本申請(qǐng)涉及生物熒光檢測(cè)，更具體地，涉及一種堿性磷酸酶活性的熒光檢測(cè)方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、堿性磷酸酶（alp)是廣泛分布于人體肝臟、骨骼、腸、腎和胎盤等組織，經(jīng)肝臟向膽外排出的一種酶。參與生命活動(dòng)的多個(gè)方面，包括代謝、分子運(yùn)輸、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和遺傳信息的表達(dá)。alp的下調(diào)與許多疾病有關(guān)，alp主要用于骨骼、肝膽系統(tǒng)疾病的診斷和鑒別診斷。因此，發(fā)展一種靈敏的、選擇性高的方法定量檢測(cè)血清中alp?水平是極其重要的。

2、目前已有熒光法、電化學(xué)法、比色法、表面增強(qiáng)拉曼散射法、化學(xué)發(fā)光法等多種方法用于監(jiān)測(cè)alp活性，其中，電化學(xué)法和表面增強(qiáng)拉曼散射建立完好但步驟復(fù)雜，傳統(tǒng)的比色法抗干擾能力低，靈敏度較低。與其相比，熒光法通常具有背景干擾低、靈敏度高、抗干擾能力強(qiáng)的特點(diǎn)。因此，alp活性檢測(cè)的主要進(jìn)展集中在熒光策略的設(shè)計(jì)上。由于分析物通常不發(fā)熒光，因此必須將適當(dāng)?shù)臒晒馕镔|(zhì)引入分析系統(tǒng)。這些熒光物質(zhì)在熒光分析中起著核心作用，例如有機(jī)染料、納米材料等。

3、參與?alp熒光測(cè)定的有機(jī)染料通常是小分子且結(jié)構(gòu)多樣。檢測(cè)alp活性探針的設(shè)計(jì)方法一般是將一個(gè)小分子熒光團(tuán)的羥基進(jìn)行磷酸化，磷酸化后的熒光團(tuán)沒有熒光信號(hào)或具有弱熒光信號(hào)，當(dāng)alp存在時(shí)候，磷酸基團(tuán)被除去，熒光團(tuán)又恢復(fù)。但是現(xiàn)有的熒光底物受ph的影響較大，在腫瘤的軟酸環(huán)境中無法進(jìn)行靈敏的檢測(cè)；熒光物質(zhì)的斯托克斯位移較小，導(dǎo)致較高的背景干擾；熒光檢測(cè)時(shí)間較長，不利于提高檢測(cè)效率；熒光檢測(cè)得到的熒光強(qiáng)度較弱。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、提供了本申請(qǐng)以解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述缺陷。需要一種堿性磷酸酶活性的熒光檢測(cè)方法和應(yīng)用，能夠減小ph對(duì)熒光檢測(cè)的影響，能夠在腫瘤的軟酸環(huán)境下提高檢測(cè)的靈敏性，斯托克斯位移大，還能夠縮短檢測(cè)時(shí)間，提高熒光強(qiáng)度的穩(wěn)定性。

2、本申請(qǐng)的第一方面，提供了一種堿性磷酸酶活性的熒光檢測(cè)方法，所述熒光檢測(cè)方法包括：底物與待測(cè)液混合，所述底物中包括1-萘磷酸鈉，反應(yīng)生成萘酚，并得到混合溶液a；混合溶液a與乙二胺混合，反應(yīng)后得到混合溶液b；利用熒光光譜儀對(duì)混合溶液b在355nm光波長的激發(fā)下產(chǎn)生的熒光進(jìn)行熒光檢測(cè)，得到待測(cè)液中的堿性磷酸酶的濃度。

3、本申請(qǐng)的第二方面，提供了一種本申請(qǐng)任一實(shí)施例所述的熒光檢測(cè)方法在檢測(cè)細(xì)胞、血清和/或器官中的堿性磷酸酶活性中的應(yīng)用。

4、本申請(qǐng)各個(gè)實(shí)施例提供的堿性磷酸酶活性的熒光檢測(cè)方法和應(yīng)用，利用1-萘磷酸鈉作為底物，與待測(cè)液混合，待測(cè)液中的堿性磷酸酶與1-萘磷酸鈉反應(yīng)生成萘酚，萘酚與乙二胺反應(yīng)后在355nm光波長的激發(fā)下，能夠得到較高的熒光強(qiáng)度，堿性磷酸酶濃度和熒光強(qiáng)度符合線性規(guī)律，便于進(jìn)行熒光檢測(cè)；檢測(cè)過程中的反應(yīng)時(shí)間較短，能夠縮短檢測(cè)時(shí)間，更為重要的是以1-萘磷酸鈉作為底物，得到的熒光底物能夠適應(yīng)不同的ph條件，使其能夠用于檢測(cè)腫瘤細(xì)胞、血清和器官中的堿性磷酸酶活性，在腫瘤細(xì)胞等軟酸環(huán)境下，仍然能夠產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光強(qiáng)度；以1-萘磷酸鈉作為底物，檢測(cè)結(jié)果的斯托克斯位移大、背景干擾低、對(duì)生物樣品的光損傷小、樣品穿透性強(qiáng)、檢測(cè)靈敏度高。

