本發(fā)明涉及一種毛細(xì)管動態(tài)涂層的制備方法。
背景技術(shù)：
：毛細(xì)管電泳儀作為一種分離分析儀器，具備高效、快速、進(jìn)樣少、污染少、自動化程度高等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)的分離。但是由于毛細(xì)管儀在電泳過程中產(chǎn)生的電滲流不穩(wěn)定，另外，內(nèi)壁的負(fù)電性和親水性導(dǎo)致分析物極易被吸附，極大地影響蛋白質(zhì)和多肽分離的重現(xiàn)性和分離效率。一般認(rèn)為，蛋白質(zhì)等電點(diǎn)在8以上或者分子量超過50kda即難以在裸露的毛細(xì)管中進(jìn)行分析。為了克服毛細(xì)管壁的吸附作用，許多方法已被采用，如使用極端ph值緩沖液、添加高離子強(qiáng)度的電解質(zhì)以及涂層技術(shù)等。前二者會限制分離的選擇性并可能導(dǎo)致蛋白變性。涂層技術(shù)指在毛細(xì)管內(nèi)壁以物理或化學(xué)方法形成不同性質(zhì)的涂層。毛細(xì)管涂層的形成方法大致可以分為三類，即動態(tài)吸附、物理涂布和化學(xué)鍵合?；瘜W(xué)和物理涂層法主要通過物理吸附或化學(xué)交聯(lián)等方法在管壁內(nèi)側(cè)形成單分子層或交聯(lián)的涂層，掩蔽毛細(xì)管內(nèi)壁的負(fù)電荷，從而達(dá)到抑制吸附的目的。涂層毛細(xì)管會隨使用次數(shù)的增加而受損，對應(yīng)的分離重現(xiàn)性也相應(yīng)變差。動態(tài)涂層指將涂層材料添加到緩沖液中，不斷吸附到毛細(xì)管內(nèi)壁，以補(bǔ)充管壁的解吸附材料，維持涂層穩(wěn)定。因此，動態(tài)涂層具有較好的重現(xiàn)性和分離效果。目前文獻(xiàn)報道的陽離子多聚物涂層材料大多需要實(shí)驗(yàn)室自行合成，涂層制作過程相對復(fù)雜，涂層材料耐受酸堿的能力有限，并未找到一種對所有種類蛋白質(zhì)的分離都有效的普適性涂層。因此，尋求新的涂層材料，簡化涂層制作技術(shù)，不斷提高其分離復(fù)雜蛋白成分的能力，是毛細(xì)管動態(tài)涂層研究的一個重要方向。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的一個目的是提供一種毛細(xì)管動態(tài)涂層的制備方法。本發(fā)明所提供的毛細(xì)管動態(tài)涂層的制備方法，包括下述步驟：1)對毛細(xì)管進(jìn)行活化；2)用陽離子型聚乙烯吡咯烷酮水溶液沖洗活化后的毛細(xì)管，然后運(yùn)行緩沖液進(jìn)行沖洗。其中，所述陽離子型聚乙烯吡咯烷酮(cpvp)水溶液的質(zhì)量-體積濃度為0.001-0.5％(g/100ml)。具體的cpvp濃度可根據(jù)使用情況進(jìn)行調(diào)節(jié)。當(dāng)采用cpvp動態(tài)涂層檢測電滲流時，因?yàn)楹艿蜐舛萩pvp即可調(diào)節(jié)電滲流，所以cpvp水溶液的質(zhì)量-體積濃度選擇0.001-0.25％(g/100ml)。當(dāng)采用cpvp動態(tài)涂層分離蛋白時，由于抑制毛細(xì)管壁吸附需要更高濃度的cpvp，所以cpvp水溶液的質(zhì)量-體積濃度選擇0.1-0.5％(g/100ml)。所述緩沖液為磷酸鹽緩沖液，所述磷酸鹽緩沖液的濃度可為10-50mm，具體可為10mm、20mm、30mm、40mm或50mm；ph值可為3.0-8.0，具體可為ph3.0、ph6.5、ph7.0、ph7.5或ph8.0。所述用陽離子型聚乙烯吡咯烷酮水溶液沖洗毛細(xì)管的沖洗壓力可為15-25psi，優(yōu)選20psi，沖洗時間為10-20分鐘。所述緩沖溶液的沖洗壓力為可為15-25psi，優(yōu)選20psi；沖洗時間為10-20分鐘。