專(zhuān)利名稱(chēng)：腫瘤早期檢測(cè)評(píng)估試劑盒及其制備工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種腫瘤早期檢測(cè)評(píng)估試劑盒及其制備工藝。
腫瘤組織發(fā)生、發(fā)展依賴(lài)于新生血管的不斷形成，通過(guò)新生毛細(xì)血管為腫瘤細(xì)胞提供必需的營(yíng)養(yǎng)和氧氣，同時(shí)血管的形成又可為腫瘤細(xì)胞代謝廢物的及時(shí)排泄提供了便利的通道。研究表明，實(shí)體腫瘤組織的血管內(nèi)皮細(xì)胞倍增時(shí)間僅為4天，而正常成人的組織中的血管內(nèi)皮細(xì)胞倍增時(shí)間約為1年，腫瘤組織的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的速度比正常組織快90多倍，腫瘤組織血管內(nèi)皮細(xì)胞快速增長(zhǎng)的原因在腫瘤發(fā)生或復(fù)發(fā)時(shí)，腫瘤血管形成有關(guān)的一組基因開(kāi)始活動(dòng)和高度表達(dá)。腫瘤切除后，這些基因產(chǎn)物開(kāi)始下降，甚至降到正常水平。腫瘤一旦復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移這些基因又開(kāi)始活動(dòng)，基因產(chǎn)物又開(kāi)始升高。瘤體的縮小、發(fā)展與轉(zhuǎn)移，治療效果的好與壞都可影響到這些基因的表達(dá)。監(jiān)測(cè)癌癥病人這些基因的活動(dòng)情況及波動(dòng)變化可以預(yù)示病情的變化趨勢(shì)。在這些基因中，尤以堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic Fibroblast GrowthFactor，bFGF)與血管的增生為密切。本試劑盒就是通過(guò)腫瘤病人血、尿中的bFGF來(lái)為臨床醫(yī)生提供了分子水平腫瘤狀態(tài)的檢測(cè)方法。
近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)遠(yuǎn)外微小轉(zhuǎn)移灶里的癌細(xì)胞處于無(wú)血管生成的血管前期時(shí)，其增殖速率與快速生長(zhǎng)的原發(fā)灶的細(xì)胞增殖速率相近；而此時(shí)的微小轉(zhuǎn)移灶內(nèi)的癌細(xì)胞有一個(gè)非常高的凋亡速率，這時(shí)腫瘤細(xì)胞的凋亡速率與增殖速率相平衡。當(dāng)腫瘤血管系統(tǒng)在轉(zhuǎn)移灶里形成并使癌灶進(jìn)入血管期后，凋亡和增殖之間的平衡被破壞，凋亡減少而增殖過(guò)程占優(yōu)勢(shì)，結(jié)果表現(xiàn)為快速生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)移灶。
本發(fā)明的目的在于提供一種腫瘤早期檢測(cè)評(píng)估試劑盒及其試劑盒中bFGF單克隆抗體、多克隆抗體和其它緩沖劑的制備工藝，能夠簡(jiǎn)單地對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，腫瘤的療效進(jìn)行動(dòng)態(tài)評(píng)估。
本試劑盒每盒是由以下物質(zhì)組成的包被緩沖液1瓶陽(yáng)性對(duì)照(bFGF)1瓶陰性對(duì)照(生理鹽水)1瓶BFGF的單克隆抗體或多克隆抗體 1瓶二抗標(biāo)記物1瓶酶底物溶液1瓶終止液1瓶洗滌液1瓶封口膠1塊酶標(biāo)板1塊其中陽(yáng)性對(duì)照(bFGF)、陰性對(duì)照(生理鹽水)、二抗標(biāo)記物、封口膠、酶標(biāo)板為現(xiàn)有物質(zhì)；包被緩沖液、BFGF的單克隆抗體或多克隆抗體、酶底物溶液、終止液、洗滌液是由本發(fā)明的工藝制備而成的。
