本發(fā)明涉及一種芳香胺含量的檢測方法，尤其是一種偶氮染料中芳香胺含量的檢測方法，屬于有害物質(zhì)檢測領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
偶氮染料是指分子結(jié)構(gòu)中含有偶氮基(-n＝n-)且與其連接部分至少含有1個芳香族結(jié)構(gòu)的染料。研究認為，偶氮染料其結(jié)構(gòu)本身通常不會對人體產(chǎn)生有害影響，但有一些用“芳胺類中間體”合成的偶氮染料，因其與人體皮膚長期接觸之后，會因人表面皮膚的弱酸環(huán)境，極易發(fā)生還原反應(yīng)并使偶氮基斷裂，生成大量芳香胺類化合物。芳香胺類化合物可通過呼吸道、消化道或者皮膚吸收進入人體，具有致突變性和致癌性，極易引起人體細胞發(fā)生病變，對人體皮膚甚至膀胱、輸尿管等器官會產(chǎn)生極其嚴重的損害。這種違禁的偶氮染料，也被稱為“致癌芳香胺染料”。因此，自上世紀90年代以來，美國、歐盟、日本等發(fā)達國家紛紛制定了相應(yīng)的標準禁止在其市場銷售和使用與人體皮膚或口腔接觸時會產(chǎn)生致癌芳香胺的紡織品和皮革品。我國也制定了相應(yīng)的紡織品中禁用的偶氮染料測定的國家標準方法。
目前，禁用偶氮染料的檢測主要是基于檢測樣品經(jīng)還原分解后，是否存在有害的芳香胺，繼而反推樣品是否使用了禁用的偶氮染料。常見的芳香胺定量檢測方法有n-(1-萘基)-乙二胺偶氮分光光度法、流動注射光度法、電化學法、氣譜法、毛細管電泳等。其中，電化學法及分光光度法不太適合應(yīng)用于痕量分析與特異性分析，特別是不能滿足同時測定多組分的檢測要求；而目前報道的大部分色譜方法又因樣品前處理步驟復(fù)雜繁多、檢測耗時過長導(dǎo)致效率低下、靈敏度低、基質(zhì)效應(yīng)干擾大等不足而被詬病。因此，目前亟需開發(fā)一種操作簡單、檢測精準快速、檢測限低、分離時間短及靈敏度高的芳香胺檢測方法。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的旨在提供一種偶氮染料釋放出的芳香胺含量的檢測方法，即在弱酸性條件下，加入還原劑進行還原分解，然后進行固相萃取、濃縮后通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定樣品中芳香胺的檢測方法。該方法能在8min內(nèi)完成21種特定芳香胺的快速分離檢測，且測定結(jié)果準確，基質(zhì)干擾少，具有操作簡單，靈敏度及回收率高等優(yōu)點。
本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：
一種偶氮染料中芳香胺含量的檢測方法，包括以下步驟：
(1)樣品的提取：稱取樣品，加入檸檬酸緩沖溶液，水浴靜置，然后加入還原劑反應(yīng)，冷卻；
(2)樣品的萃?。簩溲趸c溶液和內(nèi)標工作溶液加入到步驟(1)得到的混合溶液中，混合均勻后倒入硅藻土固相萃取柱，靜置后，用叔丁基甲醚清洗樣品殘渣3～5次、并將叔丁基甲醚洗液倒入硅藻土固相萃取柱中，靜置10～20min后收集萃取液，然后向萃取液中加入無水硫酸鈉，混合均勻后靜置20～40min得到混合液。
(3)樣品的濃縮和測定：將步驟(2)得到混合液用30～40℃的氮氣吹氣濃縮，用甲醇的水溶液定容，振蕩后靜置1～5min，取上層清液經(jīng)有機濾膜過濾后，進行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定；
(4)標準工作溶液的測定：配制標準工作溶液，通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀對標準工作溶液進行測定；
(5)根據(jù)步驟(3)和步驟(4)的結(jié)果即可求得所述的偶氮染料中的芳香胺含量。
在優(yōu)選實施方案中，步驟(3)和(4)所述的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定條件為：