為了使涂層更好的平衡，所述步驟2)中，用陽離子型聚乙烯吡咯烷酮的水溶液沖洗毛細(xì)管后運(yùn)行緩沖液之前，還包括靜置的步驟；所述靜置的時間為4-10分鐘。利用上述具有動態(tài)涂層的毛細(xì)管分離蛋白時，為了減少蛋白對毛細(xì)管壁的吸附，所述方法還包括：對所制備的動態(tài)涂層用高電壓進(jìn)行預(yù)分離的步驟；所述高電壓為10-12kv，分離的時間為2-4分鐘。本發(fā)明中所述陽離子型聚乙烯吡咯烷酮是由二甲基二烯丙基氯化銨和乙烯吡咯烷酮共聚得到的。所述陽離子化的聚乙烯吡咯烷酮的粘均分子量可為20000-25000。所述步驟1)對毛細(xì)管進(jìn)行活化的方法可按照本領(lǐng)域常規(guī)的活化方法進(jìn)行，具體步驟可參考下述方法：1mnaoh20psi沖洗15-20分鐘，超純水20psi沖洗10分鐘，運(yùn)行緩沖液20psi沖洗20-30分鐘備用。所述運(yùn)行緩沖液為磷酸鹽緩沖液，所述磷酸鹽緩沖液的濃度可為10-50mm，ph值可為3.0-8.0。所述陽離子型聚乙烯吡咯烷酮具體可按照如下方法制備得到：在裝有磁力攪拌器、溫度計和通n氣管的反應(yīng)器中加入一定量的二甲基二烯丙基氯化銨(diallyldimethylammoniumchloriddadmac)、乙烯吡咯烷酮(vinylpyrrolidonvp)(二者質(zhì)量比為1：4)、引發(fā)劑2，2一偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽(為單體質(zhì)量的0.25％)，加入一定量蒸餾水溶解，使vp濃度為0.5g/ml。升溫至65℃，反應(yīng)5h，得到膠體，加適量水溶解，然后用丙酮沉淀。濾出沉淀并真空干燥即為目標(biāo)共聚物。上述方法制備得到的具有動態(tài)涂層的毛細(xì)管也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明的再一個目的是提供上述具有動態(tài)涂層的毛細(xì)管在毛細(xì)管電泳分離蛋白質(zhì)中的應(yīng)用。所述蛋白質(zhì)優(yōu)選為堿性蛋白質(zhì)。所述蛋白質(zhì)具體可選自下述至少兩種：牛胰凝乳蛋白酶原、核糖核酸酶a、雞心細(xì)胞色素c、肌紅蛋白和伴清蛋白。所述毛細(xì)管電泳分離上述蛋白質(zhì)的電泳條件為：分離電壓反向12kv，檢測波長214nm，毛細(xì)管溫度25℃，樣品托盤溫度10℃，電泳時間45-50分鐘。由于聚乙烯吡咯烷酮極易被水沖掉，不適合用于動態(tài)涂層，一般只能作為毛細(xì)管共價涂層材料，限制了其使用范圍。而本發(fā)明采用陽離子化的聚乙烯吡咯烷酮(cationicpolyvinylpyrrolidonecpvp)作為涂層材料，對毛細(xì)管柱進(jìn)行動態(tài)修飾，這種陽離子化的涂層材料能夠穩(wěn)定反向電滲流。同時通過對毛細(xì)管電泳運(yùn)行中的各項參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，建立了一個穩(wěn)定涂層制備的實(shí)驗(yàn)流程和技術(shù)方法，可控制電滲流、抑制管壁吸附，有效地提升毛細(xì)管電泳分離堿性蛋白的能力，分離效率最高達(dá)3.2×105。附圖說明圖1為實(shí)施例1制備的cpvp的紫外吸收光譜圖。圖2為cpvp濃度對電滲流的影響圖。圖3為ph值對電滲流的影響圖。圖4為50mmph6.5磷酸鹽緩沖液電泳分離蛋白標(biāo)準(zhǔn)品混合物；其中1：伴清蛋白；2：肌紅蛋白；3：牛胰凝乳蛋白酶原；4：核糖核酸酶a；5：雞心細(xì)胞色素c。圖5為不同濃度運(yùn)行緩沖液電泳分離蛋白標(biāo)準(zhǔn)品混合物。具體實(shí)施方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、cpvp的制備及性能測試1.cpvp的制備依據(jù)文獻(xiàn)報道(林媚林美玉朱煒等，陽離子型聚乙烯吡咯烷酮的制備及其負(fù)載rna性能。