專利名稱：細(xì)胞的制備和穩(wěn)定化的制作方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及細(xì)胞的制備和穩(wěn)定化，具體涉及一種新的多種細(xì)胞和單種細(xì)胞懸浮液尤其是全血及其成分的制備和穩(wěn)定化方法，同時涉及新的穩(wěn)定化的細(xì)胞制劑在UV顯微鏡檢術(shù)和流式細(xì)胞計量術(shù)的，白細(xì)胞免疫表型技術(shù)等分析技術(shù)的質(zhì)量控制中的應(yīng)用以及在固定化抗體/抗原檢測系統(tǒng)、血液學(xué)分析儀和含鋅原卟啉(ZPP)、紅細(xì)胞葉酸鹽和血糖測定等血液檢測技術(shù)中的應(yīng)用。
UV顯微鏡檢術(shù)和流式細(xì)胞計量術(shù)是用于診斷血液惡性腫瘤的技術(shù)。它們還被用于監(jiān)測感染了人類免疫缺陷病毒(HIV)的病人的病情發(fā)展，是無癥狀還是患有AIDS相關(guān)綜合癥(ARC)或成熟的AIDS。這兩項技術(shù)的質(zhì)量控制(QC)對正確診斷和監(jiān)測有效的治療方法是極端重要的?，F(xiàn)有的QC方法使用新鮮抽取的血液或包被有熒光染料的微球體。
每天使用新鮮血液不能提供技術(shù)或設(shè)備的日常變動信息。而且，包被有熒光染料的微球體雖然可提供對流式細(xì)胞儀操作的日常監(jiān)測，但不能用于UV顯微鏡檢術(shù)。另外，它們都不能用于為白細(xì)胞的標(biāo)記技術(shù)提供質(zhì)量控制。
利用諸如醛類化合物進行的正常白細(xì)胞的固定雖然可提供5—7天的穩(wěn)定性，但增加了細(xì)胞的自身熒光。這使得制劑不適合用于作為長期的質(zhì)量控制物質(zhì)。而且，利用全血裂解技術(shù)進行的紅細(xì)胞裂解需要一種可對該過程進行質(zhì)量控制的制劑?，F(xiàn)有的白細(xì)胞固定技術(shù)會抑制此裂解過程，導(dǎo)致干擾測試的細(xì)胞碎片的顯著增加。
在國際申請No.PCT/US91/03236(全文在此公開引用作為參考)中，描述了一種用于白細(xì)胞差異測定的血液稀釋液和裂解劑，其中以重氮烷基脲(diazolidinyl urea)為穩(wěn)定劑。這類白細(xì)胞制劑還不曾被提作質(zhì)量控制制劑，可能是因為對于需要評估來自大量實驗室結(jié)果的日常質(zhì)量控制方法而言，它們不夠穩(wěn)定而且缺乏特異性抗原活性。國際申請No.PCT/US92/03758。(全文在此公開引用作為參考)揭示了將不含醛的重氮烷基脲、咪唑烷基脲、二甲基醇-5，5-二甲基乙內(nèi)酰脲、二羥甲基脲、2-溴-2-硝基丙烷-1，3-二醇和季金剛烷(quaternary adamantane)用作組織穩(wěn)定劑。這些制劑中可含有媒染劑，諸如鋅、鍶、鈣、鋇和鉻鹽。但是，并未提及這些鹽都具有穩(wěn)定特性。
其他需要使用全血樣品或血制品來校準(zhǔn)的QC設(shè)備包括血液學(xué)分析儀，目前由于無法獲得合適的穩(wěn)定化的人血液源而在其中使用固定的牛血或驢血和火雞血。含鋅原卟啉(ZPP)和紅細(xì)胞葉酸鹽檢測技術(shù)也需要用新鮮的紅細(xì)胞懸浮液來校準(zhǔn)，仍然是因為沒有合適的穩(wěn)定化的血液源。最終，缺乏用于校準(zhǔn)的穩(wěn)定的人全血源限制了糖尿病患者在家進行血糖監(jiān)測的可能性。
由上可知，需要有一種可用于各種質(zhì)量控制、檢測和校準(zhǔn)的穩(wěn)定細(xì)胞尤其是全血和血制品的改進方法。發(fā)明目的本發(fā)明目的之一是提供改良的穩(wěn)定化的細(xì)胞制劑和一種穩(wěn)定細(xì)胞的改進方法。
本發(fā)明目的之二是提供一種穩(wěn)定化的全血制劑和一種該制劑的生成方法。
本發(fā)明目的之三是提供一種在全血中將白細(xì)胞與紅細(xì)胞分離的改良的裂解方法。
本發(fā)明的另一目的是提供可廣泛用于質(zhì)量控制、分析和檢測技術(shù)的穩(wěn)定的質(zhì)量控制材料。發(fā)明概述現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)，許多細(xì)胞可通過加入含有有效量重金屬的化合物來穩(wěn)定，而且這類穩(wěn)定化的細(xì)胞維持活性的時間比迄今為止所知的細(xì)胞要長得多。
所以，本發(fā)明的一方面內(nèi)容是提供一種穩(wěn)定化的細(xì)胞制劑，其中的穩(wěn)定劑含有有效量的重金屬化合物。
本發(fā)明的另一方面內(nèi)容提供了一種通過加入有效量的含有重金屬化合物的穩(wěn)定劑穩(wěn)定細(xì)胞的方法。
本發(fā)明對全血和血制品的穩(wěn)定化尤其具有實用性，所以將就此作更具體的描述。但是，必須理解，本發(fā)明并不限于這些物質(zhì)的穩(wěn)定化，而是可廣泛適用于各種細(xì)胞物質(zhì)，特別是細(xì)胞懸浮液。
所以，本發(fā)明還進一步提供了一種穩(wěn)定化的全血制劑，其中的穩(wěn)定劑含有有效量的重金屬化合物，同時提供了一種通過加入有效量的該化合物來穩(wěn)定全血制劑的方法。
以從裂解的全血制得的白細(xì)胞制劑為例，本發(fā)明還提供了通過加入有效量的重金屬化合物進行的全血的細(xì)胞組分的穩(wěn)定化方法。
