專利名稱：一種檢測(cè)生物樣品中分析物存在的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的領(lǐng)域一般地，本發(fā)明涉及一種檢測(cè)生物樣品中分析物存在的方法。更具體地，本發(fā)明提供一種檢測(cè)生物樣品中血液存在，甚至更具體地是高濃度血液存在的方法。本發(fā)明的方法還有助于區(qū)分上下胃腸道出血。本發(fā)明的方法尤其是對(duì)胃腸道疾病，特別是下胃腸道疾病如直腸結(jié)腸癌的診斷有用。
本發(fā)明的背景目前腸道出血是腸癌(又叫直腸結(jié)腸癌)的最佳早期指征。通常，腸道出血系統(tǒng)的檢測(cè)通過篩檢大便中是否存在血來進(jìn)行。該檢測(cè)通常被稱作大便潛血試驗(yàn)(即“FOBT”)。
化學(xué)試驗(yàn)已被廣泛用于FOBT。典型地，這些試驗(yàn)要求大便施加在浸透有化學(xué)試劑愈創(chuàng)木脂的試紙上。當(dāng)顯影液加到紙上時(shí)，陽性結(jié)果產(chǎn)生藍(lán)色。愈創(chuàng)木脂試驗(yàn)有易于操作且經(jīng)濟(jì)的好處，但不太準(zhǔn)確(對(duì)人血無特異性)，而且靈敏度低于需要。然而，幾項(xiàng)國際研究顯示用這些試驗(yàn)篩檢患者可以通過癌前期及癌損害的早期檢出，挽救患者的生命。通常采用的愈創(chuàng)木脂試驗(yàn)檢測(cè)血紅蛋白的血紅素，而且因?yàn)樗鄬?duì)不易在小腸降解，所以這些試驗(yàn)可檢測(cè)到腸道內(nèi)任一處出血。對(duì)于直腸結(jié)腸癌篩選，這是不利的，因?yàn)檫@些腫瘤只局限于大腸。
最近開發(fā)了更靈敏且特異的免疫學(xué)試驗(yàn)(如免疫性層析試驗(yàn))，它在篩選直腸結(jié)腸癌時(shí)，有提高血液檢測(cè)準(zhǔn)確度的潛能。這些試驗(yàn)典型地檢測(cè)血紅蛋白的珠蛋白，一種不能通過上胃腸道而存活的蛋白質(zhì)。因此，陽性免疫結(jié)果表明下胃腸道出血。然而與所有基于免疫學(xué)的試驗(yàn)一樣，這些試驗(yàn)服從“前帶”或“高劑量鉤(high dose hook)”效應(yīng)，即在分析物高水平時(shí)，該試驗(yàn)可被抑制，達(dá)到可能漏掉大量出血的程度。
因此，需要開發(fā)在生物樣品中檢測(cè)血液的改進(jìn)方法，該方法使由于前帶現(xiàn)象的效應(yīng)導(dǎo)致的假陰性結(jié)果的發(fā)生率達(dá)到最低。在導(dǎo)致本發(fā)明的工作中，發(fā)明人發(fā)明了一種用兩部分檢測(cè)過程篩檢生物樣品是否存在血液的方法，其包括進(jìn)行一個(gè)篩檢血紅蛋白的珠蛋白成分存在的免疫學(xué)檢測(cè)和一個(gè)篩檢血紅蛋白的血紅素成分的非免疫學(xué)檢測(cè)。因此，即使由于高濃度珠蛋白的存在，用于篩檢珠蛋白的免疫學(xué)檢測(cè)方法產(chǎn)生了假陰性結(jié)果，對(duì)前帶現(xiàn)象效應(yīng)不敏感的血紅素試驗(yàn)仍產(chǎn)生陽性結(jié)果。發(fā)明人還發(fā)明了一種克服前帶現(xiàn)象效應(yīng)的免疫學(xué)篩檢法。
本發(fā)明概述除非上下文特殊要求，否則在整個(gè)說明書及其后的權(quán)利要求中，“包含”、“含有”和“包括”均被理解為指包括所述的整體或步驟，或整體組或步驟組，但并不排除任何其它的整體或步驟或整體組或步驟組。
因此，本發(fā)明提供一種檢測(cè)生物樣品中血液存在的方法，所述方法包含步驟(i)將生物樣品施加至包含多個(gè)區(qū)的試驗(yàn)基質(zhì)的第一區(qū)；(ii)允許所述生物樣品流至所述試驗(yàn)基質(zhì)的第二區(qū)，其中，在足以形成珠蛋白-抗珠蛋白復(fù)合物的時(shí)間和條件下使所述樣品與抗珠蛋白免疫相互作用分子(immunointeractive molecule)接觸，并檢測(cè)所述珠蛋白-抗珠蛋白復(fù)合物；和(iii)允許所述生物樣品流至所述試驗(yàn)基質(zhì)的第三區(qū)，其中，在色素原足以檢測(cè)血紅素的時(shí)間和條件下使所述樣品與所述色素原或其功能等同物接觸。
因此，本發(fā)明更具體地提供一種檢測(cè)胃腸樣品中血液存在的方法，所述方法包含步驟(i)將胃腸樣品施加至包含多個(gè)區(qū)的試驗(yàn)基質(zhì)的第一區(qū)；(ii)允許所述胃腸樣品流至所述試驗(yàn)基質(zhì)的第二區(qū)，其中，在足以形成珠蛋白-抗珠蛋白復(fù)合物的時(shí)間和條件下使所述樣品與抗珠蛋白免疫相互作用分子接觸，并檢測(cè)所述珠蛋白-抗珠蛋白復(fù)合物；和(iii)允許所述胃腸樣品流至所述試驗(yàn)基質(zhì)的第三區(qū)，其中，在色素原足以檢測(cè)血紅素的時(shí)間和條件下使所述樣品與所述色素原或其功能等同物接觸。
根據(jù)此優(yōu)選實(shí)施方案，本發(fā)明提供一種檢測(cè)胃腸樣品中血液存在的方法，所述方法包含步驟(i)將胃腸樣品施加至包含多個(gè)區(qū)的試驗(yàn)基質(zhì)的第一區(qū)；(ii)允許所述胃腸樣品流至所述試驗(yàn)基質(zhì)的第二區(qū)，其中，在足以形成珠蛋白-抗珠蛋白復(fù)合物的時(shí)間和條件下使所述樣品與抗珠蛋白抗體接觸，并檢測(cè)所述珠蛋白-抗珠蛋白復(fù)合物；和(iii)允許所述胃腸樣品流至所述試驗(yàn)基質(zhì)的第三區(qū)，其中，在色素原足以檢測(cè)血紅素的時(shí)間和條件下使所述樣品與所述色素原或其功能等同物接觸。
因此，本發(fā)明的另一方面指向一種檢測(cè)下胃腸道出血的方法，所述方法包含步驟(i)將大便樣品施加至包含多個(gè)區(qū)的試驗(yàn)基質(zhì)的第一區(qū)；(ii)允許所述大便樣品流至所述試驗(yàn)基質(zhì)的第二區(qū)，其中，在足以形成珠蛋白-抗珠蛋白復(fù)合物的時(shí)間和條件下使所述樣品與抗珠蛋白免疫相互作用分子接觸，并檢測(cè)所述珠蛋白-抗珠蛋白復(fù)合物；和(iii)允許所述大便樣品流至所述試驗(yàn)基質(zhì)的第三區(qū)，其中，在色素原足以檢測(cè)血紅素的時(shí)間和條件下使所述樣品與所述色素原或其功能等同物接觸；其中陽性血紅素結(jié)果加上陽性珠蛋白結(jié)果指示下胃腸道出血。