本發(fā)明的工藝是通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)的；1.多克隆抗體的制備1.1 bFGF抗原瑞森基因項(xiàng)目工程藥物研究所制備1.2動(dòng)物成年純種大耳白兔1.3方法A免疫準(zhǔn)備于每只家兔兩后肢腳掌皮下注入活BCG各0.5ml，共1ml含蛋白5—6mg。B第一次免疫注射弗氏完全佐劑(FCA)抗原的制備，取不完全佐劑5ml，緩慢滴加BCG，邊滴邊研磨。再逐滴加入等量bFGF抗原液(邊滴邊研磨)直至形成油包水乳劑，滴1滴于冷水上久置不散為合格，滴加BCG及抗原時(shí)不可太快，加1滴充分研勻再滴下1滴，最后所制弗氏完全佐劑中，應(yīng)含BCG5—6mg/ml，抗原5mg/ml。
免疫準(zhǔn)備后10天左右，于每只兔兩后支窩已腫大的淋巴結(jié)構(gòu)內(nèi)或其近旁各注入弗氏完全佐劑抗原(bFGF)0.5ml，共1ml，含蛋白5mg。C第二次免疫注射間隔2-3周后，于每只兔脊柱兩側(cè)，兩肩部，兩臀部及兩腹股溝皮下作多點(diǎn)注射，每點(diǎn)0.2ml弗氏完全佐劑抗原，共8—10點(diǎn)。D第三次免疫注射間隔2-3周后，再于每只家兔脊柱兩側(cè)、肩部、兩臀部選不同點(diǎn)上，作皮下多點(diǎn)注射，共8點(diǎn)，每點(diǎn)注射弗氏不完全佐劑抗原(不含BCG)0.2ml。E試血測(cè)抗體效價(jià)間隔7-10天，無(wú)菌采兔耳靜脈血0.5-1ml，分離血清，以雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)測(cè)抗體效價(jià)。效價(jià)＞1∶32時(shí)，可以放血。否則，以不加佐劑的抗原作靜脈注射免疫，一周內(nèi)注射3次，依次為0.1、0.3、0.5m.l(含人bFGF分為1mg，3mg，5mg)。一周后再試血測(cè)效價(jià)，達(dá)到要求，立即放血。F放血采用頸動(dòng)脈采血法。G分離血清將放出或抽出的血液傾斜放入37℃孵箱15-30分鐘，再移至4℃數(shù)小時(shí)，待血塊收縮，血清析出時(shí)，吸出血清，放入試管中，2000轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘。HIgG的分離純化IgG的提取分兩步進(jìn)行，第一步采用鹽析法粗提人γ球蛋白；第二步將提取的γ球蛋白再以DEAE-Sephadex A50柱層析提純IgG。具體方法如下取血清60ml+生理鹽水60ml，于攪拌下逐滴加入飽合硫酸銨120ml，4℃，30分鐘，離心3000轉(zhuǎn)X20分鐘，棄上清，加生理鹽水60ml溶液，于攪拌下逐滴加入飽合硫酸銨30ml，4℃，3小時(shí)，離心3000轉(zhuǎn)/分X20分鐘，棄上清，以0.02M PH7.4 PBS溶解沉淀物至Xml。在PH7.2-7.4的環(huán)境中，酸性蛋白均被DEAE-Sephadex A50吸附，只有IgG不被吸附，而成為穿過(guò)峰，獲得較純的IgG。2.單克隆抗體的制備2.1 小鼠免疫BAL B/C小鼠6-8周，用50-100ug bFGF加福氏完全佐劑腹腔注射，間隔2-3周后，用同樣劑量bFGF腹腔加強(qiáng)免疫2-3次，末次免疫后第3-4天取脾細(xì)胞融合。2.2 抗原bFGF，由陜西瑞森基因工程藥物研究所提供。