所以，本發(fā)明還進一步提供了一種穩(wěn)定化的白細(xì)胞制劑，其中的穩(wěn)定劑含有有效量的重金屬化合物，同時提供了通過加入有效量的含有重金屬化合物的穩(wěn)定劑來穩(wěn)定白細(xì)胞制劑的方法。
本發(fā)明這一方面內(nèi)容中的穩(wěn)定化的白細(xì)胞制劑可被加入分去了白細(xì)胞的全血(紅細(xì)胞)以形成穩(wěn)定化的全血制劑，所以，本發(fā)明還進一步包括一種含有通過加入有效量穩(wěn)定劑而穩(wěn)定的白細(xì)胞的穩(wěn)定化的全血制劑和將穩(wěn)定化的白細(xì)胞制劑加入分去了白細(xì)胞的全血來產(chǎn)生穩(wěn)定化的全血制劑的方法。
本發(fā)明的另一方面內(nèi)容提供了一種含有穩(wěn)定化的白細(xì)胞和未處理過的紅細(xì)胞的穩(wěn)定化的全血制劑。
本發(fā)明還提供一種用于細(xì)胞物質(zhì)尤其是血液和血制品的新的穩(wěn)定劑，它含有重金屬化合物和甲醛的水溶液。
本發(fā)明還提供了一種白細(xì)胞差異化的裂解劑，它含有銨或季銨鹽和尿素的溶液，溶液中尿素的濃度和pH足以抑制單核細(xì)胞負(fù)調(diào)節(jié)(down-regulating)CD14抗原以使它們能被免疫方法檢測出來。本發(fā)明的詳細(xì)說明現(xiàn)在本發(fā)明將具體就用于實驗室質(zhì)量控制過程的穩(wěn)定化的全血制劑的產(chǎn)生進行描述，雖然必須理解，本發(fā)明并不僅限于此，例如，穩(wěn)定化的全血制劑可能還具有其他用途，穩(wěn)定化的白細(xì)胞制劑也可能具有作為質(zhì)量控制物質(zhì)的用途，所述的穩(wěn)定化過程可能被用于從血液以外的其他來源例如甲狀腺內(nèi)淋巴細(xì)胞中產(chǎn)生穩(wěn)定化的白細(xì)胞。此外，所述的穩(wěn)定化過程可以用于從血液以外的其他來源例如微生物細(xì)胞、植物細(xì)胞和來自活組織的類似物質(zhì)中產(chǎn)生穩(wěn)定化的細(xì)胞。
本說明中的全血制劑包括基本含有新鮮血液全部組分的制劑和基本含有除血漿以外的新鮮血液全部組分的制劑。
實現(xiàn)全血穩(wěn)定化的方法使用了一系列包含了加入有機和無機化合物的步驟。開始時抽取一定單位量血液的方法在文獻(xiàn)中有充分記載而且可以是任何一種用于靜脈切開放血術(shù)工藝的方法。最好使用抗凝血液，幾種合適的抗凝劑可以購得。但是，最好使用EDTA鉀鹽。
根據(jù)本發(fā)明的第一種過程，穩(wěn)定化的全血制劑的制備可先從紅細(xì)胞中分離白細(xì)胞，穩(wěn)定白細(xì)胞，然后將穩(wěn)定化的白細(xì)胞加入分去了白細(xì)胞的全血中。在第二種過程中，取消了白細(xì)胞分離步驟，而且將穩(wěn)定劑加入只去除了血漿的全血中。這兩種過程將被分別描述。
過程I穩(wěn)定白細(xì)胞的過程通常在靜脈切開放血術(shù)后24小時內(nèi)進行，但最好在2小時內(nèi)進行。為了從紅細(xì)胞中分離白細(xì)胞，使用了一種新的紅細(xì)胞裂解方法。
先將含有抗凝劑的新鮮血液離心，離心后在血沉棕黃層進行裂解。裂解劑含有一種銨鹽例如氯化銨或季銨鹽和尿素或合適的取代尿素或尿素衍生物的溶液，最好是水溶液。季銨鹽的濃度范圍最好為0.05—0.5M，尿素的濃度低于1.0M，而且最好在0.05—0.5M范圍內(nèi)。溶液的pH以6.8—7.8為宜。裂解時間以5—20分鐘為宜，在此之后用等滲鹽水溶液洗滌所得的白細(xì)胞以去除裂解的細(xì)胞碎片。
用一種含有重金屬化合物、具體說是重金屬鹽的第一穩(wěn)定劑處理白細(xì)胞。合適的重金屬是那些具有絡(luò)合特性且原子量大于20的重金屬，例如過渡金屬，尤其是周期表中IVa至VIIa族的過渡金屬，例如錳、鉻、鉬、釩和鈦；Ib族，例如銅；Ib族，例如錫。尤其優(yōu)選VIa族和VIIa族的過渡金屬，特別是鉻和錳。合適的化合物包括這些金屬的水溶性鹽，特別是無機酸鹽，例如硫酸鹽，特別是氯化物。使用鉻化合物，例如氯化鉻(CrCl3)已獲得特別好的結(jié)果，這些是用于本發(fā)明的優(yōu)選的第一穩(wěn)定劑。
重金屬化合物最好以合適溶劑的溶液形式使用。這種溶劑通常為水，或一種水性介質(zhì)，但并不特別排除加入少于10％的少量合適的有機溶劑，這些溶劑基本不會抑制白細(xì)胞的抗原活性或影響它們的完整性。
但大量有機溶劑的存在通常是有害的。
溶劑最好是緩沖至pH6.5—7.0的等滲水溶液。合適的緩沖水溶液包括，例如磷酸鹽緩沖液。
重金屬化合物最好溶于溶劑并在使用前靜置，例如至少6小時，以12小時為宜，24小時更好，最好48小時，例如1周。靜置改善溶液性能的原因尚不明了，但可能是因為在溶液中形成了水合的金屬羥基離子物質(zhì)。在某些鉻化合物的緩沖溶液中已經(jīng)觀察到，例如，在24小時后新鮮制備的溶液在形成可能是鉻羥化物聚合體的沉淀同時由綠色變?yōu)樽仙?，這表明絡(luò)合離子發(fā)生了變化。使用前最好將該沉淀從溶液中濾處。沉淀的形成當(dāng)然會降低溶液中重金屬離子的濃度，如果這種現(xiàn)象發(fā)生，當(dāng)然就必須對溶液進行分析決定第一穩(wěn)定劑的濃度是否還在優(yōu)選范圍內(nèi)。
重金屬化合物的溶液最好以濃縮液形式貯存，例如以1％w/v濃度，在使用前用合適的緩沖液稀釋。稀釋時會因為pH的升高而產(chǎn)生沉淀，必須在使用該溶液前靜置足夠的時間以產(chǎn)生這一沉淀。
雖然重金屬化合物的陳溶液可在相當(dāng)長的時間后仍保持其作用，但仍以在12個月后丟棄為宜，最好是在6個月后。