本發(fā)明的又一方面指向一種檢測(cè)上胃腸道出血的方法，所述方法包含步驟(i)將大便樣品施加至包含多個(gè)區(qū)的試驗(yàn)基質(zhì)的第一區(qū)；(ii)允許所述大便樣品流至所述試驗(yàn)基質(zhì)的第二區(qū)，其中，在足以形成珠蛋白-抗珠蛋白復(fù)合物的時(shí)間和條件下使所述樣品與抗珠蛋白免疫相互作用分子接觸，并檢測(cè)所述珠蛋白-抗珠蛋白復(fù)合物；和(iii)允許所述大便樣品流至所述試驗(yàn)基質(zhì)的第三區(qū)，其中，在色素原足以檢測(cè)血紅素的時(shí)間和條件下使所述樣品與所述色素原或其功能等同物接觸；其中陽性血紅素結(jié)果加上陰性珠蛋白結(jié)果指示上胃腸道出血。
本發(fā)明的再一方面指向一種診斷其癥狀包括出血的疾病的方法，所述方法包含步驟(i)將生物樣品施加至包含多個(gè)區(qū)的試驗(yàn)基質(zhì)的第一區(qū)；(ii)允許所述生物樣品流至所述試驗(yàn)基質(zhì)的第二區(qū)，其中，在足以形成珠蛋白-抗珠蛋白復(fù)合物的時(shí)間和條件下使所述樣品與抗珠蛋白免疫相互作用分子接觸，并檢測(cè)所述珠蛋白-抗珠蛋白復(fù)合物；和(iii)允許所述生物樣品流至所述試驗(yàn)基質(zhì)的第三區(qū)，其中，在色素原足以檢測(cè)血紅素的時(shí)間和條件下使所述樣品與所述色素原或其功能等同物接觸。
優(yōu)選地，本發(fā)明指向一種診斷直腸結(jié)腸癌的方法，所述方法包含步驟(i)將大便樣品施加至包含多個(gè)區(qū)的試驗(yàn)基質(zhì)的第一區(qū)；(ii)允許所述大便樣品流至所述試驗(yàn)基質(zhì)的第二區(qū)，其中，在足以形成珠蛋白-抗珠蛋白復(fù)合物的時(shí)間和條件下使所述樣品與抗珠蛋白免疫相互作用分子接觸，并檢測(cè)所述珠蛋白-抗珠蛋白復(fù)合物。(iii)允許所述大便樣品流至所述試驗(yàn)基質(zhì)的第三區(qū)，其中，在色素原足以檢測(cè)血紅素的時(shí)間和條件下使所述樣品與所述色素原或其功能等同物接觸；其中陽性血紅素結(jié)果加上陽性珠蛋白結(jié)果指示直腸結(jié)腸癌。
在另一方面，本發(fā)明提供一種檢測(cè)生物樣品中分析物存在的方法，所述方法包含步驟(i)將生物樣品施加至包含多個(gè)區(qū)的試驗(yàn)基質(zhì)的第一區(qū)；(ii)允許所述生物樣品流至所述試驗(yàn)基質(zhì)的第二區(qū)，其中，在足以形成分析物-抗分析物復(fù)合物的時(shí)間和條件下使所述樣品與抗分析物免疫相互作用分子接觸，固定所述復(fù)合物，并通過用抗分析物免疫相互作用結(jié)合物接觸所述分析物來檢測(cè)所述復(fù)合物；和(iii)允許未形成復(fù)合物的結(jié)合物流至所述試驗(yàn)基質(zhì)的第三區(qū)，其中，對(duì)未形成復(fù)合物的結(jié)合物進(jìn)行檢測(cè)。
在另一方面，本發(fā)明提供一種檢測(cè)生物樣品中分析物存在的方法。所述方法包含步驟(i)將生物樣品施加至包含多個(gè)區(qū)的試驗(yàn)基質(zhì)的第一區(qū)；(ii)允許所述生物樣品流至所述試驗(yàn)基質(zhì)的第二區(qū)，其中，在足以形成分析物-抗分析物復(fù)合物的時(shí)間和條件下，使所述樣品與抗分析物抗體接觸，固定所述復(fù)合物，并通過用抗分析物抗體結(jié)合物接觸所述分析物來檢測(cè)所述復(fù)合物；和(iii)允許未形成復(fù)合物的結(jié)合物流至所述試驗(yàn)基質(zhì)的第三區(qū)，其中，檢測(cè)未形成復(fù)合物的結(jié)合物。
因此，本發(fā)明更具體地提供一種檢測(cè)生物樣品中分析物存在的方法，所述方法包含步驟(i)將生物樣品施加至包含多個(gè)區(qū)的試驗(yàn)基質(zhì)的第一區(qū)；(ii)允許所述生物樣品流至所述試驗(yàn)基質(zhì)的第二區(qū)，其中，在足以形成分析物-抗分析物復(fù)合物的時(shí)間和條件下，使所述樣品與抗分析物免疫相互作用分子接觸，固定所述復(fù)合物，并通過用抗分析物免疫相互作用結(jié)合物接觸所述分析物來檢測(cè)所述復(fù)合物；和(iii)允許未形成復(fù)合物的結(jié)合物流至所述試驗(yàn)基質(zhì)的第三區(qū)，其中，對(duì)未形成復(fù)合物的結(jié)合物進(jìn)行檢測(cè)；其中將步驟(ii)中獲得的檢測(cè)結(jié)果參照步驟(iii)的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。
根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)更具體的方面，在將步驟(ii)的檢測(cè)結(jié)果參照步驟(iii)的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析時(shí)(a)在步驟(ii)與步驟(iii)中均為強(qiáng)陽性檢測(cè)結(jié)果指示高分析物濃度；(b)步驟(ii)的較弱陽性檢測(cè)結(jié)果，相對(duì)于步驟(iii)的較強(qiáng)陽性檢測(cè)，指示低分析物濃度；(c)步驟(ii)與步驟(iii)中均為弱陽性檢測(cè)結(jié)果指示很高的分析物濃度；以及(d)步驟(ii)和步驟(iii)中均無可檢測(cè)的結(jié)果指示極高的分析物濃度。
甚至更具體地，本發(fā)明提供一種檢測(cè)生物樣品中分析物存在的方法，所述方法包含步驟(i)將生物樣品施加至包含多個(gè)區(qū)的試驗(yàn)基質(zhì)的第一區(qū)；(ii)允許所述生物樣品流至所述試驗(yàn)基質(zhì)的第二區(qū)，其中，在足以形成分析物-抗分析物復(fù)合物的時(shí)間和條件下，使所述樣品與抗分析物免疫相互作用分子接觸，固定所述復(fù)合物，并通過用抗分析物免疫相互作用結(jié)合物接觸所述分析物來檢測(cè)所述復(fù)合物；和(iii)允許未形成復(fù)合物的結(jié)合物流至所述試驗(yàn)基質(zhì)的第三區(qū)，其中，在足以形成分析物-結(jié)合物復(fù)合物的時(shí)間和條件下，使所述未形成復(fù)合物的結(jié)合物與固定在所述第三區(qū)的所述分析物接觸，并檢測(cè)所述復(fù)合物；其中將步驟(ii)的檢測(cè)結(jié)果參照步驟(iii)的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。
