適用于水產(chǎn)品中46種藥物的篩查方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分析化學(xué)領(lǐng)域，涉及一種適用于水產(chǎn)品中46種藥物的篩查方法，即， 適用于水產(chǎn)品中46種藥物殘留的液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿/飛行時(shí)間質(zhì)譜篩查方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 水產(chǎn)品中藥物使用情況較普遍，且存在過量濫用、違規(guī)使用等現(xiàn)象。濫用和違規(guī)使 用藥物不僅會(huì)造成環(huán)境的惡化污染，更會(huì)通過食物鏈的富集作用轉(zhuǎn)移到人體中，對(duì)人體健 康產(chǎn)生危害。水產(chǎn)用藥涉及種類繁多，因此建立一個(gè)普適的通用篩查方法十分有必要。
[0003]目前常用的藥物殘留檢測(cè)方法有酶聯(lián)免疫法、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法、液相色譜法 和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法等。其中基于多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式的液相色譜/三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián) 用技術(shù)（LC-MS/MS)具有靈敏度高、準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好等特點(diǎn)，在藥物殘留檢測(cè)中的應(yīng)用 最為普遍。但LC-MS/MS方法大都只能針對(duì)某一類目標(biāo)化合物，面對(duì)多組分藥物殘留需要建 立多個(gè)檢測(cè)方法，造成樣品反復(fù)測(cè)定，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。目前，基于四極桿/飛行時(shí)間質(zhì)譜（Q-T0F/ MS)的高分辨率質(zhì)譜技術(shù)為多組分目標(biāo)化合物的分析提供了新的研究方向。Q-T0F/MS技術(shù) 具有高特異性、高質(zhì)量準(zhǔn)確度、高質(zhì)量分辨率等優(yōu)點(diǎn)，理論上能夠在一次檢測(cè)過程中分析數(shù) 百種化合物。該技術(shù)通過建立不同種類化合物數(shù)據(jù)庫(kù)匹配檢索，可以方便、快速地對(duì)不同種 類的藥物進(jìn)行篩查與鑒定。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種采用液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿/飛行時(shí)間質(zhì)譜 方法快速、準(zhǔn)確地定性定量測(cè)定水產(chǎn)品中46種藥物的檢測(cè)方法。
[0005] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種適用于水產(chǎn)品中46種藥物的篩查方法 (適用于水產(chǎn)品中46種藥物的高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用方法高通量快速篩查方 法），46種藥物（目標(biāo)藥物）為磺胺胍、磺胺吡啶、磺胺嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺噻唑、惡喹 酸、磺胺甲嘧啶、磺胺二甲異唑、磺胺甲二唑、磺胺二甲基嘧啶、磺胺二甲基異嘧啶、磺胺對(duì) 甲氧基嘧啶、磺胺間甲氧基嘧啶、磺胺氯噠嗪、磺胺喹惡啉、磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺二甲基 噠嗪、諾氟沙星、依諾沙星、環(huán)丙沙星、培氟沙星、洛美沙星、丹諾沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、 氟羅沙星、沙拉沙星、司帕沙星、奧比沙星、雙氟沙星、青霉素G、氨芐西林、阿莫西林、苯唑西 林、萘夫西林、頭孢氨芐、頭孢匹林、頭孢唑林、頭孢洛寧、頭孢匹羅、頭孢喹肟、紅霉素、甲基 睪丸酮、丙酸睪酮、群勃龍和諾龍；依次進(jìn)行以下步驟：
[0006] (A)樣品提取：待測(cè)水產(chǎn)品經(jīng)過提取液提取后靜置，并用去離子水稀釋（10倍~20 倍）后過玻璃纖維濾膜（孔徑1. 5μm)，得稀釋液；
[0007] (B)固相小柱萃?。豪霉滔噍腿⌒≈鶎?duì)生物樣品中所含的藥物（46種藥物）進(jìn) 行富集，固相萃取小柱為OasisHLB小柱，使用前先用甲醇（6mL)活化，超純水（6mL)淋洗， 再將稀釋液（50~100mL)通過活化好的HLB柱；富集過程中流速保持為4~6mL/min(較 佳5mL/min)，整個(gè)過程保持小柱濕潤(rùn)；
[0008] (C)溶劑洗脫：利用有機(jī)試劑將目標(biāo)藥物（S卩，上述46種目標(biāo)藥物）從固相萃取 柱上洗脫下來；
[0009] (D)濃縮與定容：對(duì)洗脫液進(jìn)行濃縮，溶劑替換、定容，過膜（0· 22μm有機(jī)濾膜） 后保存；
[0010] (E)上機(jī)篩查：通過液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿/飛行時(shí)間質(zhì)譜對(duì)樣品進(jìn)行篩查和鑒 定，液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿/飛行時(shí)間質(zhì)譜條件為：
[0011] 高效液相色譜儀：HPLC-Agilentl290 ;
[0012] 色譜柱：AgilentPlusC18 柱，尺寸為 3.OnmX100nm，1. 8μm;
[0013] 柱溫：4(TC;
[0014] 流速：0· 25mL/min；