第一穩(wěn)定劑的存在可防止白細(xì)胞表現(xiàn)出過度的自身熒光，同時可在長于25天的時間內(nèi)保持白細(xì)胞穩(wěn)定。第一穩(wěn)定劑最好以等滲溶液的形式加入白細(xì)胞制劑中，其中第一穩(wěn)定劑的最適終濃度以低于1％w/v為宜，以0.005％—0.75％w/v更好，以0.01％—0.5％w/v還要好，以0.05％—0.25％w/v最好，例如0.1％w/v。該溶液最好是0.85％的磷酸鹽緩沖液。PH以調(diào)節(jié)至6.5—7.0為宜。白細(xì)胞與第一穩(wěn)定劑接觸的培育時間以5分鐘至18小時為宜，但最好是60分鐘。培育溫度以0℃—8℃為宜，例如約4℃。
在初培育之后，最好以第二穩(wěn)定劑處理白細(xì)胞，它可以是例如醛類，以甲醛為宜，最好是聚甲醛，它可以，例如，以0.1％—0.5％w/v的終濃度例如0.35％w/v溶于某溶液中。
當(dāng)細(xì)胞的自身熒光不成為問題時，例如在某些組織學(xué)技術(shù)中，任何合適的醛均可使用，但是通常地，特別是在制備用于流式細(xì)胞計量術(shù)的樣品時，需要將自身熒光減至最小。在這種情況下中優(yōu)選聚甲醛，因為一般地它產(chǎn)生的自身熒光最小。在制備聚甲醛溶液時最好將溫度保持在60℃以下，以免聚甲醛向甲醛逆轉(zhuǎn)。
已發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用生金屬化合物和醛作為第二穩(wěn)定劑時，獲得了非常好的結(jié)果。這種組合的第二穩(wěn)定劑單獨地用于細(xì)胞物質(zhì)的穩(wěn)定，因此是本發(fā)明的一個方面。
重金屬化合物可以是前述的任何一種，在溶液中的含量可以是0.01％—0.5％w/v。醛的含量可以是0.1％—0.5％w/v，而且溶液中重金屬化合物與醛的比值以在5∶1—1∶50范圍內(nèi)為宜。最好溶液的pH為6.5—7.0，并且含有某種合適的等滲緩沖液。優(yōu)選溶液可以是例如0.85％的磷酸鹽緩沖液。溶液中最好還含有一種抗凝劑，而優(yōu)選的抗凝劑是EDTA和肝素。與第二穩(wěn)定劑的接觸最好在前述溫度下進行6至24小時。
雖然在單獨使用時，重金屬化合物被發(fā)現(xiàn)在某些情況下可在20多天中提供顯著的穩(wěn)定效應(yīng)，但一般未發(fā)現(xiàn)它們可提供60天的穩(wěn)定性，而這正是所需的商品化保存時間。
進一步的改進是通過使用某種重金屬化合物和某種醛的組合溶液(實際上，是單獨使用的前述第二穩(wěn)定劑)來達(dá)到的，但該處理仍被發(fā)現(xiàn)無論如何無法提供所需的60天的穩(wěn)定性。
另一方面，如在此之前所描述的，先后使用第一和第二穩(wěn)定劑可提供白細(xì)胞超過220天的穩(wěn)定性。第一和第二穩(wěn)定劑處理的間隔以至少30分鐘為宜，更好的至少1小時，最好至少12小時，例如24小時。
在用等滲磷酸鹽緩沖液洗滌后，穩(wěn)定化的白細(xì)胞被重新加入分去了白細(xì)胞的全血中。該分去了白細(xì)胞的全血可以但不必需通過將原血液濾過可購得的白細(xì)胞過濾器而制得。最好再向最終制劑中加入細(xì)菌生長抑制劑。使用前將該溶液在0℃—8℃保存1—5天。
所有上述步驟都宜在無菌條件下進行。
出于本發(fā)明的目的，主要含有紅細(xì)胞的分去了白細(xì)胞的血液可以被認(rèn)為是“未處理過的”，即，發(fā)現(xiàn)無需向分去了白細(xì)胞的血液加入穩(wěn)定劑以獲得穩(wěn)定化的全血制劑。特別令人驚奇的是，可以僅對其中的白細(xì)胞組分進行穩(wěn)定來制得穩(wěn)定化的全血制劑。
在根據(jù)過程I進行的穩(wěn)定化的全血制劑的工業(yè)生產(chǎn)中，可混合若干單位的不同血源的血液并分離和穩(wěn)定白細(xì)胞。然后可混合其他單位的不同血源的血液并分去白細(xì)胞。最后，混合的穩(wěn)定化的白細(xì)胞被加入分去了白細(xì)胞的血液中以形成穩(wěn)定化的全血制劑。過程II本過程與所述的過程I相似，除了如前所述外，省略了白細(xì)胞分離步驟。為此，穩(wěn)定化的全血制劑的大規(guī)模生產(chǎn)常優(yōu)選過程II。
全血樣品的穩(wěn)定化的過程通常在靜脈切開放血術(shù)后24小時內(nèi)進行，但最好在2小時內(nèi)。
含有例如EDTA抗凝劑的新鮮全血先被離心，分離并保留血漿。
洗滌留下的細(xì)胞，然后用含有某種重金屬化合物的第一穩(wěn)定劑處理，該過程可與過程I中所述的相同。
第一穩(wěn)定劑最好以溶液形式加入全血制劑中，溶液中第一穩(wěn)定劑的最適終濃度以0.01％—0.5％w/v為宜。該溶液最好處于0.85％的磷酸鹽緩沖液中。最好將pH調(diào)節(jié)至6.5—7.0。全血與第一穩(wěn)定劑的接觸時間與5分鐘以18小時為宜，最好是60分鐘。培育溫度以0℃—8℃為宜，例如約4℃。
在初培養(yǎng)之后，最好以第二穩(wěn)定劑處理全血，它可以是例如某種醛，最好是聚甲醛，使用過程I中所述的相同條件。第二穩(wěn)定劑溶液的加入可將全血的穩(wěn)定性延長至130天。與第二穩(wěn)定劑的接觸時間以6—24小時為宜，例如18小時，溫度范圍與過程I中所述的相同。
等滲磷酸鹽緩沖液洗滌后，將血漿重新加入到穩(wěn)定化的全血中。該血漿可以但并不必需由原血液制得。最好再在最終的制劑中加入細(xì)菌生長抑制劑和抗生素，例如慶大霉素。制劑在使用前在0℃—8℃保存1—5天。