在又一方面，本發(fā)明提供一種檢測(cè)生物樣品中血液存在的方法，所述方法包含步驟(i)將生物樣品施加至包含多個(gè)區(qū)的試驗(yàn)基質(zhì)的第一區(qū)；(ii)允許所述生物樣品流至所述試驗(yàn)基質(zhì)的第二區(qū)，其中，在可以形成血紅蛋白-抗血紅蛋白復(fù)合物的時(shí)間和條件下，使所述樣品與抗血紅蛋白抗體接觸，固定所述復(fù)合物，并通過用抗血紅蛋白結(jié)合物接觸所述血紅蛋白來檢測(cè)所述復(fù)合物；和(iii)允許未形成復(fù)合物的結(jié)合物流至所述試驗(yàn)基質(zhì)的第三區(qū)，其中，在足以形成血紅蛋白-結(jié)合物復(fù)合物的時(shí)間和條件下，使所述未形成復(fù)合物的結(jié)合物與固定在所述第三區(qū)的所述血紅蛋白接觸，并檢測(cè)所述復(fù)合物；其中將步驟(ii)的檢測(cè)結(jié)果參照步驟(iii)的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。
本發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明部分地基于既篩檢血紅蛋白的珠蛋白成分又篩檢血紅蛋白的血紅素成分的血液篩檢方法的開發(fā)。通過珠蛋白的免疫學(xué)檢測(cè)與血紅素的非免疫學(xué)檢測(cè)的結(jié)合，使由于前帶現(xiàn)象產(chǎn)生的假陰性結(jié)果的發(fā)生率減少到最小。針對(duì)檢測(cè)血紅蛋白的血紅素成分和珠蛋白成分的兩步檢測(cè)法也允許區(qū)分上胃腸道出血和下胃腸道出血。而且本發(fā)明開發(fā)了一種基于免疫學(xué)的篩檢法，該方法克服了因分析物高濃度產(chǎn)生前帶現(xiàn)象時(shí)可獲得的分析時(shí)使人誤導(dǎo)的試驗(yàn)結(jié)果。
因此，本發(fā)明提供一種檢測(cè)生物樣品中血液存在的方法，所述方法包含步驟(i)將生物樣品施加至包含第一、第二和第三區(qū)的試驗(yàn)基質(zhì)的第一區(qū)；(ii)允許所述生物樣品流至所述試驗(yàn)基質(zhì)的第二區(qū)，其中，在足以形成珠蛋白-抗珠蛋白復(fù)合物的時(shí)間和條件下，使所述樣品與抗珠蛋白免疫相互作用分子接觸，并檢測(cè)所述珠蛋白-抗珠蛋白復(fù)合物；和(iii)允許所述生物樣品流至所述試驗(yàn)基質(zhì)的第三區(qū)，其中，在色素原足以檢測(cè)血紅素的時(shí)間和條件下，使所述樣品與所述色素原或其功能等同物接觸。
“色素原”應(yīng)理解為是指任何可與氧反應(yīng)產(chǎn)生顏色改變的色素原。適用于本發(fā)明的色素原包括但不限于愈創(chuàng)木脂、四甲基聯(lián)苯胺、正聯(lián)甲苯胺或它們的功能等同物。優(yōu)選地，所述色素原是愈創(chuàng)木脂。
所以，本發(fā)明更具體地提供一種檢測(cè)生物樣品中血液存在的方法，所述方法包含步驟(i)將生物樣品施加至包含第一、第二和第三區(qū)的試驗(yàn)基質(zhì)的第一區(qū)；(ii)允許所述生物樣品流至所述試驗(yàn)基質(zhì)的第二區(qū)，其中，在足以形成珠蛋白-抗珠蛋白復(fù)合物的時(shí)間和條件下，使所述樣品與抗珠蛋白免疫相互作用分子接觸，并檢測(cè)所述珠蛋白-抗珠蛋白復(fù)合物；和(iii)允許所述生物樣品流至所述試驗(yàn)基質(zhì)的第三區(qū)，其中，在愈創(chuàng)木脂足以檢測(cè)血紅素的時(shí)間和條件下，使所述樣品與所述愈創(chuàng)木脂或其功能等同物接觸。
“生物樣品”應(yīng)理解為是指來自動(dòng)物的任何生物材料樣品，例如但不限于粘液、糞便、尿、活檢標(biāo)本和導(dǎo)入動(dòng)物體內(nèi)再取出的液體，如肺灌洗后從肺中抽出的鹽溶液或從灌腸沖洗回收的溶液。根據(jù)本發(fā)明方法進(jìn)行試驗(yàn)的生物樣品可以直接進(jìn)行試驗(yàn)，或可以在試驗(yàn)前需要某種形式的處理。例如，活檢樣品可能需在試驗(yàn)前進(jìn)行勻漿。而且，如果生物樣品并非液體形式，(如它可以是固體、半固體、或脫水液體樣品)，它可能需要加入試劑如緩沖液，來賦予樣品流動(dòng)性。該流動(dòng)化(mobilising)試劑可以在樣品施加至試驗(yàn)基質(zhì)上之前與該生物樣品混合，或可以在生物樣品施加至試驗(yàn)基質(zhì)上之后將該試劑加至該樣品上。為了利于樣品沿試驗(yàn)基質(zhì)流動(dòng)(通過毛細(xì)作用移動(dòng))，使用流動(dòng)化試劑是必需的。優(yōu)選地，生物樣品為胃腸樣品。“胃腸樣品”是指任何來源于胃腸道的樣品，如糞便、粘液(如來自直腸粘液拭子的粘液)、灌腸沖洗液或胃腸道活檢樣品。
本文所用術(shù)語“動(dòng)物”包括人、靈長類、家畜(如羊、豬、牛、馬、驢)、實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(如小鼠、大鼠、兔、豚鼠)、陪伴動(dòng)物(companionanimal)(如狗、貓)、捕獲的野生動(dòng)物(如狐、袋鼠、鹿)、鳥類(如雞、鴨、鵝、鴯鹋、駝鳥)爬行動(dòng)物或魚類。
因此，本發(fā)明更具體地提供一種檢測(cè)胃腸樣品中血液存在的方法，所述方法包含步驟(i)將胃腸樣品施加至包含第一、第二和第三區(qū)的試驗(yàn)基質(zhì)的第一區(qū)；(ii)允許所述胃腸樣品流至所述試驗(yàn)基質(zhì)的第二區(qū)，其中，在足以形成珠蛋白-抗珠蛋白復(fù)合物的時(shí)間和條件下，使所述樣品與抗珠蛋白免疫相互作用分子接觸，并檢測(cè)所述珠蛋白-抗珠蛋白復(fù)合物；和(iii)允許所述胃腸樣品流至所述試驗(yàn)基質(zhì)的第三區(qū)，其中，在色素原足以檢測(cè)血紅素的時(shí)間和條件下，使所述樣品與所述色素原或其功能等同物接觸。
優(yōu)選地，所述色素原是愈創(chuàng)木脂或其功能等同物。