應(yīng)用化學(xué)，2014，第31卷第6期。)，合成該化合物。具體方法為：在裝有磁力攪拌器、溫度計和通n氣管的反應(yīng)器中加入一定量的二甲基二烯丙基氯化銨(diallyldimethylammoniumchloriddadmac)、乙烯吡咯烷酮(vinylpyrrolidonvp)(二者質(zhì)量比為1：4)、引發(fā)劑2，2一偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽(為單體質(zhì)量的0.25％)，加入一定量蒸餾水溶解，使vp濃度為0.5g/ml。升溫至65℃，反應(yīng)5h，得到膠體，加適量水溶解，然后用丙酮沉淀。濾出沉淀并真空干燥即為目標(biāo)共聚物。2.cpvp的粘均測試先配置1m的氯化鈉溶液500ml以上，以后所有溶劑均以此為溶劑計算。具體：稱取58.5g氯化鈉，加入水約970ml，最后定容為1000ml；用鹽水溶液配置c1：0.01g/ml的聚合物溶液50ml(確定濃度)和c2：0.04g/ml。具體：稱取cpvp0.51215g，用1m氯化鈉溶解過夜，最后定容為50ml，得到濃度為c1＝0.01024g/ml；稱取cpvp2.01601g，用1m氯化鈉溶解過夜，最后定容為50ml，得到濃度為c2＝0.04032g/ml；在30℃恒溫浴槽內(nèi)測試，用烏式粘度計測量純氯化鈉溶液的流出時間記為t0：測量聚合物溶液c1的流出時間為t5。將c2溶液稀釋配制出0.002；0.004；0.006；0.008g/ml的溶液各50ml。清洗粘度管，最后用少量被測試溶液潤洗粘度管3次后再加入被測試液，測試溶液的流出時間，并對應(yīng)濃度與時間。具體：量取c1溶液10ml，用鹽水定容為50ml；量取c1溶液20ml，用鹽水定容為50ml；量取c2溶液7.5ml，用鹽水定容為50ml；量取c2溶液10ml，用鹽水定容為50ml；因此各樣品濃度分別為1號2.048mg/ml；2號為4.096mg/ml；3號為6.048mg/ml；4號為8.064mg/ml；cpvp的粘均分子量烏式粘度計測得不同樣品濃度的比粘度、相對對數(shù)粘度分別為：外推到0濃度時的比濃增比粘度為0.01592毫升/毫克＝0.01592升/克＝0.1592分升/克，根據(jù)mark—houwink公式[η]＝kmα，即得到粘均相對分子質(zhì)量。計算cpvp相對分子質(zhì)量時k＝1.4x10-4,α＝0.7來計算，可以得到其粘均分子量為：(0.1592/1.4x10-4)^(1/0.7)＝2.3x104，因此該聚合物的相對粘均分子量約為23000。3.cpvp的紫外光譜特性測定取質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為0.5％cpvp水溶液，利用紫外分光光度計測定其在200-300nm的光吸收，獲得該物質(zhì)的紫外吸收光譜。其紫外吸收光譜圖如圖1所示。從圖1可以看出，cpvp在紫外區(qū)有光吸收，最大吸收波長位于218nm，因此，在電泳過程中不宜將cpvp添加到運(yùn)行緩沖液中。實(shí)施例2、制備毛細(xì)管cpvp動態(tài)涂層系統(tǒng)1.1蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的制備牛胰凝乳蛋白酶原(pi9.3，分子量25000da)，核糖核酸酶a(pi7.8,分子量13700da),雞心細(xì)胞色素c(pi10.8，分子量12400da)，肌紅蛋白(pi7.3，分子量16700da)，伴清蛋白(pi6.8，分子量77770da)，均購自sigmachemicals。將5種蛋白標(biāo)準(zhǔn)品分別用去離子水配制成10mg/ml溶液，-80度長期保存，4度保存一周，用時等量混合終濃度為1mg/ml。1.2cpvp動態(tài)涂層系統(tǒng)分離蛋白標(biāo)準(zhǔn)品運(yùn)行方法河北永年石英毛細(xì)管(40.2cm，有效長度30cm，毛細(xì)管內(nèi)徑50μm)。