液相色譜條件為：色譜柱，規(guī)格100mm×2.1mm，1.7μm的fluoro-phenylc18柱；流動相：甲醇和0.05％甲酸水溶液，流速：300μl/min；梯度洗脫；柱溫：40℃；進樣量：2μl；
質(zhì)譜條件為：掃描方式：正離子掃描；電噴霧離子源(esi)；毛細管電壓為2.6kv,檢測方式：正離子多離子反應(yīng)監(jiān)測。
在優(yōu)選實施方案中，步驟(2)所述的內(nèi)標工作溶液為濃度為10μg/ml的4-氨基聯(lián)苯-d9的甲醇溶液，加入量為100μl；氫氧化鈉溶液加入量為0.5ml；無水硫酸鈉加入量為10g；叔丁基甲醚每次清洗用量為20ml。
在優(yōu)選實施方案中，步驟(4)所述的標準工作溶液為具有濃度梯度的不同芳香胺的甲醇溶液，濃度分別為：20ng/ml，50ng/ml，100ng/ml，200ng/ml，500ng/ml和1000ng/ml。
在優(yōu)選實施方案中，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀進行測定標準工作溶液時，用0.05％體積濃度的甲酸水溶液與甲醇進行梯度洗脫，0.05％體積濃度的甲酸水溶液與甲醇的體積比依次為：90:10、80:20、10:90、10:90和90:10。
在優(yōu)選實施方案中，所述不同芳香胺為2,6-二甲基苯胺、鄰氨基苯甲醚、2-萘胺、3,3-二氯聯(lián)苯胺、4-氨基聯(lián)苯、聯(lián)苯胺、鄰甲苯胺、2，4-二甲基苯胺、4-氯鄰甲苯胺、2,4-二氨基甲苯、3,3-二甲氧基聯(lián)苯胺、3,3-二甲基聯(lián)苯胺、4,4-亞甲基-二-(2-氯苯胺)、4,4-二氨基二苯甲烷、4,4-二氨基二苯醚、對氯苯胺、2-甲氧基-5-甲基苯胺、2,4,5-三甲基苯胺、4,4-二氨基二苯硫醚、2，4-二氨基苯甲醚和3，3’-二甲基-4，4’-二氨基二苯甲烷。
在優(yōu)選實施方案中，步驟(3)中，甲醇與水的體積比1:9。
在優(yōu)選實施方案中，步驟(1)中，樣品提取的工藝具體為：
將ph＝5.5～6.5、溫度為70±2℃的檸檬酸緩沖液加入到含有偶氮染料的0.2g樣品中，放置20～40min后，再加入連二亞硫酸鈉水溶液，反應(yīng)30min后冷卻至室溫，冷卻時間控制在5min之內(nèi)。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明方法具有如下優(yōu)良效果：
(1)本發(fā)明的方法針對現(xiàn)有技術(shù)樣品前處理方法步驟復(fù)雜繁多的不足，優(yōu)化了樣品前處理方法，簡化了操作步驟。
(2)本發(fā)明樣品混合溶液經(jīng)過固相萃取處理后，減少了基質(zhì)的干擾。
(3)本發(fā)明方法利用內(nèi)標法測定偶氮染料中芳香胺的含量，避免了基質(zhì)效應(yīng)，抵消了體積變化對定量分析的影響，在樣品濃縮步驟中只需取少量體積的萃取液進行氮吹濃縮，大幅縮短了濃縮時間，提高了檢測效率。并且可同步進行定性與定量分析，無需再使用其他儀器進行定性分析。
(4)本發(fā)明方法采用甲醇和水溶液對樣品進行復(fù)溶，進一步降低基質(zhì)效應(yīng)，而且樣品溶劑組成與流動相初始比例一致，有效避免了溶劑效應(yīng)，使得該方法具有檢測準確、回收率高、快速簡便、靈敏度高及重復(fù)性好等優(yōu)點。
(5)本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)檢測耗時過長導(dǎo)致效率低下的不足，優(yōu)化了儀器工作條件及梯度洗脫方案，能在8min內(nèi)完成21種特定芳香胺的快速分離檢測，且測定結(jié)果準確，大幅提高了檢測效率。
附圖說明
圖1為本發(fā)明的標準工作溶液的選擇離子色譜圖。
具體實施方式
下面將結(jié)合本發(fā)明實施例中的附圖，對本實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅是對本發(fā)明一部分實例，而不是全部的實例。基于本發(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有付出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。
