專利名稱：癌的早期診斷方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及癌及癌前期的早期診斷方法，特別是上呼吸道或肛殖道癌的早期診斷方法。
自50年代中期以來對大多數(shù)不同的癌已提供了預(yù)防計劃。關(guān)于宮頸癌，主要是基于宮頸的細(xì)胞涂片的形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)檢查，即所謂的Pap測試，其基于婦女從20歲起定期進(jìn)行的婦科學(xué)常規(guī)檢查。通過細(xì)胞的形態(tài)學(xué)，涂片被分成各種強(qiáng)度程度的發(fā)育異常細(xì)胞變化。根據(jù)Pap I-V，這些強(qiáng)度程度分別代表正常、清度發(fā)育異常、稍嚴(yán)重發(fā)育異常、嚴(yán)重發(fā)育異常和浸潤性癌。如果Pap測試產(chǎn)生令人震驚的結(jié)果，則進(jìn)行小規(guī)?；罱M織檢查并進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，由此將發(fā)育異常的種類和強(qiáng)度確定并劃分為宮頸上皮內(nèi)癌(CINI-III)。
盡管有預(yù)防計劃，但是每年增加400000個新病例的宮頸癌仍是婦女中發(fā)生頻率為第二位的癌癥。這特別是由于Pap測試結(jié)果的近30％是假陰性所致。
因此，本發(fā)明的目的是提供一種可以早期和可靠診斷宮頸癌的方法。另外，由此方法應(yīng)可以區(qū)分腫瘤形成前發(fā)育異常的良性炎性改變或化生改變。
根據(jù)本發(fā)明，這可通過權(quán)利要求書中定義的本發(fā)明主題實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明基于申請人的如下觀察即細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白在許多癌，例如上呼吸道或肛殖道癌、特別是宮頸癌以及這些癌的前期中過表達(dá)。細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白的例子為細(xì)胞周期蛋白。特別提及的是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白的細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶，更特別提及的是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶的細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制蛋白。細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制蛋白的例子為蛋白質(zhì)p14，p15，p16，p19，p21和p27。本申請人發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白的過表達(dá)的強(qiáng)度與細(xì)胞發(fā)育異常程度相關(guān)。
根據(jù)本發(fā)明，本申請人的觀察用作一種癌及癌前期的早期診斷方法，其包括在一機(jī)體樣品中確定細(xì)胞周期蛋白的過表達(dá)。
術(shù)語“癌及癌前期”包括任何種類和任何起源的癌及其前期。例如，它們可以是上呼吸道或肛殖道癌，特別是宮頸癌。宮頸癌中，特別提及的是其前期，例如宮頸上皮內(nèi)癌(CINI-III)，原位癌(CIS)等。
術(shù)語“細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白”包括任何種類和起源的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白。例如，這些蛋白可以是細(xì)胞周期蛋白。特別是，它們可以是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白的細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶。細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶的例子是蛋白質(zhì)cdk4和cdk6。更特別地，它們可以是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶的細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制蛋白。細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制蛋白的例子是蛋白質(zhì)p14，p15，p16，p19，p21和p27，優(yōu)選的是p16。
術(shù)語“機(jī)體樣品”包括可以檢測細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白的任何機(jī)體樣品，這種機(jī)體樣品的例子是血、涂片、痰、尿、糞便、液體(liquor)、膽汁、胃腸道分泌物、淋巴、骨髓、器官穿刺物或抽吸物和活組織檢查樣品。當(dāng)檢查肛殖道癌例如宮頸癌時，特別提及的是涂片和活檢樣品。
術(shù)語“確定細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白的過表達(dá)”包括適于檢測細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白或其編碼mRNA的表達(dá)和相應(yīng)基因的擴(kuò)增的任何方法。為確定過表達(dá)，顯然是將待檢查的機(jī)體樣品與來自健康人的相應(yīng)機(jī)體樣品相比較，這種樣品可作為標(biāo)準(zhǔn)形式存在。細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白的(過)表達(dá)可在核酸水平和蛋白質(zhì)水平檢測。對于蛋白質(zhì)水平的檢測，可以使用例如針對細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白的抗體，這些抗體可用于大多數(shù)不同方法中，如Western印跡、ELISA或免疫沉淀。有利的是抗體固定在固相載體如測試條或乳膠顆粒上。