“試驗(yàn)基質(zhì)”是指適用于相繼地使用免疫學(xué)方法檢測(cè)生物樣品是否存在血紅蛋白的珠蛋白成分，和使用色素原或其功能等同物檢測(cè)該生物樣品是否存在血紅蛋白的血紅素成分的任何裝置。在一個(gè)尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述試驗(yàn)基質(zhì)是包含接受生物樣品的第一區(qū)和含有兩個(gè)部分的第二區(qū)的層析試驗(yàn)條。第二區(qū)的第一部分是一個(gè)與膠體金顆粒偶聯(lián)的固定化抗珠蛋白抗體區(qū)域，所述抗體可被流過的液體前沿重新懸浮，而第二區(qū)的第二部分是固定的抗珠蛋白捕獲抗體區(qū)域。第三區(qū)包括一個(gè)浸透愈創(chuàng)木脂的吸收墊?；蛘撸谌齾^(qū)也可由層疊于第二區(qū)上的浸透愈創(chuàng)木脂的紙帶構(gòu)成。應(yīng)該理解，本發(fā)明詳述的這三個(gè)區(qū)可以順序放置，也可按其它方式放置，如疊置。例如，第一區(qū)和第二區(qū)可以合并，以使樣品可以直接進(jìn)入第二區(qū)。本發(fā)明試驗(yàn)基質(zhì)也可以包含另外的區(qū)。例如，本發(fā)明設(shè)想了在第三區(qū)后含有一個(gè)吸收墊的層析條帶的應(yīng)用。
本發(fā)明不限于任何一個(gè)理論或行為模式，依據(jù)發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方面，施加至第一區(qū)的生物樣品通過毛細(xì)作用(wick)從第一區(qū)流至第二區(qū)，然后按相繼的兩步驟方法進(jìn)行珠蛋白和血紅素的檢測(cè)。在第二區(qū)，存在于樣品中的血紅蛋白的珠蛋白成份與偶聯(lián)了膠體金顆粒的抗珠蛋白抗體相結(jié)合。流過的生物樣品前沿重新懸浮這些抗體，并且珠蛋白-抗珠蛋白復(fù)合物和游離的抗珠蛋白抗體均通過毛細(xì)作用由第二區(qū)的第一部分流至第二部分。在第二部分，存在于樣品中的任何血紅蛋白的珠蛋白成份與固定的抗珠蛋白捕獲抗體結(jié)合，而偶聯(lián)了膠體金的游離抗珠蛋白抗體、生物樣品中的非珠蛋白成分和任何未與第二區(qū)的抗珠蛋白抗體結(jié)合的多余珠蛋白繼續(xù)通過毛細(xì)作用進(jìn)入第三區(qū)。在第三區(qū)，未被第二區(qū)捕獲的任何血紅蛋白的血紅素成分與顯色液反應(yīng)，導(dǎo)致氧的釋放，該氧與色素原如愈創(chuàng)木脂反應(yīng)，結(jié)果發(fā)生顏色改變。
如果生物樣品含有高濃度血，并因此含有高濃度血紅蛋白，則由于前帶現(xiàn)象，在試驗(yàn)基質(zhì)的第二區(qū)可能得到假陰性結(jié)果。然而，在這種情況下，以非免疫學(xué)的色素原反應(yīng)為基礎(chǔ)檢測(cè)血紅蛋白的血紅素成分的試驗(yàn)基質(zhì)第三區(qū)仍產(chǎn)生陽性結(jié)果。因此，非免疫學(xué)的色素原試驗(yàn)與免疫學(xué)的珠蛋白試驗(yàn)的聯(lián)合使用，提供了防止當(dāng)樣品中存在高濃度血時(shí)由于前帶現(xiàn)象而得到假陰性結(jié)果的安全保障。
本發(fā)明的方法需要在試驗(yàn)開始前將紅細(xì)胞的血紅蛋白暴露出來。這可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的許多方法中的任一種來實(shí)現(xiàn)。例如，在試驗(yàn)開始前用紅細(xì)胞裂解液接觸生物樣品將達(dá)到這一目的。在試驗(yàn)開始前或在生物樣品通過毛細(xì)作用進(jìn)入第三區(qū)前的某個(gè)時(shí)間點(diǎn)，分開血紅蛋白的珠蛋白和血紅素成份也屬于本發(fā)明的范疇。這樣可以使由于和珠蛋白成分結(jié)合而導(dǎo)致血紅素被抗珠蛋白捕獲抗體捕獲的可能性達(dá)到最小。
“免疫相互作用分子”應(yīng)理解為是指任何含有抗原結(jié)合部位的分子或所述分子的衍生物。本發(fā)明這方面考慮的分子的例子包括，但不限于，單克隆和多克隆抗體(包括合成抗體，雜合抗體，人源化抗體，催化性抗體)，以及T細(xì)胞抗原結(jié)合分子。優(yōu)選地，所述免疫相互作用分子是抗體。
根據(jù)該優(yōu)選實(shí)施方案，本發(fā)明提供一種檢測(cè)胃腸樣品中血液存在的方法，所述方法包含步驟(i)將胃腸樣品施加至包含第一、第二和第三區(qū)的試驗(yàn)基質(zhì)的第一區(qū)；(ii)允許所述胃腸樣品流至所述試驗(yàn)基質(zhì)的第二區(qū)，其中，在足以形成珠蛋白-抗珠蛋白復(fù)合物的時(shí)間和條件下，使所述樣品與抗珠蛋白抗體接觸，并檢測(cè)所述珠蛋白-抗珠蛋白復(fù)合物；和(iii)允許所述胃腸樣品流至所述試驗(yàn)基質(zhì)的第三區(qū)，其中，在色素原足以檢測(cè)血紅素的時(shí)間和條件下，使所述樣品與所述色素原或其功能等同物接觸。
更優(yōu)選地，所述生物樣品是大便樣品。甚至更優(yōu)選地，所述色素原是愈創(chuàng)木脂或其功能等同物。
“功能等同物”應(yīng)當(dāng)被理解為是指來自天然、合成或重組來源的顯示色素原活性的片段、部分、突變體、同系物、模擬物，也包括融合蛋白。衍生物可以由氨基酸的插入、缺失或替換衍生獲得。氨基酸插入型衍生物包括單個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基和/或羧基末端融合和序列內(nèi)插入。插入型氨基酸順序變體是指其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被引入蛋白預(yù)定位點(diǎn)的氨基酸序列變體，當(dāng)然通過對(duì)所獲產(chǎn)物的適當(dāng)篩選，隨機(jī)插入也是可能的。缺失型變體的特征在于從序列中去除了一個(gè)或多個(gè)氨基酸。替換型氨基酸變體是指序列中的一個(gè)殘基被去除，并在其位置插入一個(gè)不同的殘基的變體。氨基酸序列的增加包括與其它肽、多肽或蛋白的融合。
本文所用術(shù)語“功能等同物”還應(yīng)理解為包括表現(xiàn)色素原的任何一個(gè)或多個(gè)功能活性的分子，如從天然產(chǎn)物篩選得到的產(chǎn)物。