所有上述步驟最好在無菌條件下進行，而且全過程最好在采集所供血液的靜脈切開放血包中進行。
在根據(jù)過程II進行的穩(wěn)定化的全血制劑的工業(yè)生產(chǎn)中，可以而且可能地最好混合不同血源的供者血液并穩(wěn)定所得的混合血液。
在此所述的穩(wěn)定化方法既可用于正常細(xì)胞也可用于白血病細(xì)胞，以提供一種已知的正常對照和異常(白血病的)對照。
本發(fā)明的穩(wěn)定化的全血制劑可提供一種極穩(wěn)定的質(zhì)量控制和參比物質(zhì)，可用于通過UV顯微鏡檢術(shù)和流式血細(xì)胞計量術(shù)進行的白細(xì)胞免疫表型(分析)。該制劑在沒有碎片的過度污染的全血裂解過程的質(zhì)量控制方面很有價值。穩(wěn)定化的樣品中可含有全部正常的外周血白細(xì)胞(粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞)或它們的子集合。在最適條件下，該過程可以保留白細(xì)胞的抗原分布格局以確保過程的表型(分析)和質(zhì)量控制?？蓪ΤＳ每乖瓫Q定簇進行測定，這些值可在130多天內(nèi)保持穩(wěn)定。研究者還可以成功地得出可能具有特殊意義的其他抗原數(shù)據(jù)。而且，該制劑還可用于由流式細(xì)胞儀獲得的差異的質(zhì)量控制。這是一個檢測HIV感染個體的抗病毒治療的參數(shù)。
正在開發(fā)對血液樣品進行表型(分析)的新方法，該方法在染色后無需用裂解劑處理樣品。這些技術(shù)被稱為非洗、非裂解技術(shù)。本發(fā)明的全血制劑可用于為這些技術(shù)提供質(zhì)量控制，也可用在分析非洗、非裂解過程的流式細(xì)胞儀方面。
通常地，本發(fā)明的穩(wěn)定化的全血制劑可用于UV顯微鏡檢術(shù)和流式細(xì)胞計量術(shù)的免疫表型技術(shù)的質(zhì)量控制中，可采用全血裂解和全血非裂解技術(shù)。
對本發(fā)明的穩(wěn)定化的全血制劑的研究表明它們還適合用于諸如堿性磷酸酶抗堿性磷酸酶(APAAP)的免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)分析中，并可用于例如測定外周血涂片上的白細(xì)胞的抗原分布格局。它可被用作日常參比物質(zhì)或外部的(實驗室內(nèi))質(zhì)量控制。可預(yù)先制備多個涂片，然后保存于-20℃直至使用。這些涂片可進行日常染色或在染色其他涂片時用作參比。
本發(fā)明的穩(wěn)定化的全血制劑還可用作酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)和免疫放射測定技術(shù)中的標(biāo)準(zhǔn)參比物。
本發(fā)明的穩(wěn)定化的全血制劑在實驗室中的其他應(yīng)用還包括作為血液分析儀的質(zhì)量控制和校準(zhǔn)物，作為利用含鋅原卟啉(ZPP)進行的缺鐵性檢測的質(zhì)量控制物質(zhì)和作為紅細(xì)胞葉酸鹽技術(shù)中的質(zhì)量控制物質(zhì)。最后，更廣泛地說，本發(fā)明的穩(wěn)定化的全血制劑可用于血糖水平測定的質(zhì)量控制，由此可使糖尿病人可在自己的家中進行該項測定。
以下實施例說明本發(fā)明。
實施例1如下配制一種穩(wěn)定化的全血制劑并與一種與之相似的未處理過的全血樣品比較其衰老特性。
制備1.利用靜脈切開術(shù)將500ml血液采入含有溶于50ml磷酸鹽緩沖液(PBS)的600mg乙二胺四乙酸(二鈉鹽或三鉀鹽)的無菌靜脈切開放血包中。
2.將抗凝血液分成兩分(每分250ml)。
3.取一分(250ml)通過白細(xì)胞過濾器分去白細(xì)胞。然后保存于4℃。
4.將留下的一分(250ml)在800g離心1小時。
5.移去血沉棕黃層(白細(xì)胞層)。
6.用裂解液將血沉棕黃層定容至250ml。
裂解溶液10×貯存液pH7.489.9g氯化銨10.0g碳酸氫鈉370mgEDTA二鈉將上述物質(zhì)溶于1000ml的蒸餾水(1.68M NH4Cl)中，并用蒸餾水稀釋至2×濃度，然后加入等體積的0.2M尿素(溶于蒸餾水中)，形成的pH7.5的1×裂解終溶液。
7.在室溫下避光裂解5分鐘。
8.在800g離心3分鐘并傾析上清液。
9.用磷酸鹽緩沖液(PBS)離心洗滌3次。傾析最后的上清液。
10.將細(xì)胞重懸于20ml的PBS中。
11.加入60ml已過濾的、儲存期超過1個月的0.1％六水合氯化鉻(pH6.7)的PBS溶液，并在4℃避光培育1小時，間斷地加以攪拌。
12.在800g離心3分鐘并傾析上清液。
13.將沉淀重懸于20mlPBS，并加入60ml已過濾的、儲存期超過1個月的0.1％六水合氯化鉻pH6.7且同時含有0.35％聚甲醛的PBS溶液。在4℃避光培育16—22小時。
14.在800g離心3分鐘并傾析上清液。
15.如步驟9所述洗滌3次。
16.將白細(xì)胞重懸于步驟3所述的無白細(xì)胞全血中。加入慶大霉素、環(huán)丙氟哌酸之類的廣譜抗生素。
17.使用前在4℃放置2—3天。
磷酸鹽緩沖液pH7.27.83g/l 氯化鈉
0.36g/lEDTA二鈉0.28g/l氯化鉀0.26g/l磷酸二氫鉀(單堿)2.35g/l磷酸氫二鈉(二堿)比較結(jié)果由