新管活化：1mnaoh20psi沖洗20分鐘，超純水20psi沖洗10分鐘，運(yùn)行緩沖液20psi沖洗20分鐘備用。所述緩沖液為不同濃度(10-50mm)和ph值(ph＝3.0，ph＝6.5，ph＝7.0，ph＝7.5，ph＝8.0)的磷酸鹽緩沖液。動態(tài)涂層制備質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為0.5％的cpvp水溶液20psi沖洗10分鐘，靜置4分鐘，運(yùn)行緩沖液20psi沖洗10分鐘，高電壓12kv預(yù)分離2分鐘。所述緩沖液為不同濃度(10-50mm)和ph值(ph＝3.0，ph＝6.5，ph＝7.0，ph＝7.5，ph＝8.0)的磷酸鹽緩沖液。進(jìn)樣樣品濃度：1mg/ml，壓力進(jìn)樣0.5psi，3秒。毛細(xì)管電泳分離電壓反向12kv，檢測波長214nm，毛細(xì)管溫度25℃，樣品托盤溫度10℃，電泳時間45分鐘。1.3動態(tài)涂層檢測電滲流的運(yùn)行方法河北永年石英毛細(xì)管(40.2cm，有效長度30cm，毛細(xì)管內(nèi)徑50μm)。新管活化：1nnaoh20psi沖洗20分鐘，超純水20psi沖洗10分鐘，運(yùn)行緩沖液20psi沖洗20分鐘備用。所述緩沖液為不同濃度(10-50mm)和ph值(ph＝3.0，ph＝6.5，ph＝7.0，ph＝7.5，ph＝8.0)的磷酸鹽緩沖液。動態(tài)涂層制備不同濃度(0.001-0.25％)的cpvp水溶液20psi沖洗5分鐘，運(yùn)行緩沖液(ph＝6.5，20mm磷酸鹽緩沖液)20psi沖洗3分鐘。進(jìn)樣樣品濃度：0.1％(w/v)二甲基亞砜(dmso)，壓力進(jìn)樣0.5psi，5秒。毛細(xì)管電泳分離電壓反向20kv，檢測波長214nm，毛細(xì)管溫度25℃，樣品托盤溫度10℃，電泳時間10分鐘。1.4數(shù)據(jù)分析利用pa800plus自帶的32karat軟件計算理論塔板數(shù)。遷移時間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差計算，根據(jù)公式：相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(rsd)＝標(biāo)準(zhǔn)偏差(sd)/計算結(jié)果的算術(shù)平均值(x)*100％2結(jié)果與討論2.1cpvp濃度對電滲流的影響以ph＝6.5，20mm磷酸鹽緩沖液為運(yùn)行緩沖液，分別檢測了0.001-0.25％cpvp動態(tài)涂層濃度對電滲流的影響，結(jié)果如圖2所示，cpvp的濃度為0.001-0.1％時，電滲流逐漸增大，當(dāng)cpvp的濃度大于0.1％時，電滲流開始下降。2.2ph值對電滲流的影響由于磷酸鹽的緩沖范圍分別在ph(1.12-3.12)、(6.20-8.20)，故分別選取ph3.0、ph6.5、ph7.0、ph7.5、ph8.0時的50mm磷酸鹽緩沖液為運(yùn)行緩沖液，以0.1％dmso水溶液為中性標(biāo)記物，檢測了不同ph值磷酸鹽緩沖液為介質(zhì)，cpvp動態(tài)涂層的電滲流。結(jié)果如圖3所示，隨著ph值增加，電滲流逐漸減少。2.3運(yùn)行緩沖液濃度對cpvp動態(tài)涂層系統(tǒng)分離柱效的影響分別以不同濃度(10-50mm)ph6.5磷酸鹽緩沖液為運(yùn)行緩沖液，分離蛋白標(biāo)準(zhǔn)品混合物，結(jié)果見圖4-5，并用32karat軟件計算理論塔板數(shù)(n)定量各種蛋白的分離柱效。結(jié)果如表1所示，對于不同蛋白，其最適運(yùn)行緩沖液濃度略有所不同。如牛胰凝乳蛋白酶原和核糖核酸酶a在50mm的ph6.5磷酸鹽緩沖液分離柱效最高，分別可達(dá)2.9x105和1.7x105；而伴清蛋白、肌紅蛋白、雞心細(xì)胞色素c在各個濃度下分離柱效差別不大，基本維持在同樣數(shù)量級。