對(duì)于生物樣品，“使之接觸”免疫相互作用分子或色素原應(yīng)被理解為是指任何利于該生物樣品的任意一個(gè)或多個(gè)成分與色素原或免疫相互作用分子相互作用的方法，該方法將導(dǎo)致該生物樣品的一個(gè)或多個(gè)成分與免疫相互作用分子間形成偶聯(lián)、結(jié)合、或其它連接，或?qū)е律婕霸撋飿悠返囊粋€(gè)或多個(gè)成分的化學(xué)反應(yīng)以致可以發(fā)生色素原的顏色改變(如生物樣品的一個(gè)或多個(gè)成分與顯色液反應(yīng)，引起氧的釋放，釋放的氧與色素原反應(yīng)，產(chǎn)生顏色改變)。例如，可將生物樣品加至第二區(qū)浸潤有免疫相互作用分子而第三區(qū)浸潤有色素原的層析條上。在本例中，生物樣品通過毛細(xì)作用沿層析條達(dá)到浸潤區(qū)的運(yùn)動(dòng)使樣品接觸到免疫相互作用分子或色素原?；蛘撸蓪⑸飿悠芳佑趯游鰲l上，而免疫相互作用分子或色素原可以在試驗(yàn)期間例如與生物樣品加樣的同時(shí)或在生物樣品加樣之后相繼地加至試驗(yàn)條上?！笆怪佑|”的范疇也包括如下組合，其中，在試驗(yàn)條中浸潤一個(gè)或多個(gè)免疫相互作用分子、檢測(cè)試劑、色素原或其顯色劑，而其它試劑在試驗(yàn)時(shí)加至試驗(yàn)條上。
可以通過任何本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的方便方法“檢測(cè)”珠蛋白-抗珠蛋白復(fù)合物的形成或色素原與血紅素之間的化學(xué)反應(yīng)。在本文例舉的本發(fā)明方法中，被通過毛細(xì)作用運(yùn)動(dòng)的生物樣品前沿重新懸浮的抗珠蛋白抗體與膠體金形成復(fù)合物。當(dāng)珠蛋白-抗珠蛋白抗體/膠體金復(fù)合物被層析條第二區(qū)第二部分中浸潤的抗珠蛋白捕獲抗體捕獲時(shí)，由于在復(fù)合物的捕獲期間膠體金濃度在該位點(diǎn)的增加，膠體金呈現(xiàn)為可見的粉紅色條帶?；蛘撸梢詫?duì)抗珠蛋白抗體進(jìn)行放射性標(biāo)記，或進(jìn)行酶學(xué)標(biāo)記，使得當(dāng)加入底物時(shí)，如果存在珠蛋白則可觀察到顏色改變。色素原對(duì)血紅素的檢測(cè)優(yōu)選通過加入顯色劑例如與血紅素反應(yīng)產(chǎn)生氧和水的過氧化物來實(shí)現(xiàn)。然后，釋放的氧與色素原反應(yīng)產(chǎn)生顏色變化。例如，愈創(chuàng)木脂與氧反應(yīng)產(chǎn)生藍(lán)色。色素原可以和顯色劑一起在第三區(qū)并入試驗(yàn)基質(zhì)，或者顯色劑可以在較后階段作為液體試劑加入。如果顯色劑與色素原被干燥固定在試驗(yàn)基質(zhì)中，一旦遇到水中的血紅蛋白，該試紙將變藍(lán)?；蛘呖梢允褂媚軝z測(cè)血紅素與色素原或其功能等同物之間反應(yīng)性的一些其它類型的報(bào)告分子。
在一個(gè)優(yōu)選方面，本發(fā)明用于通過分析大便樣品中血的存在來診斷胃腸道出血。并非將本發(fā)明限于任何一個(gè)理論或行為模式，由于色素原試驗(yàn)檢測(cè)血紅蛋白的血紅素成分而血紅素相對(duì)不易在小腸(上胃腸道)降解，所以色素原試驗(yàn)將陽性地鑒定胃腸道任一處出血(即胃腸道的上部和下部區(qū)域)。然而，血紅蛋白中的珠蛋白成分不能通過上胃腸道而存活。因此，大便樣品的陽性珠蛋白結(jié)果指示出血發(fā)生在下胃腸道。所以，通過使用組合的基于免疫學(xué)與非免疫學(xué)的兩步檢測(cè)，可以區(qū)分上下胃腸道出血，其中陽性血紅素結(jié)果與陰性珠蛋白結(jié)果指示上胃腸道出血，而陽性血紅素結(jié)果與陽性珠蛋白結(jié)果指示下胃腸道出血。這對(duì)例如癥狀包括下胃腸道出血的直腸結(jié)腸癌的診斷特別重要。
因此，本發(fā)明的另一方面指向一種檢測(cè)下胃腸道出血的方法，所述方法包含步驟(i)將大便樣品施加至包含第一、二和三區(qū)的試驗(yàn)基質(zhì)的第一區(qū)；(ii)允許所述大便樣品流至所述試驗(yàn)基質(zhì)的第二區(qū)，其中，在足以形成珠蛋白-抗珠蛋白復(fù)合物的時(shí)間和條件下，使所述樣品與抗珠蛋白免疫相互作用分子接觸，并檢測(cè)所述珠蛋白-抗珠蛋白復(fù)合物；和(iii)允許所述大便樣品流至所述試驗(yàn)基質(zhì)的第三區(qū)，其中，在色素原足以檢測(cè)血紅素的時(shí)間和條件下，使所述樣品與所述色素原或其功能等同物接觸；其中，陽性血紅素結(jié)果加上陽性珠蛋白結(jié)果指示下胃腸道出血。
優(yōu)選地，所述色素原是愈創(chuàng)木脂或其功能等同物。
本發(fā)明的另一方面指向一種檢測(cè)上胃腸道出血的方法，所述方法包含步驟(i)將大便樣品施加至包含第一、二和三區(qū)的試驗(yàn)基質(zhì)的第一區(qū)；(ii)允許所述大便樣品流至所述試驗(yàn)基質(zhì)的第二區(qū)，其中，在足以形成珠蛋白-抗珠蛋白復(fù)合物的時(shí)間和條件下，使所述樣品與抗珠蛋白免疫相互作用分子接觸，并檢測(cè)所述珠蛋白-抗珠蛋白復(fù)合物；和(iii)允許所述大便樣品流至所述試驗(yàn)基質(zhì)的第三區(qū)，其中，在色素原足以檢測(cè)血紅素的時(shí)間和條件下，使所述樣品與所述色素原或其功能等同物接觸；其中，陽性血紅素結(jié)果加上陰性珠蛋白結(jié)果指示上胃腸道出血。
優(yōu)選地，所述色素原是愈創(chuàng)木脂或其功能等同物。
本發(fā)明的又一方面指向一種診斷癥狀包括出血的疾病的方法，所述方法包含步驟(i)將生物樣品施加至包含第一、二和三區(qū)的試驗(yàn)基質(zhì)的第一區(qū)；(ii)允許所述生物樣品流至所述試驗(yàn)基質(zhì)的第二區(qū)，其中，在足以形成珠蛋白-抗珠蛋白復(fù)合物的時(shí)間和條件下使所述樣品與抗珠蛋白免疫相互作用分子接觸，并檢測(cè)所述珠蛋白-抗珠蛋白復(fù)合物；和(iii)允許所述生物樣品流至所述試驗(yàn)基質(zhì)的第三區(qū)，其中，在色素原足以檢測(cè)血紅素的時(shí)間和條件下使所述樣品與所述色素原或其功能等同物接觸。