通過本發(fā)明，可以早期診斷癌癥，即在其前期診斷。
本發(fā)明的另一主題涉及進(jìn)行本發(fā)明方法的試劑盒，這種試劑盒包括(a)檢測細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)的試劑，例如針對這種蛋白的抗體，或編碼這種蛋白或其部分的核酸，(b)常規(guī)助劑，如緩沖劑、載體、標(biāo)記物等，和任選地(c)用于對照反應(yīng)的制劑，例如一種細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白，編碼這種蛋白及其部分的核酸，或細(xì)胞制備物，例如組織切片或固定在玻片上的細(xì)胞。
以上陳述相應(yīng)地適于所述試劑盒的各組分。另外，可存在各個組分的一或幾個代表。
通過本發(fā)明，可以早期診斷癌，特別是可以早期診斷癌前期。還可以區(qū)分腫瘤形成前發(fā)育異常的良性炎性改變或化生改變。另一個特征是本發(fā)明方法獲得的結(jié)果不進(jìn)行主觀評價，因而Pap測試或組織學(xué)制備的假陰性和假陽性結(jié)果可以避免。另外，本發(fā)明可以快速簡便地操作，因而可用于深入篩選措施，特別是在第三世界國家中。因此，本發(fā)明對現(xiàn)今癌癥診斷作出了重要貢獻(xiàn)。
圖2示出在HPV16轉(zhuǎn)化的NIH3T3細(xì)胞中cdk6和p19的過表達(dá)的檢測。co代表對照。
本發(fā)明通過以下實(shí)施例解釋。實(shí)施例1 在子宮頸活檢樣品中檢測p16的過表達(dá)(A)從20個子宮頸活檢樣品產(chǎn)生厚度為3-5微米的石蠟切片，其包括所有程度的發(fā)育異常進(jìn)程，從正常組織(n＝2)經(jīng)CIN I(n＝4)，II(n＝4)，III(n＝5)病變至浸潤性癌(n＝5)。它們在二甲苯中脫石蠟2×10分鐘并用乙醇再氫化?？乖?0mM檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0)中在高壓滅菌器中于110℃、10分鐘解蔽。之后用在PBS中的0.25％H2O2失活內(nèi)源性過氧化物酶。用馬血清(Vectastain ABC檢測試劑盒，VectroLaboratories，Burlingame，美國加利福尼亞州)在室溫封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)20分鐘，隨后切片在存在3％胎牛血清時與p16特異性單克隆抗體(Neomarkers，F(xiàn)remont，美國加利福尼亞州)在室溫保溫45分鐘。為檢測p16抗體結(jié)合，加入生物素化第二抗體(馬抗鼠IgG，Vectastain試劑盒，同上)保溫30分鐘，之后，用Vectastain試劑盒的試劑根據(jù)其指導(dǎo)檢測結(jié)合的第二抗體，并用Mayer蘇木精明礬溶液進(jìn)行核心復(fù)染。
結(jié)果示出p16的過表達(dá)存在于發(fā)育異常細(xì)胞中，還示出p16過表達(dá)強(qiáng)度與細(xì)胞發(fā)育異常程度相關(guān)。(B)另外，從78個子宮頸活檢樣品制備石蠟切片，活檢樣品涉及正常組織(n＝12)，CIN I(n＝15)，II(n＝14)，III(n＝18)階段的發(fā)育異常病變及浸潤性癌(n＝19)。石蠟切片如上(A)所述處理。獲得表1所示數(shù)據(jù)。
表1p16表達(dá)強(qiáng)度組織學(xué)n＝ - + +++++正常 129 3CIN I 1510 3 2CIN II141 4 9CIN III 189 9CxCa 191 18總計 7820 10 2127由表1數(shù)據(jù)可看出，p16在發(fā)育異常和浸潤性癌的細(xì)胞中過表達(dá)，過表達(dá)隨著發(fā)育異常程度向浸潤性癌發(fā)展而增加。(C)另外，來自180個子宮頸癌生物活檢樣品的石蠟切片如上述(A)方式處理。另外，測定與上述p16特異性單克隆抗體反應(yīng)的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。在HPV陽性和HPV陰性發(fā)育異常和浸潤性癌之間也進(jìn)行區(qū)分，獲得表2所示數(shù)據(jù)。
表2過表達(dá)p16的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)n 平均百分?jǐn)?shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差CIN I 3254.9±24.0HPV陰性 1754.0±27.2HPV陽性 1555.9±21.0CIN II3270.8±18.9HPV陰性 1476.0±15.8HPV陽性 1866.8±20.5CIN III 6092.4±10.2HPV陰性 9 94.4±7.5HPV陽性 5192.1±10.7浸潤性癌 5897.8±5.2HPV陰性 5 96.4±8.1HPV陽性 5397.9±4.9表2數(shù)據(jù)顯示p16在發(fā)育異常和浸潤性癌的HPV陽性和HPV陰性細(xì)胞中均過表達(dá)，這一結(jié)果經(jīng)正常組織的對照而證實(shí)。數(shù)據(jù)還顯示與p16反應(yīng)的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)隨著發(fā)育異常程度向浸潤性癌發(fā)展而增加。實(shí)施例2細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白在HPV轉(zhuǎn)化細(xì)胞中的過表達(dá)的檢測(A)在無血清存在下培養(yǎng)用HPV16轉(zhuǎn)化的宮頸癌細(xì)胞CaSki，培養(yǎng)72小時。加入血清后，在各時間點(diǎn)收集細(xì)胞抽提物，進(jìn)行SDS-PAGE并轉(zhuǎn)移至PVDF膜(Du Pont)。用來自Santa Cruz的多克隆抗血清(1∶1000)確定cdk4的表達(dá)。另外，HPV16-E7蛋白的表達(dá)用來自Triton的抗HPV16-E7D單克隆抗體(1∶50)測定。經(jīng)過氧化物酶連接的第二抗體和化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)(NEN，Du Pont)檢測各免疫應(yīng)答。