實施例1
本實施例的偶氮染料中芳香胺含量的檢測方法，具體包括以下步驟：
(1)樣品的提?。簩⒑信嫉玖系氖称钒b紙張樣品剪成5mm×5mm左右的0.2g樣品，置于50ml具塞離心管中，加入15ml預(yù)熱至70±2℃的檸檬酸緩沖液(ph＝6)，猛烈搖動，使液體浸透樣品，于70±2℃水浴中放置30min；加入200mg/ml連二亞硫酸鈉水溶液3ml，在70±2℃水浴中反應(yīng)30min，然后將離心管置于冰水浴中于2min內(nèi)冷卻至室溫；
(2)配制內(nèi)標工作溶液：稱取0.01g的d9-4-氨基聯(lián)苯標準品到1000ml容量瓶中，用甲醇稀釋后得到濃度為10μg/ml的內(nèi)標工作溶液；
(3)樣品的萃?。涸诶鋮s后的離心管中分別加入0.5ml的氫氧化鈉溶液和100μl內(nèi)標工作溶液，將離心管中的液體全部倒入硅藻土固相萃取柱，靜置15min，分別用20ml叔丁基甲醚淋洗離心管中的樣品殘渣4次，每次均需混勻叔丁基甲醚和樣品殘渣，然后將叔丁基甲醚洗液倒入固相萃取柱中，收集萃取液于100ml三角瓶中，并往三角瓶中加入10g的無水硫酸鈉(使用前于馬弗爐中500℃烘干8h)，加塞振蕩后靜置0.5h。
(4)樣品的濃縮：取8ml萃取液倒入濃縮瓶中，于35℃氮吹濃縮至0.5ml左右，用甲醇水溶液(體積比1:9)定容至1ml，振蕩后靜置2min，取上層清液經(jīng)0.45μm有機濾膜過濾后，進行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析；
(5)配制系列標準工作溶液：稱取10.0mg各芳香胺標準品到10ml容量瓶中，精確至0.0001g，用甲醇定容，配制成濃度為1.0mg/ml的標準儲備液；移取標準儲備液100μl于100ml容量瓶中，用甲醇稀釋定容，得到濃度約為10.0μg/ml的工作溶液；分別移取一定體積的工作溶液于10ml容量瓶中，并加入100μl內(nèi)標工作溶液，用甲醇水溶液(體積比1:9)稀釋定容，即配制成不同濃度的標準工作溶液，其濃度分別為：20ng/ml，50ng/ml，100ng/ml，200ng/ml，500ng/ml和1000ng/ml。
(6)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定：取配制好的不同濃度的標準工作溶液，通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀進樣；
(7)根據(jù)步驟(4)和步驟(6)的結(jié)果對所述芳香胺含量進行計算。
通過內(nèi)標法對芳香胺的含量進行定量分析，即以各標準工作溶液中21種芳香胺定量離子的面積和內(nèi)標峰的定量離子面積比值為縱坐標，以各標準工作溶液中21種芳香胺的含量為橫坐標，繪制得到標準工作曲線，其相關(guān)系數(shù)r2>0.999。對提取后的樣品進行測定，測得檢出分析物和內(nèi)標的定量離子對峰面積比，代入標準曲線，求得樣品中對氯苯胺的含量為3.56mg/kg。
本實施例所用的儀器與試劑：
叔丁基甲醚、甲醇均為色譜級試劑，氫氧化鈉，硫酸鈉均為分析純試劑；蒸餾水，符合gb/t6682中一級水的要求。
waterstq四極桿液相串聯(lián)質(zhì)譜儀；恒溫水浴鍋；渦旋振蕩器；瑞士mettlerae200分析天平。
本實施例中，液相色譜條件為：
色譜柱：規(guī)格100mm×2.1mm，1.7μm的fluoro-phenylc18柱；
流動相：甲醇/0.05％甲酸水溶液；
流速：300μl/min；
流動相組成、流速及梯度變化，見表1；
表1液相色譜流動相組成、流速及梯度變化
質(zhì)譜條件為：
柱溫：40℃；
進樣量：2μl；
離子源：電噴霧離子源(esi)；
掃描方式：正離子掃描；
毛細管電壓：2.6kv；
檢測方式：多離子反應(yīng)監(jiān)測(mrm)；mrm參數(shù)見表2。
表2標準物及內(nèi)標物的監(jiān)測離子對、去簇電壓和碰撞電壓
*定量離子
①本發(fā)明方法的檢測限：