優(yōu)選地，本發(fā)明指向一種診斷直腸結(jié)腸癌的方法，所述方法包含步驟(i)將大便樣品施加至包含第一、二和三區(qū)的試驗(yàn)基質(zhì)的第一區(qū)；(ii)允許所述大便樣品流至所述試驗(yàn)基質(zhì)的第二區(qū)，其中，在足以形成珠蛋白-抗珠蛋白復(fù)合物的時(shí)間和條件下，使所述樣品與抗珠蛋白免疫相互作用分子接觸，并檢測(cè)所述珠蛋白-抗珠蛋白復(fù)合物；和(iii)允許所述大便樣品流至所述試驗(yàn)基質(zhì)的第三區(qū)，其中，在色素原足以檢測(cè)血紅素的時(shí)間和條件下，使所述樣品與所述色素原或其功能等同物接觸；其中陽性血紅素結(jié)果加上陽性珠蛋白結(jié)果指示直腸結(jié)腸癌。
優(yōu)選地，所述色素原是愈創(chuàng)木脂或其功能等同物。
本發(fā)明人還出乎意料地確定，通過在篩檢目標(biāo)分析物之外篩檢未結(jié)合的結(jié)合物的存在，可以在使用免疫學(xué)篩檢技術(shù)時(shí)克服前帶現(xiàn)象效應(yīng)。本發(fā)明不限于任何一個(gè)理論或行為模式，當(dāng)用免疫學(xué)試驗(yàn)篩檢來檢測(cè)分析物的存在時(shí)，(該方法依賴于最終提供檢測(cè)手段的固定免疫相互作用分子和標(biāo)記免疫相互作用分子結(jié)合物對(duì)目標(biāo)分析物的捕獲)，通過相對(duì)于分析物試驗(yàn)結(jié)果分析未結(jié)合檢測(cè)分子的水平，可以正確地解釋由于前帶效應(yīng)經(jīng)常產(chǎn)生的而且通常是使人誤導(dǎo)的試驗(yàn)結(jié)果。
因此，在另一方面，本發(fā)明提供一種檢測(cè)生物樣品中分析物存在的方法，所述方法包含步驟(i)將生物樣品施加至包含多個(gè)區(qū)的試驗(yàn)基質(zhì)的第一區(qū)；(ii)允許所述生物樣品流至所述試驗(yàn)基質(zhì)的第二區(qū)，其中，在足以形成分析物-抗分析物復(fù)合物的時(shí)間和條件下使所述樣品與抗分析物免疫相互作用分子接觸，固定所述復(fù)合物，并通過用抗分析物免疫相互作用結(jié)合物接觸所述分析物來檢測(cè)所述復(fù)合物；(iii)允許未形成復(fù)合物的結(jié)合物流至所述試驗(yàn)基質(zhì)的第三區(qū)，其中對(duì)未形成復(fù)合物的結(jié)合物進(jìn)行檢測(cè)。
應(yīng)當(dāng)理解，術(shù)語“生物樣品”，“試驗(yàn)基質(zhì)”，“免疫相互作用分子”，“檢測(cè)”和短語“使接觸”具有與前述定義相同的含義?！翱狗治鑫锩庖呦嗷プ饔梅肿印睉?yīng)理解為是指任何能與目標(biāo)分析物相互作用形成復(fù)合物的分子。優(yōu)選地，所述免疫相互作用分子是抗體。在這一點(diǎn)上，“抗分析物免疫相互作用結(jié)合物”應(yīng)理解為是指任何能與目標(biāo)分析物反應(yīng)，并且直接或間接地有利于檢測(cè)上面步驟(ii)中所描述的形成復(fù)合物的固定分析物的分子。優(yōu)選地，結(jié)合物以抗原特異的方式與目標(biāo)分析物相互作用?！皺z測(cè)”與上文中所定義的意義相同。例如，如果實(shí)現(xiàn)對(duì)分析物復(fù)合物的觀察需要一個(gè)附加步驟，則結(jié)合物“間接地”起作用。例如，若結(jié)合物包含酶學(xué)標(biāo)記的抗體，則為得到視覺可檢測(cè)的顏色變化，必須加入底物。如果不需加入附加步驟即可實(shí)現(xiàn)觀察，則結(jié)合物“直接地”起作用。例如，當(dāng)主題結(jié)合物是偶聯(lián)膠體金的抗體時(shí)，在結(jié)合物的捕獲過程中由于濃度的增加，膠體金將呈現(xiàn)為可見的粉紅色條帶。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種檢測(cè)生物樣品中分析物存在的方法，所述方法包含步驟(i)將生物樣品施加至包含多個(gè)區(qū)的試驗(yàn)基質(zhì)的第一區(qū)；(ii)允許所述生物樣品流至所述試驗(yàn)基質(zhì)的第二區(qū)，其中，在足以形成分析物-抗分析物復(fù)合物的時(shí)間和條件下，使所述樣品與抗分析物抗體接觸，固定所述復(fù)合物，并通過用抗分析物抗體結(jié)合物接觸所述分析物來檢測(cè)所述復(fù)合物；和(iii)允許未形成復(fù)合物的結(jié)合物流至所述試驗(yàn)基質(zhì)的第三區(qū)，其中對(duì)未形成復(fù)合物的結(jié)合物進(jìn)行檢測(cè)。
可用任何適當(dāng)?shù)募夹g(shù)檢測(cè)未形成復(fù)合物的免疫球蛋白結(jié)合物。例如，可以通過非特異方式，如通過可捕獲主題結(jié)合物的固定抗免疫球蛋白抗體來檢測(cè)結(jié)合物?；蚩梢酝ㄟ^特異的方式如通過抗體結(jié)合物特異指向的固定抗原區(qū)域來檢測(cè)結(jié)合物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，用抗原特異性方法檢測(cè)結(jié)合物，從而利于選擇性地包括一個(gè)對(duì)照試驗(yàn)以確認(rèn)結(jié)合物沿試驗(yàn)基質(zhì)實(shí)際發(fā)生了通過毛細(xì)作用的運(yùn)動(dòng)。所以一個(gè)典型的對(duì)照試驗(yàn)采取可捕獲小部分免疫球蛋白結(jié)合物的固定抗免疫球蛋白抗體區(qū)域的形式。根據(jù)該實(shí)施方案，未形成復(fù)合物的結(jié)合物的檢測(cè)通過該結(jié)合物特異指向的固定化抗原區(qū)域以免疫學(xué)特異的方式來實(shí)現(xiàn)?？乖瓋?yōu)選是目標(biāo)分析物。