結(jié)果是cdk4過表達(dá)(參見

圖1)。(B)用HPV16轉(zhuǎn)化NIH3T3細(xì)胞以獲得HPV16-E7蛋白的表達(dá)。獲得該轉(zhuǎn)化細(xì)胞的細(xì)胞抽提物并如(A)所述處理。為檢測cdk6和p19的表達(dá)，使用來自Santa Cruz的多克隆抗血清(1∶1000)。HPV16-E7蛋白表達(dá)的檢測和各免疫應(yīng)答的檢測參照上述(A)所述。
結(jié)果是cdk6和p19過表達(dá)(參見圖2)。
權(quán)利要求
1.癌及癌前期的早期診斷方法，包括在一機(jī)體樣品中確定細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白的過表達(dá)。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述的癌是上呼吸道癌。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述的癌是肛殖道癌。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述的肛殖道癌是宮頸癌。
5.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的方法，其中細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白是細(xì)胞周期蛋白。
6.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的方法，其中細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白是細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶。
7.權(quán)利要求6的方法，其中細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶是cdk4或cdk6。
8.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的方法，其中細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白是細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制蛋白。
9.權(quán)利要求8的方法，其中細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制蛋白是蛋白質(zhì)p14，p15，p16，p18，p19，p21或p27。
10.權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的方法，其中機(jī)體樣品分別是是血、涂片、痰、尿、糞便、液體(liquor)、膽汁、骨髓、胃腸道分泌物、器官穿刺物或抽吸物和活組織檢查樣品，和/或淋巴。
11.權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的方法，其中是在核酸水平確定過表達(dá)。
12.權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的方法，其中是在蛋白質(zhì)水平確定過表達(dá)。
13.權(quán)利要求12的方法，其中通過抗細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白的抗體確定過表達(dá)。
14.進(jìn)行權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)的方法的試劑盒，包含(a)檢測細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)的試劑，(b)常規(guī)助劑，如緩沖劑、載體、標(biāo)記物等，和任選地(c)用于對照反應(yīng)的制劑。
15.權(quán)利要求14的試劑盒，其中所述試劑是抗細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白的抗體。
16.權(quán)利要求14的試劑盒，其中所述試劑是編碼細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白或其部分的核酸。
17.權(quán)利要求14-16任一項(xiàng)的試劑盒，其中所述的制劑是一種細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白，或編碼這種蛋白或其部分的核酸。
18.權(quán)利要求14-16任一項(xiàng)的試劑盒，其中所述的制劑是一種細(xì)胞制備物。
全文摘要
本發(fā)明涉及癌及癌前期的早期診斷方法,包括在一機(jī)體樣品中確定細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白的過表達(dá)。本發(fā)明還涉及可用于所述方法的試劑盒。
文檔編號G01N33/574GK1307681SQ99807911
公開日2001年8月8日 申請日期1999年7月1日 優(yōu)先權(quán)日1998年7月1日
發(fā)明者馬格努斯·馮·克內(nèi)貝爾·德貝瑞茨, 迪米特里·施皮科夫斯凱 申請人:馬格努斯·馮·克內(nèi)貝爾·德貝瑞茨, 德國公共權(quán)利基金會癌癥研究中心