?yàn)V片捕集卷煙主流煙氣總粒相物，用naoh溶液-正己烷提取濾片上的煙堿，通過(guò)手性色譜柱分離煙堿旋光異構(gòu)體，柱后高壓輸液泵引入異丙醇并進(jìn)行分流，結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行分析測(cè)定，具體步驟如下：a、卷煙主流煙氣粒相物中煙堿的捕集及萃?。翰捎脛?yàn)V片捕集卷煙主流煙氣總粒相物，將濾片置于具塞錐形瓶中，加入1~5ml5.0%naoh溶液，靜置5~30min，準(zhǔn)確加入含有內(nèi)標(biāo)的正己烷溶液10~50ml，超聲萃取5~30min，取上層清液過(guò)有機(jī)相濾膜，有機(jī)相濾膜上加有1~3.0g無(wú)水硫酸鈉，凈化后的樣品溶液進(jìn)正相液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析。b、樣品的分析：液相色譜條件：采用正相液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析，所用色譜柱為手性色譜柱；柱溫：30oc；流動(dòng)相a：含有堿性添加劑的正己烷，流動(dòng)相b：異丙醇；等度洗脫；流速0.5~1.0ml/min；進(jìn)樣體積10μl，分析時(shí)間為17min。柱后加入異丙醇及分流：為提高正相液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的靈敏度，實(shí)現(xiàn)煙堿旋光異構(gòu)體定量分析的要求，在柱后通過(guò)三通閥連接，采用安捷倫高壓輸液泵引入異丙醇，控制異丙醇流速。同時(shí)，為適應(yīng)質(zhì)譜分析的要求，進(jìn)行柱后分流以減少進(jìn)入質(zhì)譜的溶劑量。采用離子源上配置的三通閥進(jìn)行柱后分流，通過(guò)控制peek管的長(zhǎng)度，控制分流比。離子源：電噴霧電離源（esi）；掃描方式：正離子掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)mrm；電噴霧電壓：5000v；氣簾氣壓力：30psi；輔助氣1壓力：70psi；輔助氣2壓力：70psi；離子源溫度：550oc。各化合物及內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間、母離子、子離子、碰撞能量（ce）及去簇電壓（dp）參見(jiàn)表1。在本發(fā)明中，步驟a中所述內(nèi)標(biāo)為：采用外消旋的d3-煙堿為內(nèi)標(biāo)，d3-s-(-)-煙堿和d3-r-(+)-煙堿合并計(jì)算，濃度范圍為1~10mg/ml。步驟b中所述的手性色譜柱為大賽璐手性色譜柱chiralpak?ic，規(guī)格為4.6mm×250mm，i.d.5μm；堿性流動(dòng)相添加劑為二乙胺，添加量為正己烷質(zhì)量的0.02%~0.2%；所述的等度洗脫條件為a:b=95：5；柱后加入異丙醇流速為0.1~1.0ml/min；柱后分流比例為1:3~1:5。本發(fā)明采用正己烷配制煙堿旋光異構(gòu)體混合母液用于配制標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，氘代內(nèi)標(biāo)溶液和標(biāo)準(zhǔn)工作溶液同樣采用正己烷配制。分別對(duì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行正相液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析，并以s-(-)-煙堿和r-(+)-煙堿與內(nèi)標(biāo)物峰面積比對(duì)濃度比進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得到各目標(biāo)化合物的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)。取最低濃度標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，10次平行測(cè)定，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差，3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差為檢測(cè)限，10倍標(biāo)準(zhǔn)偏差為定量限，結(jié)果見(jiàn)表2。本發(fā)明的有益效果如下：（1）首次采用正相液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法實(shí)現(xiàn)了卷煙主流煙氣中煙堿旋光異構(gòu)體的分離檢測(cè)；（2）由于正相液相色譜流動(dòng)相主要為非極性溶劑（正己烷），離子化效率低，不適合質(zhì)譜檢測(cè)。因此，采用柱后高壓輸液泵引入異丙醇，提高極性溶劑的比例，以提高質(zhì)譜離子化效率和分析的靈敏度。同時(shí)，為了進(jìn)一步提高質(zhì)譜的霧化和離子化效率，在加入異丙醇后再進(jìn)行柱后分流，減少進(jìn)入質(zhì)譜的溶劑量，滿(mǎn)足液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析的要求，提高分析的靈敏度；（3）與文獻(xiàn)報(bào)道方法比較，本發(fā)明兩種煙堿旋光異構(gòu)體的色譜分離度高（保留時(shí)間相差1min）；分析時(shí)間短（僅需17min）；方法靈敏度高，滿(mǎn)足含量較低的r-(+)-煙堿的定量要求。附圖說(shuō)明圖1為煙堿旋光異構(gòu)體的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)質(zhì)譜（mrm）圖其中：a為s-(-)-煙堿，b為r-(+)-煙堿。具體實(shí)施方式本發(fā)明以下將結(jié)合實(shí)施例作進(jìn)一步說(shuō)明：實(shí)施例1（1）將平衡及篩選后的卷煙按照yc/t29-1996規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)條件抽吸，用劍橋?yàn)V片捕集5支卷煙主流煙氣中的粒相物。將捕集粒相物的劍橋?yàn)V片折疊放入50ml具塞錐形瓶中，加入3ml5.0%naoh溶液，靜置15min，準(zhǔn)確加入含有d3-煙堿外消旋體的正己烷溶液20ml，外消旋的d3-煙堿濃度為5mg/ml，超聲萃取30min，取上層清液過(guò)針筒中加有2.0g無(wú)水硫酸鈉的有機(jī)相濾膜，濾出液進(jìn)正相液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析。（2）儀器分析：采用正相液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析，所用色譜柱為大賽璐手性色譜柱chiralpak?ic，規(guī)格為4.6mm×250mm，i.d.5μm；柱溫：30oc；流動(dòng)相a：含有0.1%二乙胺的正己烷，流動(dòng)相b：異丙醇；95%a+5%b等度洗脫；流速1.0ml/min；進(jìn)樣體積10μl，分析時(shí)間為17min。采用安捷倫高壓輸液泵進(jìn)行柱后加入異丙醇，控制異丙醇流速為1ml/min；并利用離子源上配置的三通閥進(jìn)行柱后分流，控制分流比為1:5。采用esi離子源，正離子掃描模式；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)mrm；電噴霧電壓：5000v；氣簾氣壓力：30psi；輔助氣1壓力：70psi；輔助氣2壓力：70psi；離子源溫度：550oc。實(shí)施例2選取5種典型卷煙樣品，按照實(shí)施例1所述的分析方法，測(cè)定卷煙主流煙氣總粒相物中煙堿旋光異構(gòu)體的含量，結(jié)果如表3所示。表3：卷煙主流煙氣中煙堿旋光異構(gòu)體的含量（mg/支）樣品編號(hào)s-(-)-煙堿r-(+)-煙堿1#0.10.0032#0.30.0083#0.60.0194#0.80.0225#1.10.033當(dāng)前第1頁(yè)12