固定目標(biāo)分析物和檢測(cè)所述分析物的步驟可以以任何適當(dāng)方式進(jìn)行。例如，這些步驟可以依次或同時(shí)進(jìn)行。在一個(gè)優(yōu)選方面中，將生物樣品加在層析條的加樣區(qū)，在此所述樣品與膠體金標(biāo)記的抗分析物抗體結(jié)合物發(fā)生接觸。在結(jié)合物與生物樣品中存在的任何分析物形成復(fù)合物之后，生物樣品與任何未結(jié)合的結(jié)合物一道，被允許通過毛細(xì)作用沿層析條流至第二區(qū)，在該區(qū)域中，樣品與固定的抗分析物抗體接觸。生物樣品中存在的任何分析物將與固定的抗分析物抗體形成復(fù)合物。由于先前分析物已與膠體金結(jié)合物形成復(fù)合物，隨著標(biāo)記抗體被固定在試驗(yàn)區(qū)和其濃度的增加，將呈現(xiàn)出顏色逐漸加深的粉紅色條帶。任何多余的未結(jié)合的結(jié)合物與未結(jié)合的生物樣品成分一道，將繼續(xù)通過毛細(xì)作用流至所述試驗(yàn)基質(zhì)的第三區(qū)。試驗(yàn)基質(zhì)的第三區(qū)包含將與任何未結(jié)合抗分析物結(jié)合物形成復(fù)合物的固定分析物。
通過比較第二區(qū)分析物試驗(yàn)結(jié)果和第三區(qū)結(jié)合物試驗(yàn)結(jié)果的相對(duì)強(qiáng)度，可以比以前已有方法更肯定地確定主題生物樣品中是否存在目標(biāo)分析物。由于該技術(shù)有利于正確解釋第二區(qū)的分析物結(jié)果是否受到前帶現(xiàn)象的影響，所以這些結(jié)果也提供了生物樣品中存在的分析物濃度的一個(gè)大致指示。例如，當(dāng)目標(biāo)分析物是血紅蛋白時(shí)，不含任何血紅蛋白的生物樣品將在第二區(qū)產(chǎn)生一個(gè)陰性結(jié)果，在第三區(qū)產(chǎn)生一個(gè)強(qiáng)陽性結(jié)果，在第三區(qū)所有存在的結(jié)合物最終與固定的血紅蛋白形成復(fù)合物。當(dāng)試驗(yàn)樣品中存在低濃度的血紅蛋白時(shí)，由于樣品中最初存在的低水平血紅蛋白只與試驗(yàn)可用的全部結(jié)合物的小部分形成復(fù)合物，所以第二區(qū)預(yù)期將產(chǎn)生弱陽性結(jié)果，而在第三區(qū)將檢測(cè)到強(qiáng)信號(hào)。當(dāng)存在高濃度的血紅蛋白時(shí)，前帶現(xiàn)象將導(dǎo)致在第二區(qū)檢測(cè)到弱信號(hào)，同時(shí)第三區(qū)也存在弱信號(hào)，因?yàn)闃O度消耗的結(jié)合物濃度在第三區(qū)被固定下來。當(dāng)存在極高濃度的血紅蛋白時(shí)，由于缺乏游離的未結(jié)合結(jié)合物和仍然過量的未結(jié)合血紅蛋白濃度，預(yù)期在第二區(qū)和第三區(qū)均檢測(cè)不到信號(hào)。
在這點(diǎn)上，應(yīng)當(dāng)理解，通過步驟(ii)和(iii)得到的“強(qiáng)”或“弱”檢測(cè)結(jié)果被表征為相互比較分析時(shí)的強(qiáng)或弱性質(zhì)。盡管客觀分析決不排除在本發(fā)明的范圍之外，但這些結(jié)果沒有必要相對(duì)一個(gè)客觀標(biāo)準(zhǔn)來分析。檢測(cè)結(jié)果可以通過任意合適方法評(píng)價(jià)。例如，結(jié)合物被設(shè)計(jì)產(chǎn)生顏色變化時(shí)，顏色變化的出現(xiàn)可以通過肉眼觀察或儀器讀取來評(píng)價(jià)。取決于被固定的結(jié)合物的濃度，這種顏色改變可弱可強(qiáng)，并分別相應(yīng)于弱或強(qiáng)的結(jié)果。一旦觀察到檢測(cè)結(jié)果，分析步驟(ii)獲得的結(jié)果相對(duì)于步驟(iii)的結(jié)果的強(qiáng)度，將按分析物處于低、高或很高水平的方式指示生物樣品中存在的分析物的濃度。
因此，本發(fā)明更具體地提供一種檢測(cè)生物樣品中分析物存在的方法，所述方法包含步驟(i)將生物樣品施加至包含多個(gè)區(qū)的試驗(yàn)基質(zhì)的第一區(qū)；(ii)允許所述生物樣品流至所述試驗(yàn)基質(zhì)的第二區(qū)，其中，在足以形成分析物-抗分析物復(fù)合物的時(shí)間和條件下，使所述樣品與抗分析物免疫相互作用分子接觸，固定所述復(fù)合物，并通過用抗分析物免疫相互作用結(jié)合物接觸所述分析物來檢測(cè)所述復(fù)合物；和(iii)允許未形成復(fù)合物的結(jié)合物流至所述試驗(yàn)基質(zhì)的第三區(qū)，其中對(duì)未形成復(fù)合物的結(jié)合物進(jìn)行檢測(cè)；其中，將步驟(ii)的檢測(cè)結(jié)果相對(duì)于步驟(iii)的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。
根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)更為具體的方面，在將步驟(ii)的結(jié)果參照步驟(iii)的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析時(shí)(a)步驟(ii)與步驟(iii)均為強(qiáng)陽性檢測(cè)結(jié)果指示高分析物濃度；(b)相對(duì)于步驟(iii)的較強(qiáng)陽性檢測(cè)結(jié)果，步驟(ii)為較弱陽性檢測(cè)結(jié)果，指示低分析物濃度；(c)步驟(ii)與步驟(iii)均為弱陽性檢測(cè)結(jié)果指示很高的分析物濃度；和(d)步驟(ii)和步驟(iii)中均無可檢測(cè)的結(jié)果指示極高的分析物濃度。
應(yīng)當(dāng)理解，當(dāng)步驟(ii)的檢測(cè)結(jié)果和步驟(iii)的檢測(cè)結(jié)果相當(dāng)時(shí)，對(duì)于該結(jié)果是強(qiáng)陽性還是弱陽性的評(píng)價(jià)可以相對(duì)于一個(gè)客觀標(biāo)準(zhǔn)來分析，也可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員依靠其擁有的技術(shù)知識(shí)和經(jīng)驗(yàn)以主觀的方式來評(píng)估。當(dāng)用儀器分析檢測(cè)結(jié)果時(shí)，可以精確定量生物樣品中存在的分析物濃度。當(dāng)用較不精確的方法(如通過人的肉眼)分析檢測(cè)結(jié)果時(shí)，盡管不能得到精確的定量值，除了克服前帶現(xiàn)象造成的令人誤解的結(jié)果外，所獲結(jié)果仍大致指示了分析物是以低、高還是很高的水平存在。例如，當(dāng)患者出現(xiàn)腸癌癥狀時(shí)，獲得患者是輕微還是嚴(yán)重出血的大范圍指示，有助于決定進(jìn)一步的檢查和/或治療。