，其中圖1所示為“新鮮”血液染色后對抗原CD3、CD4、CD8、CD20的流式細(xì)胞計量術(shù)特性。使用全血裂解技術(shù)進行染色，陽性水平與陰性對照的關(guān)系(a)前向和側(cè)向散射(FSC和SSC)特性，(b)CD3磷脂酰乙醇胺(PE)和CD20異硫氰酸熒光素(FITC)，(c)CD3異硫氰酸熒光素(FITC)和CD4磷脂酰乙醇胺(PE)，(d)CD3異硫氰酸熒光素(FITC)和CD8磷脂酰乙醇胺(PE)。
圖2所示為8天內(nèi)“新鮮”未穩(wěn)定化血液的流式細(xì)胞計量術(shù)FSC和SSC的衰老效應(yīng)。(a)第一天，(b)第二天，(c)第三天，(d)第八天。
圖3a和圖3b所示為10天內(nèi)圖1b、c和d中描述的抗原表達(dá)的衰老效應(yīng)。3a(i)(ii)(iii)第一天，3b(i)(ii)(iii)第十天。
圖4a和圖4b所示為由流式細(xì)胞計量術(shù)測定的穩(wěn)定化的全血制劑57天內(nèi)的FSC、SSC和陰性對照特性的穩(wěn)定性。4a第二天，4b第57天。
圖5a和圖5b所示為由流式細(xì)胞計量術(shù)測定的57天內(nèi)的圖1b、c和d中描述的抗原的穩(wěn)定性。5a第二天，5b第57天。
圖6所示為8天中“新鮮”血液流式細(xì)胞計量術(shù)白細(xì)胞差異的貯存效應(yīng)。由于樣品嚴(yán)重變質(zhì)，無法進行8天后的進一步分析。使用FACScan流式細(xì)胞儀進行分析。
圖7所示為穩(wěn)定化的血液制劑22天流式細(xì)胞計量術(shù)的(白細(xì)胞)差異的穩(wěn)定性。使用FACScan流式細(xì)胞儀進行分析。
圖1中的流式細(xì)胞計量術(shù)圖顯示了在紅細(xì)胞裂解后淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和粒細(xì)胞的正常位置。圖1b、c、d和e還顯示了抗原染色特性。流式細(xì)胞計量術(shù)和抗原表達(dá)特性隨樣品貯存時間增加而改變。8天時的碎片量令人無法進行滿意的分析。如圖3所示，熒光標(biāo)記特性也變差。
圖4顯示了穩(wěn)定化的樣品在第2天和第57天的前向和側(cè)向散射特性及其陰性對照。一經(jīng)穩(wěn)定化后，各(細(xì)胞)群體保持它們各自的位置。第57天后制劑的流式細(xì)胞計量術(shù)的前向和側(cè)向散射特性維持原樣(圖4b)。另外，這段時間后的抗原表達(dá)特性仍保持不變(圖5)。
穩(wěn)定化的血液制劑可用于檢測白細(xì)胞差異。使用直接抗CD14和CD45抗原的特異性組合抗體可形成三組群體差異。圖7顯示了這一參數(shù)的穩(wěn)定性，而圖6則顯示了8天中“新鮮”全血的不穩(wěn)定性。這段時間后的分析由于過量碎片的污染而被放棄。實施例2如下配制一種穩(wěn)定化的全血制劑并與一種與之相似的未處理過的全血樣品比較其衰老特性。制備1.利用靜脈切開術(shù)將500ml血液采入含有溶于50ml磷酸鹽緩沖液(PBS)pH7.2的600mg乙二胺四乙酸(二鈉鹽或三鉀鹽)的無菌靜脈切開放血包中，如前述實施例1。
2.在800g離心1小時。移去并保留血漿。
3.以無菌磷酸鹽緩沖液將留下的細(xì)胞洗滌2次。
4.除去上清液PBS。
5.加入300ml已過濾的、儲存斯超過1個月的0.1％六水合氯化鉻(pH6.7)的PBS溶液，并在4℃避光培育1小時，間斷地加以攪拌。
6.在800g離心45分鐘并傾析上清液。
7.將沉淀重懸于300ml已過濾的、儲存期超過1個月的0.1％六水合氯化鉻pH6.7且同時含有0.35％聚甲醛的PBS溶液。在4℃避光培育16—22小時。
8.在800g離心45分鐘并傾析上清液。
9.用磷酸鹽緩沖液(PBS)離心洗滌2次。傾析最后的上清液。
10.將穩(wěn)定化的全血重懸于步驟2所述的血漿中。加入慶大霉素、環(huán)丙氟哌酸之類的廣譜抗生素。
11.使用前在4℃放置2—3天。
比較結(jié)果由

，其中圖8a和8b顯示了由流式細(xì)胞計量術(shù)測定的有關(guān)穩(wěn)定化的全血制劑60天的FSC、SSC和陰性對照特征的穩(wěn)定性。4a第三天，4b第60天。
圖9a和9b顯示了由流式細(xì)胞計量術(shù)測定的抗原CD3、CD4、CD8、CD19和CD16＋CD5657天的穩(wěn)定性。5a第三天，5b第57天。
圖10所示為穩(wěn)定化的血液制劑25天流式細(xì)胞計量術(shù)的差異(細(xì)胞)的穩(wěn)定性。使用FACScan流式細(xì)胞儀進行分析。
圖11所示為某穩(wěn)定化的全血制劑樣品中含鋅的原卟啉(ZPP)含量36天的穩(wěn)定性，單位為μmolZPP/mol血紅蛋白。
圖12所示為用Toa(Sysmex)NE8000血液學(xué)分析儀測定的某穩(wěn)定化的全血制劑樣品中的全部白細(xì)胞量和全部淋巴細(xì)胞量117天的穩(wěn)定性。
最后，圖13所示為50天內(nèi)穩(wěn)定化的全血制劑樣品和新鮮貯存的全血樣品中紅細(xì)胞葉酸鹽的測定值。
圖1中的流式細(xì)胞計量術(shù)圖顯示了在紅細(xì)胞裂解后淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和粒細(xì)胞的正常位置。圖1b、c、d和e還顯示了抗原染色特性。流式細(xì)胞計量術(shù)和抗原表達(dá)特性隨樣品貯存時間增加而改變。8天時的碎片量令人無法進行滿意的分析。如圖3所示，熒光標(biāo)記特性也變差。