將不同濃度的標準工作溶液進樣液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(lc-ms/ms)，以3倍信噪比(s/n＝3)計算檢測限(lod)，見表3。
②本發(fā)明方法的精密度和加標回收率見表3：
在空白樣品中加入芳香胺的標準溶液，然后分別按本發(fā)明的方法進行前處理和lc-ms/ms分析，并按照加標量和測定值計算其回收率，結(jié)果見表3。由表3可以看出該方法回收率在70.3～104.8％之間，穩(wěn)定性良好，平均相對標準偏差(rsd)均小于6％，說明本發(fā)明精密度高。
表3各芳香胺的平均回收率和重復(fù)性(n＝6)
實施例2
本實施例是對煙用內(nèi)襯紙樣品的芳香胺含量進行檢測，具體步驟如下：
(1)樣品的提?。簩熡脙?nèi)襯紙樣品樣品剪成5mm×5mm左右的0.2g樣品，置于50ml具塞離心管中，加入15ml預(yù)熱至70±2℃的檸檬酸緩沖液(ph＝6.5)，猛烈搖動，使液體浸透樣品，于70±2℃水浴中放置40min；加入200mg/ml連二亞硫酸鈉水溶液3ml，在70±2℃水浴中反應(yīng)30min，然后將離心管置于冰水浴中于2min內(nèi)冷卻至室溫；
(2)配制內(nèi)標工作溶液：稱取0.01g的d9-4-氨基聯(lián)苯標準品到1000ml容量瓶中，用甲醇稀釋后得到濃度為10μg/ml的內(nèi)標工作溶液；
(3)樣品的萃?。涸诶鋮s后的離心管中分別加入0.5ml的氫氧化鈉溶液和100μl內(nèi)標工作溶液，將離心管中的液體全部倒入硅藻土固相萃取柱，靜置20min，分別用20ml叔丁基甲醚淋洗離心管中的樣品殘渣5次，每次均需混勻叔丁基甲醚和樣品殘渣，然后將叔丁基甲醚洗液倒入固相萃取柱中，收集萃取液于100ml三角瓶中，并往三角瓶中加入10g的無水硫酸鈉(使用前于馬弗爐中500℃烘干8h)，加塞振蕩后靜置40min。
(4)樣品的濃縮：取8ml萃取液倒入濃縮瓶中，于40℃氮吹濃縮至0.5ml左右，用甲醇水溶液(體積比1:9)定容至1ml，振蕩后靜置5min，取上層清液經(jīng)0.45μm有機濾膜過濾后，進行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析；
(5)其余步驟與實施例1相同。最終得到樣品中各芳香胺含量均為0mg/kg。
實施例3
本實施例是對煙用接裝紙樣品的芳香胺含量進行檢測，具體步驟如下：
(1)樣品的提取：將煙用內(nèi)襯紙樣品樣品剪成5mm×5mm左右的0.2g樣品，置于50ml具塞離心管中，加入15ml預(yù)熱至70±2℃的檸檬酸緩沖液(ph＝5.5)，猛烈搖動，使液體浸透樣品，于70±2℃水浴中放置20min；加入200mg/ml連二亞硫酸鈉水溶液3ml，在70±2℃水浴中反應(yīng)30min，然后將離心管置于冰水浴中于2min內(nèi)冷卻至室溫；
(2)配制內(nèi)標工作溶液：稱取0.01g的d9-4-氨基聯(lián)苯標準品到1000ml容量瓶中，用甲醇稀釋后得到濃度為10μg/ml的內(nèi)標工作溶液；
(3)樣品的萃?。涸诶鋮s后的離心管中分別加入0.5ml的氫氧化鈉溶液和100μl內(nèi)標工作溶液，將離心管中的液體全部倒入硅藻土固相萃取柱，靜置10min，分別用20ml叔丁基甲醚淋洗離心管中的樣品殘渣3次，每次均需混勻叔丁基甲醚和樣品殘渣，然后將叔丁基甲醚洗液倒入固相萃取柱中，收集萃取液于100ml三角瓶中，并往三角瓶中加入10g的無水硫酸鈉(使用前于馬弗爐中500℃烘干8h)，加塞振蕩后靜置20min。
(4)樣品的濃縮：取8ml萃取液倒入濃縮瓶中，于30℃氮吹濃縮至0.5ml左右，用甲醇水溶液(體積比1:9)定容至1ml，振蕩后靜置1min，取上層清液經(jīng)0.45μm有機濾膜過濾后，進行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析；
(5)其余步驟與實施例1相同。最終得到樣品中各芳香胺含量均為0mg/kg。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。