2.3 細(xì)胞融合，免疫小鼠脾細(xì)胞和Sp2/0細(xì)胞按10∶1的比例混合，在50％PEG(MW＝1500)的作用下，進(jìn)行細(xì)胞融合，用ELISA間接法初步篩選出陽(yáng)性克隆，再用中和抑制試驗(yàn)證實(shí)為陽(yáng)性克隆后，經(jīng)有限稀釋法克隆2-3次，篩選出分泌抗體陽(yáng)性的單個(gè)克隆，穩(wěn)定傳代3個(gè)月，制備腹水和液氮凍存。2.4 單克隆抗體的鑒定2.4.1 雜交瘤細(xì)胞系染色體分析取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞用秋水仙素處理，經(jīng)Giemsa染色，鏡檢計(jì)數(shù)。2.4.2 Ig類(lèi)及IgG亞類(lèi)測(cè)定用美國(guó)Sigma公司的抗鼠Ig亞類(lèi)抗血清與濃縮至原容積1/20的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液作瓊脂雙向免疫擴(kuò)散。2.4.3 單克隆抗體特異性的測(cè)定將bFGF進(jìn)行電轉(zhuǎn)移，而后用各株單抗分別進(jìn)行ELISA染色。2.4.4 單克隆抗體比活性測(cè)定將各株單抗的蛋白進(jìn)行定量，然后按不同稀釋度測(cè)定各株的滴度。3. 多克隆及克隆ELISA測(cè)定尿樣中的的bFGF3.1 各種緩沖液及試劑的配制方法A.包被緩沖液0.05M PH9.6的Na2CO3—NaHCO3Na2CO3(MW105.99)1.59克NaHCO3(MW84.01)2.93克蒸餾水溶至1000mlB.洗滌液PH7.4的PBS-Tween 20NaCl(MW58.44)8.0克KH2PO4(MW136.09)0.2克Na2HPO4·12H2O(MW358.14)2.9克(或者NaHPO41.14克 )KCl(MW74.56)0.2克蒸餾水溶至1000mlTween 20 0.5mlC.酶標(biāo)記物稀釋液在上述洗滌液中加入羊血清，濃度為2％。D.酶底物溶液鄰苯二胺(O.P.D)—H2O2(2)磷酸—檸檬酸緩沖液PH5.0①0.2M Na2HPO4
取Na2HPO4·12H2O 71.63克用蒸餾水溶至1000ml。
②0.1M檸檬酸液取檸檬酸19.2克，用蒸餾水溶至1000ml，?、僖?5.7ml，②液24.3ml，再加蒸餾水50ml。
(2)O.P.D—H2O2鄰苯二胺(O.P.D)10mg磷酸—檸檬酸緩沖液25ml3％H2O2(分析純)0.4mlE.終止液2MH2SO4濃硫酸(95-98％)22.2ml蒸餾水 177.3ml(配時(shí)將濃硫酸緩慢滴入蒸餾水中，邊加邊搖勻。)3.2操作步驟取單克隆或多克隆抗體，正常鼠IgG(均稀釋成10mg/ml)平行包被40孔板(如A排包被單克隆或多克隆抗體，B排包被正常鼠IgG)，0.1ml/孔，放入濕盒中4℃冰箱過(guò)夜，用洗滌液洗滌板3次，每次3分鐘，甩干。在平行包被的孔中加入被檢抗原0.1ml/孔，37℃孵育1小時(shí)，同上洗滌3次，甩干。再在各孔內(nèi)加入單克隆或多克隆抗體(稀釋成10mg/ml)，0.1ml/孔，37℃孵育1小時(shí)，同上洗滌3次，甩干，在各孔中加入酶標(biāo)的二抗(稀釋成1∶4000)，0.1ml/孔，37℃孵育1小時(shí)，同上洗滌3次，甩干。在各孔內(nèi)加入酶底物溶液0.1ml/孔，37℃避光孵育20分鐘。在各孔內(nèi)加入2M H2SO40.025ml/孔，終止反應(yīng)，用酶聯(lián)檢測(cè)儀測(cè)定各孔的490nm的吸光度。3.3 結(jié)果判定OD 比值計(jì)算