表1：運(yùn)行緩沖液濃度對cpvp動態(tài)涂層系統(tǒng)分離柱效的影響n＝32.4ph值對cpvp動態(tài)涂層系統(tǒng)分離柱效的影響分別選取ph3.0、ph6.5、ph7.0、ph7.5、ph8.0時的50mm磷酸鹽緩沖液為運(yùn)行緩沖液，電泳分離蛋白標(biāo)準(zhǔn)品混合物，并用32karat軟件計算理論塔板數(shù)定量各種蛋白的分離柱效。結(jié)果如表2所示，在這些ph環(huán)境下，各種蛋白的分離柱效略有變化，其中牛胰凝乳蛋白酶原在ph8.0和ph6.5時，分離柱效可達(dá)105，而在其余ph環(huán)境中，分離柱效僅達(dá)104。表2：ph值對cpvp動態(tài)涂層系統(tǒng)分離柱效的影響n＝32.5cpvp動態(tài)涂層系統(tǒng)的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性為了評價cpvp動態(tài)涂層系統(tǒng)的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性，分別檢測重復(fù)進(jìn)樣時電滲流和蛋白遷移時間的變化。結(jié)果顯示在不同濃度、不同ph值情況下，重復(fù)進(jìn)樣6次電滲流中性標(biāo)記物dmso遷移時間的重現(xiàn)性rsd<3％(表3a)。對于蛋白標(biāo)準(zhǔn)品連續(xù)進(jìn)樣6次遷移時間的重現(xiàn)性rsd<3％，每日更換毛細(xì)管，連續(xù)進(jìn)樣4天，每天進(jìn)樣4-6次，蛋白標(biāo)準(zhǔn)品遷移時間的重現(xiàn)性rsd<6％(表3b)，說明該動態(tài)涂層系統(tǒng)具有很好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。表3a：電滲流中性標(biāo)記物遷移時間的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性cpvp濃度0.001％0.005％0.01％0.05％0.1％0.25％rsd(％)n＝60.080.090.050.060.080.09ph值3.06.57.07.58.0rsd(％)n＝61.050.110.480.202.67表3b：蛋白遷移時間的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性在本說明書的描述中，參考術(shù)語“一個實(shí)施例”、“一些實(shí)施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實(shí)施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)包含于本發(fā)明的至少一個實(shí)施例或示例中。在本說明書中，對上述術(shù)語的示意性表述不必須針對的是相同的實(shí)施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)可以在任一個或多個實(shí)施例或示例中以合適的方式結(jié)合。此外，在不相互矛盾的情況下，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以將本說明書中描述的不同實(shí)施例或示例以及不同實(shí)施例或示例的特征進(jìn)行結(jié)合和組合。盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，可以理解的是，上述實(shí)施例是示例性的，不能理解為對本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以對上述實(shí)施例進(jìn)行變化、修改、替換和變型。當(dāng)前第1頁12