圖8a和8b顯示了第3天和第60天穩(wěn)定化的樣品的前向和側(cè)向散射特征及其陰性對照。一經(jīng)穩(wěn)定化后，各(細(xì)胞)群體保持它們各自的位置。保存了60天后，制劑的流式細(xì)胞計量術(shù)的前向和側(cè)向散射特征維持原樣(圖4b)。另外，這段時間后的抗原表達(dá)特征仍保持不變(圖9a和9b)。全過程中儀器的設(shè)定保持不變。這些結(jié)果顯示了本發(fā)明的穩(wěn)定化的血液制劑比圖1—3所示的非穩(wěn)定化“對照”血液制劑具有顯著的優(yōu)越性。
穩(wěn)定化的全血制劑可用于檢測白細(xì)胞差異。使用直接抗CD14和CD45抗原的特異性組合抗體可形成三組群體差異。圖10顯示了這一參數(shù)25天的穩(wěn)定性，而圖6則顯示了8天中“新鮮”全血的不穩(wěn)定性。這段時間后的分析由于過量碎片的污染而被放棄。
如圖11所示，穩(wěn)定化的全血制劑中ZPP含量基本恒定，只在36天后略有升高。同樣，如圖12所示，在117內(nèi)，全部白細(xì)胞量和全部淋巴細(xì)胞量基本不受時間的影響。
圖13顯示了根據(jù)本發(fā)明使用穩(wěn)定化的全血制劑后，紅細(xì)胞葉酸鹽值穩(wěn)定性的顯著改進。
實施例3重復(fù)實施例2的過程，但在第5步中使用在0.85％w/v的磷酸鹽緩沖液中含有各種金屬鹽形成的0.1％w/v溶液。使用流式細(xì)胞儀測定由FSC、SSC和陰性對照特征決定的所得血液制劑8天和12天后的穩(wěn)定性。通過對形成的斑點的目測和使用Becton-DickinsonSimulset軟件3.2版以好、合格或不合格估計結(jié)果?；衔? 不合格 合格 好CrCl3(＞1天) XCrCl3(存儲了16個月) XCr2(SO4)3XCrF3XCr(NO3)3XCr(乙酸)3XMnCl2XPtCl2XScCl2XVCl3XWCl4XSnCl2XZnCl2XCeCl3XMgCl2XAlCl3XCuCl2XCuSO4XMoCl3XPb(NO3)2XFeCl3XTiCl3XK2Cr2O7X
12天后的結(jié)果CrCl3(＞1天) XCrCl3(存儲了16個月)XCr2(SO4)3XCrF3XCr(NO3)3XCr(乙酸)3XMnCl2XPtCl2XScCl3XVCl3XWCl4XSnCl2XZnCl2XCeCl3XMgCl2XAlCl3XCuCl2XCuSO4XMoCl3XPb(NO3)2XFeCl3XTiCl3XK2Cr2O3X
這些結(jié)果表明了VIa族和VIIa族金屬化合物比其他重金屬化合物具有顯著的優(yōu)越性，雖然后者中的有些被認(rèn)為是可用的。從這些比較中獲得比未穩(wěn)定化的、4天后基本變質(zhì)的對照更高的穩(wěn)定性。
儲存了16個月的氯化鉻溶液的效果被發(fā)現(xiàn)比新配(＞1天)溶液差，估計是因為溶液中水合鉻離子絡(luò)合物的形成或不溶性鉻羥化物聚合體沉淀的形成導(dǎo)致了溶液中鉻離子的減少。
讀者的注意力被引向了與本說明書一同遞交及與本說明書一同公開以接受公眾審議的所有文獻(xiàn)，所有這些文獻(xiàn)的內(nèi)容都在此參考引用。
在本說明中揭示的所有特征(包括所附的權(quán)利要求、摘要和附圖)和/或任一方法中的所有步驟可以任何方式組合，除了那些至少有部分這樣的特征和/或步驟是互不相容的組合。
在本說明中的每一特征(包括所附的權(quán)利要求、摘要和附圖)，除非有明確的聲明，都可以被可達(dá)到相同、相當(dāng)或相似目的的不同特征所取代。所以，除非有明確的聲明，所揭示的每一特征只是普通的一系列相當(dāng)或相似特征中的一個舉例。
權(quán)利要求
1.一種穩(wěn)定化的細(xì)胞制劑，其特征在于，其中的穩(wěn)定劑含有有效量的某種重金屬化合物。
2.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的穩(wěn)定的化細(xì)胞制劑，其特征還在于，其中的細(xì)胞制劑是一種細(xì)胞懸浮液。
3.一種根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的穩(wěn)定的化細(xì)胞制劑，其特征還在于，其中的細(xì)胞制劑是一種全血制劑。
4.一種根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的穩(wěn)定的化細(xì)胞制劑，其特征還在于，其中的細(xì)胞制劑是一種白細(xì)胞制劑。
5.一種根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一權(quán)利要求所述的穩(wěn)定的化細(xì)胞制劑，其特征還在于，其中的重金屬是一種過渡金屬。
6.一種根據(jù)權(quán)利要求5所述的穩(wěn)定的化細(xì)胞制劑，其特征還在于，其中的過渡金屬是一種VIa族或VIIa族金屬。
7.一種根據(jù)權(quán)利要求6所述的穩(wěn)定的化細(xì)胞制劑，其特征還在于，其中的過渡金屬是鉻。
8.一種根據(jù)前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的穩(wěn)定的化細(xì)胞制劑，其特征還在于，其中的化合物是一種鹽。
9.一種根據(jù)權(quán)利要求8所述的穩(wěn)定的化細(xì)胞制劑，其特征還在于，其中的鹽是一種無機鹽，特別地是一種氯化物。