實(shí)施例一.試劑盒組成96人份 48人份 20人份包被緩沖液 1瓶 10ml 5ml 2.5ml陽(yáng)性對(duì)照(bFGF) 1瓶 1ml 0.5ml 0.25ml陰性對(duì)照(生理鹽水) 1瓶 1ml 0.5ml 0.25mlBFGF的單克隆抗體或多克隆抗體 1瓶 10ml 5ml 5ml二抗標(biāo)記物 1瓶 10ml 5ml 5ml酶底物溶液 1瓶 6ml 3ml 3ml終止液 1瓶 6ml 3ml 3ml洗滌液 1瓶 25ml 12.5ml 6ml封口膠 1塊 10塊 10塊1塊酶標(biāo)板 1塊 96孔板 48孔板 24孔板二、標(biāo)本收集1.晨尿、脫水及大量輸液病人不宜采尿。
2.最好新鮮尿樣，4℃可保存48小時(shí)，-20℃可保存4周。
3.尿液不能反復(fù)凍融。三、試劑貯存1. 4℃保存，有效期為4-6個(gè)月。
2.包被液必須蓋緊，4℃保存，長(zhǎng)期不用，應(yīng)更換新包被液。四、檢測(cè)步驟1.取出酶標(biāo)板，每孔加包被液2滴(其中3孔不加，直接加陽(yáng)、陰性對(duì)照液各2滴，一孔留作空白對(duì)照)。2.加病人尿液10ul，與包被液混勻。加蓋封口膜，置濕盒，4℃過(guò)夜或37℃3.5—4小時(shí)以上。3.到時(shí)取出，吸去包被液，每孔加洗滌液200ul，洗3次，每次加洗液后靜置1分鐘后，甩凈，拍干余液。4.加一抗2滴，37℃濕盒60分鐘。5.同步驟3，洗3次。6.加二抗2滴，37℃濕盒60分鐘。7.同步驟3，洗3次。8.每孔滴加底物A和B各1滴(空白不滴)，混勻，置濕盒37℃×30分鐘(或室溫45分鐘)避光。到時(shí)，每孔加終止液1滴，在酶標(biāo)儀490mm處測(cè)OD值。五、判斷結(jié)果OD比值計(jì)算
六、臨床評(píng)估參考1 待檢標(biāo)本OD比值≥2.1，表明血管形成肽基因表活躍。2 待檢標(biāo)本OD比值在1.5—2.0之間為可疑。3 待檢標(biāo)本OD比值在1.5以下，表示血管形成肽基因表達(dá)處于靜止期。
權(quán)利要求
1.腫瘤早期檢測(cè)評(píng)估試劑盒，包括陽(yáng)性對(duì)照(bFGF)、生理鹽水、二抗標(biāo)記物、封口膠、酶標(biāo)板，其特征在于，其中還包括包被緩沖液、BFGF的單克隆抗體或多克隆抗體、酶底物溶液、終止液和洗滌液。
2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的試劑盒，其特征在于，所說(shuō)的包被緩沖液為0.05M、PH9.6的Na2CO3—NaHCO3，所說(shuō)的酶底物溶液為鄰苯二胺(O.P.D)—H2O2，所說(shuō)的終止液為2MH2SO4，所說(shuō)的洗滌液為PH7.4的PBS—Tween 20。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒的制備工藝，其特征在于，所說(shuō)的BFGF的多克隆抗體按以下A-H步驟制備A免疫準(zhǔn)備于每只家兔兩后肢腳掌皮下注入活BCG各0.5ml，共1ml含蛋白5-6mg；B第一次免疫注射弗氏完全佐劑(FCA)抗原的制備，取不完全佐劑5ml，緩慢滴加BCG，邊滴邊研磨，再逐滴加入等量bFGF抗原液(邊滴邊研磨)直至形成油包水乳劑，滴1滴于冷水上久置不散為合格，滴加BCG及抗原時(shí)不可太快，加1滴充分研勻再滴下1滴，最后所制弗氏完全佐劑中，應(yīng)含BCG5—6mg/ml，抗原5mg/ml；免疫準(zhǔn)備后10天左右，于每只兔兩后支窩已腫大的淋巴結(jié)構(gòu)內(nèi)或其近旁各注入弗氏完全佐劑抗原(bFGF)0.5ml，共1ml，含蛋白5mg；C第二次免疫注射間隔2-3周后，于每只兔脊柱兩側(cè)，兩肩部，兩臀部及兩腹股溝皮下作多點(diǎn)注射，每點(diǎn)0.2ml弗氏完全佐劑抗原，共8—10點(diǎn)；D第三次免疫注射間隔2-3周后，再于每只家兔脊柱兩側(cè)、肩部、兩臀部選不同點(diǎn)上，作皮下多點(diǎn)注射，共8點(diǎn)，每點(diǎn)注射弗氏不完全佐劑抗原(不含BCG)0.2ml；E試血測(cè)抗體效價(jià)間隔7-10天，無(wú)菌采兔耳靜脈血0.5-1ml，分離血清，以雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)測(cè)抗體效價(jià)。效價(jià)＞1∶32時(shí)，可以放血，否則，以不加佐劑的抗原作靜脈注射免疫，一周內(nèi)注射3次，依次為0.1、0.3、0.5m.l(含人bFGF分為1mg，3mg，5mg)，一周后再試血測(cè)效價(jià)，達(dá)到要求，立即放血；F放血采用頸動(dòng)脈采血法;G分離血清將放出或抽出的血液傾斜放入37℃孵箱15-30分鐘，再移至4℃數(shù)小時(shí)，待血塊收縮，血清析出時(shí)，吸出血清，放入試管中，2000轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘；HIgG的分離純化IgG的提取分兩步進(jìn)行，第一步采用鹽析法粗提人γ球蛋白；第二步將提取的γ球蛋白再以DEAE-Sephadex A50柱層析提純IgG，具體方法如下取血清60ml+生理鹽水60ml，于攪拌下逐滴加入飽合硫酸銨120ml，4℃，30分鐘，離心3000轉(zhuǎn)X20分鐘，棄上清，加生理鹽水60ml溶液，于攪拌下逐滴加入飽合硫酸銨30ml，4℃，3小時(shí)，離心3000轉(zhuǎn)/分X20分鐘，棄上清，以0.02M PH7.4 PBS溶解沉淀物至Xml，在PH7.2-7.4的環(huán)境中，酸性蛋白均被DEAE-Sephadex A50吸附，只有IgG不被吸附，而成為穿過(guò)峰，獲得較純的IgG。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒的制備工藝，其特征在于，所說(shuō)的BFGF的單克隆抗體按以下步驟制備(1)小鼠免疫BAL B/C小鼠6-8周，用50-100ug bFGF加福氏完全佐劑腹腔注射，間隔2-3周后，用同樣劑量bFGF腹腔加強(qiáng)免疫2-3次，末次免疫后第3-4天取脾細(xì)胞融合；(2)免疫小鼠脾細(xì)胞和Sp2/0細(xì)胞按10∶1的比例混合，在50％PEG(MW＝1500)的作用下，進(jìn)行細(xì)胞融合，用ELISA間接法初步篩選出陽(yáng)性克隆，再用中和抑制試驗(yàn)證實(shí)為陽(yáng)性克隆后，經(jīng)有限稀釋法克隆2-3次，篩選出分泌抗體陽(yáng)性的單個(gè)克隆，穩(wěn)定傳代3個(gè)月，制備腹水和液氮凍存。
全文摘要
本發(fā)明提供一種腫瘤早期檢測(cè)評(píng)估試劑盒,由包被緩沖液、陽(yáng)性對(duì)照(bFGF)、生理鹽水、BFGF的單克隆抗體或多克隆抗體等組成,同時(shí),本發(fā)明還提供了BFGF單克隆抗體、多克隆抗體和其它緩沖劑的制備工藝,能夠簡(jiǎn)單對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展,腫瘤的療效進(jìn)行動(dòng)態(tài)評(píng)估。
文檔編號(hào)G01N33/531GK1251901SQ9911590
公開(kāi)日2000年5月3日 申請(qǐng)日期1999年11月9日 優(yōu)先權(quán)日1999年11月9日
發(fā)明者趙永同, 祁淼 申請(qǐng)人:趙永同, 祁淼