技術(shù)特征：

1.一種堿性磷酸酶活性的熒光檢測(cè)方法，其特征在于，所述熒光檢測(cè)方法包括：底物與待測(cè)液混合，所述底物中包括1-萘磷酸鈉，反應(yīng)生成萘酚，并得到混合溶液a；混合溶液a與乙二胺混合，反應(yīng)后得到混合溶液b；利用熒光光譜儀對(duì)混合溶液b在355nm光波長的激發(fā)下產(chǎn)生的熒光進(jìn)行熒光檢測(cè)，得到待測(cè)液中的堿性磷酸酶的濃度。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光檢測(cè)方法，其特征在于，利用熒光光譜儀對(duì)混合溶液b在355nm光波長的激發(fā)下產(chǎn)生的熒光進(jìn)行熒光檢測(cè)，得到待測(cè)的堿性磷酸酶的活性，包括：利用熒光光譜儀對(duì)混合溶液b在355nm光波長的激發(fā)下產(chǎn)生的熒光進(jìn)行熒光檢測(cè)，得到熒光光譜；基于所述熒光光譜，得到479nm的熒光強(qiáng)度；基于所述479nm的熒光強(qiáng)度和堿性磷酸酶活性的線性關(guān)系，得到堿性磷酸酶的活性。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光檢測(cè)方法，其特征在于，所述底物包括1-萘磷酸鈉溶液，所述1-萘磷酸鈉溶液中1-萘磷酸鈉的濃度為200-600μmol/l；1-萘磷酸鈉溶液與待測(cè)液的體積比為1-4:1。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光檢測(cè)方法，其特征在于，混合溶液a與乙二胺溶液混合后反應(yīng)，混合溶液a與乙二胺溶液的體積比為5-40:1；乙二胺溶液的體積分?jǐn)?shù)為40-60%；混合溶液b中的乙二胺的體積分?jǐn)?shù)為1-15%。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光檢測(cè)方法，其特征在于，1-萘磷酸鈉與待測(cè)液混合的反應(yīng)時(shí)間為5-80min;混合溶液a與乙二胺混合反應(yīng)的時(shí)間為5-100min。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光檢測(cè)方法，其特征在于，待測(cè)液中堿性磷酸酶的濃度范圍為0-800mu/ml。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光檢測(cè)方法，其特征在于，所述底物中還包括混合溶液d，所述混合溶液d中包括mgcl2和tris-hcl緩沖液。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光檢測(cè)方法，其特征在于，底物與待測(cè)液混合反應(yīng)的溫度為30-40℃；混合溶液a與乙二胺混合反應(yīng)的溫度為30-40℃。

9.權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的熒光檢測(cè)方法在檢測(cè)細(xì)胞、血清和/或器官中的堿性磷酸酶活性中的應(yīng)用。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述細(xì)胞包括腫瘤細(xì)胞和/或正常細(xì)胞。

技術(shù)總結(jié)
本申請(qǐng)實(shí)施例涉及一種堿性磷酸酶活性的熒光檢測(cè)方法和應(yīng)用，所述熒光檢測(cè)方法包括：底物與待測(cè)液混合，所述底物中包括1?萘磷酸鈉，反應(yīng)生成萘酚，并得到混合溶液A；混合溶液A與乙二胺混合，反應(yīng)后得到混合溶液B；利用熒光光譜儀對(duì)混合溶液B在355nm光波長的激發(fā)下產(chǎn)生的熒光進(jìn)行熒光檢測(cè)，得到待測(cè)液中的堿性磷酸酶的濃度，因此本申請(qǐng)的熒光檢測(cè)方法能夠減小pH對(duì)熒光檢測(cè)的影響，能夠在腫瘤的軟酸環(huán)境下提高檢測(cè)的靈敏性，斯托克斯位移大，還能夠縮短檢測(cè)時(shí)間，提高熒光強(qiáng)度的穩(wěn)定性。

技術(shù)研發(fā)人員：孔維恒,馬一凡,趙巖,王凱
受保護(hù)的技術(shù)使用者：曲阜師范大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/5