10.一種根據(jù)前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的穩(wěn)定的化細(xì)胞制劑，其特征還在于，其中的穩(wěn)定的劑是氯化鉻。
11.一種根據(jù)前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的穩(wěn)定的化細(xì)胞制劑，其特征還在于，其中的穩(wěn)定的劑還含有有效量的醛。
12.一種根據(jù)權(quán)利要求11所述的穩(wěn)定的化細(xì)胞制劑，其特征還在于，其中的醛是聚甲醛。
13.一種根據(jù)前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的穩(wěn)定的化細(xì)胞制劑，其特征還在于，基本如實施例中所示。
14.一種基本如前所述的穩(wěn)定的化細(xì)胞制劑。
15.一種穩(wěn)定化細(xì)胞制劑的方法，其特征在于，它包括加入有效穩(wěn)定量的含有某種重金屬化合物的第一穩(wěn)定劑。
16.一種根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其特征還在于，其中的細(xì)胞制劑是一種細(xì)胞懸浮液。
17.一種根據(jù)權(quán)利要求15或16所述的方法，其特征還在于，其中的細(xì)胞制劑是一種全血制劑。
18.一種根據(jù)權(quán)利要求15或16所述的方法，其特征還在于，其中的細(xì)胞制劑是一種白細(xì)胞制劑。
19.一種根據(jù)權(quán)利要求15至18中任一權(quán)利要求所述的方法，其特征還在于，其中的重金屬是一種過渡金屬。
20.一種根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其特征還在于，其中的過渡金屬是一種VIa族或VIIa族過渡金屬。
21.一種根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其特征還在于，其中的過渡金屬是鉻。
22.一種根據(jù)權(quán)利要求15至21中任一權(quán)利要求所述的方法，其特征還在于，其中的化合物是一種鹽。
23.一種根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其特征還在于，其中的鹽是一種無機鹽，特別地是一種氯化物。
24.一種根據(jù)權(quán)利要求15至23中任一權(quán)利要求所述的方法，其特征還在于，其中的穩(wěn)定劑是氯化鉻。
25.一種根據(jù)權(quán)利要求15至24中任一權(quán)利要求所述的方法，其特征還在于，其中加入細(xì)胞制劑的第一穩(wěn)定劑的量足以形成終濃為0.01％—0.5％w/v的水溶液。
26.一種根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其特征還在于，其中溶液的pH為6.5—7.0。
27.一種根據(jù)權(quán)利要求15至26中任一權(quán)利要求所述的方法，其特征還在于，其中使細(xì)胞在0℃—8℃與第一穩(wěn)定劑接觸5分鐘至18小時。
28.一種根據(jù)權(quán)利要求15至27中任一權(quán)利要求所述的方法，其特征還在于，其中向細(xì)胞制劑中加入一種第二穩(wěn)定劑。
29.一種根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其特征還在于，其中的穩(wěn)定劑是一種醛。
30.一種根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其特征還在于，其中的醛是聚甲醛。
31.一種根據(jù)權(quán)利要求15至30中任一權(quán)利要求所述的方法，其特征還在于，其中第二穩(wěn)定劑的加量為0.1％—0.5％w/v的水溶液。
32.一種根據(jù)權(quán)利要求28至31中任一權(quán)利要求所述的方法，其特征還在于，其中的第二穩(wěn)定劑含有一種醛和一種重金屬化合物的水溶液，其pH為6.5—7.0。
33.一種根據(jù)權(quán)利要求28至32中任一權(quán)利要求所述的方法，其特征還在于，其中使細(xì)胞在0℃—8℃與第二穩(wěn)定劑接觸6至24小時。
34.一種根據(jù)權(quán)利要求28至33中任一權(quán)利要求所述的方法，其特征還在于，其中的第一和第二穩(wěn)定劑分先后加入細(xì)胞制劑中。
35.一種根據(jù)權(quán)利要求15至34中任一權(quán)利要求所述的方法，其特征還在于，基本如實施例中所述。
36.一種根據(jù)權(quán)利要求15至34中任一權(quán)利要求所述的方法，其特征還在于，基本如前所述。
37.一種由根據(jù)權(quán)利要求15至36中任一權(quán)利要求所述的方法制備的根據(jù)權(quán)利要求1至14中任一權(quán)利要求所述的穩(wěn)定化細(xì)胞制劑。
38.一種根據(jù)權(quán)利要求3所述的全血制劑，其特征在于，基本如實施例中所述。
39.一種根據(jù)權(quán)利要求3所述的全血制劑，其特征在于，基本如前所述。
40.一種根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其特征還在于，其中的全血制劑由混合不同供血者的樣品而制得。
41.一種用于白細(xì)胞免疫表型的質(zhì)量控制物質(zhì)，其特征在于，含有根據(jù)權(quán)利要求3所述的穩(wěn)定化的全血制劑。
42.一種白細(xì)胞免疫表型的質(zhì)量控制方法，其特征在于，其中將根據(jù)權(quán)利要求3所述的穩(wěn)定化的全血制劑用作質(zhì)量控制參比物質(zhì)。
43.一種用于含鋅原卟啉、紅細(xì)胞葉酸鹽、全部白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞計數(shù)的血液檢測技術(shù)中任一項的質(zhì)量控制的方法，其特征在于，其中將根據(jù)權(quán)利要求3所述的穩(wěn)定化的全血制劑用作質(zhì)量控制參比物質(zhì)。
44.一種含有通過加入有效量的穩(wěn)定劑而穩(wěn)定化的白細(xì)胞制劑的穩(wěn)定化的全血制劑。
45.一種根據(jù)權(quán)利要求44所述的穩(wěn)定化的全血制劑，其特征在于，含有根據(jù)權(quán)利要求4所述的白細(xì)胞制劑。
46.一種根據(jù)權(quán)利要求42或43所述的穩(wěn)定化的全血制劑，其特征在于，基本如實施例1中所述。
47.一種產(chǎn)生穩(wěn)定化的全血制劑的方法，其特征在于，它包括將穩(wěn)定化的白細(xì)胞制劑加入分去了白細(xì)胞的全血中。
48.一種根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其特征在于，其中將血液濾過白細(xì)胞過濾器制得分去了白細(xì)胞的全血。
49.一種根據(jù)權(quán)利要求47或48所述的方法，其特征在于，基本如實施例1中所述。
50.一種細(xì)胞物質(zhì)的穩(wěn)定劑，其特征在于，它含有某種重金屬化合物和某種醛的水溶液。
51.一種根據(jù)權(quán)利要求50所述的穩(wěn)定劑，其特征還在于，其中的重金屬是一種過渡金屬。
52.一種根據(jù)權(quán)利要求51所述的穩(wěn)定劑，其特征還在于，其中的過渡金屬是一種VIa族或VIIa族過渡金屬。
53.一種根據(jù)權(quán)利要求52所述的穩(wěn)定劑，其特征還在于，其中的過渡金屬是鉻。
54.一種根據(jù)權(quán)利要求50至53中任一權(quán)利要求所述的穩(wěn)定劑，其特征還在于，其中的化合物是一種鹽。
55.一種根據(jù)權(quán)利要求50至51中任一權(quán)利要求所述的穩(wěn)定劑，其特征還在于，其中的鹽是一種無機鹽，特別地是一種氯化物。
56.一種根據(jù)權(quán)利要求50至55中任一權(quán)利要求所述的穩(wěn)定劑，其特征還在于，其中的重金屬化合物是氯化鉻。
57.一種根據(jù)權(quán)利要求50至5 6中任一權(quán)利要求所述的穩(wěn)定劑，其特征還在于，其中的醛是聚甲醛。
58.一種根據(jù)權(quán)利要求50至54中任一權(quán)利要求所述的穩(wěn)定劑，其特征還在于，其中重金屬化合物的含量為0.01％—0.5％w/v而醛的含量為0.1％—0.5％w/v。
59.一種根據(jù)權(quán)利要求50至58中任一權(quán)利要求所述的穩(wěn)定劑，其特征還在于，其中重金屬化合物與醛的含量比為5∶1至1∶50。
60.一種根據(jù)權(quán)利要求50至59中任一權(quán)利要求所述的穩(wěn)定劑，其特征還在于，基本如實施例中所述。
61.一種用于鑒別白細(xì)胞的裂解劑，其特征在于，它含有一種銨鹽或季銨鹽和尿素的溶液，溶液中尿素濃度和pH足以抑制單核細(xì)胞負(fù)調(diào)節(jié)CD14抗原以使它們能被免疫方法檢測出來。
62.一種根據(jù)權(quán)利要求61所述的裂解劑，其特征在于，其中的銨鹽是氯化銨。
63.一種根據(jù)權(quán)利要求61或62所述的裂解劑，其特征在于，其中銨鹽的濃度為0.05—0.5M，而尿素濃度為0.05—0.5M。
64.一種根據(jù)權(quán)利要求61至63中任一權(quán)利要求所述的裂解劑，其特征在于，其中溶液的pH為6.8—7.8。
65.一種根據(jù)權(quán)利要求61至64中任一權(quán)利要求所述的裂解劑，其特征在于，基本如實施例1中所述。
66.一種裂解全血的方法，其特征在于，它包括使血液與根據(jù)權(quán)利要求61至65中任一權(quán)利要求所述的裂解劑接觸。
67.一種穩(wěn)定化的全血制劑，其特征在于，它含有穩(wěn)定化的白細(xì)胞和未處理過的紅細(xì)胞。
68.一種根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，其中第一穩(wěn)定劑被加入只去除了血漿的全血制劑中。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用含有某種重金屬化合物，特別是過渡金屬鹽的某種穩(wěn)定劑處理細(xì)胞以制備穩(wěn)定化的細(xì)胞制劑。這種穩(wěn)定化的細(xì)胞制劑可以是用于質(zhì)量控制過程中的穩(wěn)定化的全血制劑。
文檔編號G01N33/50GK1126437SQ94192671
公開日1996年7月10日 申請日期1994年7月5日 優(yōu)先權(quán)日1993年7月5日
發(fā)明者V·格蘭杰, D·巴尼特, J·T·賴?yán)? P·S·M·邁爾, S·P·費伊 申請人:北方總醫(yī)院N.H.S.托拉斯