[0015] 梯度洗脫流動(dòng)相：
[0016] A:加入甲酸的5mmol乙酸銨水溶液，甲酸的體積濃度為0. 1% ;
[0017] B:加入甲酸的甲醇，甲酸的體積濃度為0. 1 % ;
[0018] 流動(dòng)相梯度：
[0019]
[0020] 質(zhì)譜儀：AgilentQ-T0F6540 ;
[0021] 離子源：DualAgilentJetStreamElectrosprayIonization(DualAJSESI) 源；
[0022] 電離模式：正離子模式；
[0023] MS掃描范圍：100-1000m/z;
[0024] MS/MS碰撞電壓固定3個(gè)強(qiáng)度通道（碰撞電壓分別10eV，20eV，40eV);
[0025] 進(jìn)樣量：2yL;
[0026] 采用全掃描模式，調(diào)用已建立的質(zhì)譜一級(jí)篩查譜庫(kù)（如表1所述）以分子式匹配 模式自動(dòng)檢索，質(zhì)量允許誤差設(shè)置5ppm;
[0027] (F)確證：對(duì)篩查發(fā)現(xiàn)的可疑化合物采用二級(jí)質(zhì)譜信息庫(kù)進(jìn)一步確證；
[0028] 具體為：
[0029] 通過一級(jí)篩查譜庫(kù)對(duì)樣品進(jìn)行46種化合物篩查匹配，一級(jí)篩查譜庫(kù)具體要素包 括化合物精確質(zhì)量數(shù)，化合物質(zhì)譜同位素峰豐度信息以及化合物的色譜保留時(shí)間，每個(gè)要 素權(quán)重相同，并以此篩查匹配得分；對(duì)匹配得分超過70分的篩查結(jié)果確認(rèn)其為疑似化合 物，采用targetms/ms模式對(duì)其進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜信息采集，與建立的二級(jí)質(zhì)譜信息庫(kù)（如表 1所述）進(jìn)行匹配確證，如有兩個(gè)二級(jí)特征碎片離子能夠匹配成功的，即為確證；
[0030] 備注說明：二級(jí)質(zhì)譜信息就是該化合物母離子所對(duì)應(yīng)的二級(jí)特征質(zhì)譜碎片離子信 息（即子離子），至少要求兩個(gè)子離子碎片信息；
[0031] 一級(jí)篩查時(shí)，匹配得分< 70分，即確定不含有此化合物，因此，無需上述確證；
[0032] (G)定量：對(duì)于經(jīng)過確證的化合物，采用空白樣品基質(zhì)溶液配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，外標(biāo)法 定量。
[0033] 作為本發(fā)明的適用于水產(chǎn)品中46種藥物的篩查方法的改進(jìn)：所述步驟（A)中的提 取液是由乙腈和水按體積比3:2配置而成。
[0034] 作為本發(fā)明的適用于水產(chǎn)品中46種藥物的篩查方法的進(jìn)一步改進(jìn)：所述步驟（C) 中的有機(jī)溶劑是體積比為1:1的乙腈和甲醇的混合溶劑。洗脫1次即可。
[0035] 作為本發(fā)明的適用于水產(chǎn)品中46種藥物的篩查方法的進(jìn)一步改進(jìn)：所述步驟（D) 中對(duì)洗脫液進(jìn)行濃縮是用隊(duì)緩緩吹掃溶劑至近干；所述溶劑替換是用乙腈進(jìn)行復(fù)溶；所述 的定容是用體積濃度1%甲酸水溶液定容。
[0036] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下顯著效果：
[0037] 采用液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿/飛行時(shí)間質(zhì)譜高分辨率、高精確質(zhì)量數(shù)的特點(diǎn)，所 得定性結(jié)果比液相色譜-串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜更準(zhǔn)確可靠，并且采用定性同時(shí)進(jìn)行定量測(cè) 定。
[0038] 本發(fā)明前處理簡(jiǎn)單，操作易行，并且可以利用該儀器的目標(biāo)化合物掃描模式來對(duì) 化合物進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜全掃之后的二級(jí)質(zhì)譜掃描，從而增強(qiáng)該方法的靈敏度和可信度，數(shù)據(jù) 分析與處理的結(jié)果呈現(xiàn)簡(jiǎn)單明了，定性評(píng)價(jià)綜合全面，可以實(shí)現(xiàn)傳統(tǒng)儀器較難達(dá)到的全面 篩選多組分藥物這一功能。
[0039] 綜上所述，本發(fā)明采用基于液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)建立的水產(chǎn)品中磺胺 胍、磺胺吡啶、磺胺嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺噻唑、惡喹酸、磺胺甲嘧啶、磺胺二甲異唑、磺胺 甲二挫、磺胺二甲基嘧啶、磺胺二甲基異嘧啶、磺胺對(duì)甲氧基嘧啶、磺胺間甲氧基嘧啶、磺胺 氯噠嗪、磺胺喹惡啉、磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺二甲基噠嗪、諾氟沙星、依諾沙星、環(huán)丙沙星、 培氟沙星、洛美沙星、丹諾沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、氟羅沙星、沙拉沙星、司帕沙星、奧比 沙星、雙氟沙星、青霉素G、氨芐西林、阿莫西林、苯唑西林、萘夫西林、頭孢氨芐、頭孢匹林、 頭孢唑林、頭孢洛寧、頭孢匹羅、頭孢喹肟、紅霉素、甲基睪丸酮、丙酸睪酮、群勃龍和諾龍的 高通量快速篩查方法，并可對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行定性確證與定量。
【附圖說明】
[0040] 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0041] 圖1是實(shí)施例1中的46種藥物的提取離子流圖；
[0042] 圖 1 中：Cpd59:Di