甚至更具體地，本發(fā)明提供一種檢測(cè)生物樣品中分析物存在的方法，所述方法包含步驟(i)將生物樣品施加至包含多個(gè)區(qū)的試驗(yàn)基質(zhì)的第一區(qū)；(ii)允許所述生物樣品流至所述試驗(yàn)基質(zhì)的第二區(qū)，其中，在足以形成分析物-抗分析物復(fù)合物的時(shí)間和條件下使所述樣品與抗分析物免疫相互作用分子接觸，固定所述復(fù)合物，并通過用抗分析物免疫相互作用結(jié)合物接觸所述分析物來檢測(cè)所述復(fù)合物；和(iii)允許未形成復(fù)合物的結(jié)合物流至所述試驗(yàn)基質(zhì)的第三區(qū)，其中，在足以形成分析物-結(jié)合物復(fù)合物的時(shí)間和條件下，使未形成復(fù)合物的結(jié)合物與固定于所述第三區(qū)的所述分析物接觸，并檢測(cè)所述復(fù)合物；其中將步驟(ii)的檢測(cè)結(jié)果相對(duì)于步驟(iii)的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種檢測(cè)生物樣品中血液存在的方法，所述方法包含步驟(i)將生物樣品施加至包含多個(gè)區(qū)的試驗(yàn)基質(zhì)的第一區(qū)；(ii)允許所述生物樣品流至所述試驗(yàn)基質(zhì)的第二區(qū)，其中，在可以形成血紅蛋白-抗血紅蛋白復(fù)合物的時(shí)間和條件下使所述樣品與抗血紅蛋白抗體接觸，固定所述復(fù)合物，并通過用抗血紅蛋白結(jié)合物接觸所述血紅蛋白來檢測(cè)所述復(fù)合物；和(iii)允許未形成復(fù)合物的結(jié)合物流至所述試驗(yàn)基質(zhì)的第三區(qū)，其中，在足以形成血紅蛋白-結(jié)合物復(fù)合物的時(shí)間和條件下，使未形成復(fù)合物的結(jié)合物與固定在所述第三區(qū)的所述血紅蛋白接觸，并檢測(cè)所述復(fù)合物；其中將步驟(ii)的檢測(cè)結(jié)果相對(duì)于步驟(iii)的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。
用以檢測(cè)未結(jié)合的結(jié)合物的試驗(yàn)可被并入，作為任何新的或已有的試驗(yàn)基質(zhì)形式的附加成分。例如，根據(jù)本發(fā)明該方面所描述的試驗(yàn)形式可以選擇性地包含一個(gè)浸潤有色素原如愈創(chuàng)木脂的第四試驗(yàn)基質(zhì)區(qū)，用以額外地同時(shí)對(duì)血紅素進(jìn)行檢測(cè)。當(dāng)必須按前文所述區(qū)分上下胃腸道出血時(shí)，這是尤其有意義的。
在下述非限制性的實(shí)施例中，更全面地描述了本發(fā)明的更多特性。然而，應(yīng)當(dāng)理解，包括下列描述僅是為了舉例說明本發(fā)明。
實(shí)施例1層析試驗(yàn)條典型地，免疫層析試驗(yàn)(immunochromatographic test)使用在試驗(yàn)條上干燥的免疫試劑。加在試驗(yàn)條起點(diǎn)的液體樣品流過不同區(qū)，以致對(duì)于陽性結(jié)果，在試驗(yàn)條的上部區(qū)域顯現(xiàn)出一條著色線條。然后試劑和樣品流入試驗(yàn)條頂端的吸收基質(zhì)中。最普通的這種吸收基質(zhì)是吸收紙如印跡紙。
現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這種吸收紙可以被愈創(chuàng)木脂所浸潤，這樣一來，當(dāng)免疫學(xué)試驗(yàn)結(jié)束后向吸收基質(zhì)加入顯色溶液，可以(a)檢查可能會(huì)引起免疫學(xué)試驗(yàn)抑制的高水平血液；(b)檢查下胃腸道出血。
或者，可以將浸潤愈創(chuàng)木脂的紙帶插在試驗(yàn)條的上部區(qū)，位于免疫學(xué)檢測(cè)區(qū)和吸收基質(zhì)之間。


圖1描述了適合于根據(jù)本發(fā)明方法之應(yīng)用的試驗(yàn)基質(zhì)。起始區(qū)和浸潤有標(biāo)記抗體(如與膠體金粒子結(jié)合的抗珠蛋白抗體)的第二區(qū)第一部分由同一材料做成，該材料是一種傳導(dǎo)性(conductive)紙(Ahlstrom1281)。固定捕獲抗體的第二區(qū)第二部分由微孔(Millipore)硝酸纖維素制成。典型地，在該區(qū)還包括一功能控制線。可用色素原直接浸潤第三區(qū)(吸收槽)，也可浸潤第二區(qū)與第三區(qū)之間的紙橋。
實(shí)施例2高濃度血的檢測(cè)在免疫學(xué)試驗(yàn)緩沖液中，將血液以1∶100、1∶1000和1∶10000稀釋。該緩沖液使紅細(xì)胞裂解，以致血紅蛋白被釋放到溶液中，將稀釋的血液樣品加至微量滴定板的孔中。包括三個(gè)只含緩沖液的陰性對(duì)照孔。
調(diào)整免疫試驗(yàn)條(Enterix OBT)，以使該帶頂端的吸收紙通過導(dǎo)液接觸(liquid conductive contact)與源于愈創(chuàng)木脂試驗(yàn)的愈創(chuàng)木脂紙(Hemoccult Sensa，Smithkline Diagnostics Inc.，USA)相重疊。將調(diào)整好的試驗(yàn)條加入微孔中，產(chǎn)生如下結(jié)果血液稀釋結(jié)果 1∶100 1∶10001∶10,000緩沖液免疫學(xué) 很弱的陽性(前帶) 陽性 強(qiáng)陽性 陰性(x3)愈創(chuàng)木脂 很強(qiáng)的陽性 陽性 不明確的陽性 陰性(x3)實(shí)施例3在人血紅蛋白(Hb)的免疫學(xué)層析分析中使用第三(抗原)線的實(shí)驗(yàn)示范第三線的目的是區(qū)別由于前帶(高血紅蛋白濃度)產(chǎn)生的低信號(hào)強(qiáng)度和由于低血紅蛋白濃度產(chǎn)生的低信號(hào)強(qiáng)度。制備含第三(Hb)線的試驗(yàn)條離心血液分離紅細(xì)胞，然后用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌紅細(xì)胞一次，以除去殘余的血清成分。然后用蒸餾水1/10稀釋紅細(xì)胞使之裂解。裂解的細(xì)胞用作第三線的Hb來源，并將其加在免疫學(xué)層析試驗(yàn)條(Agen，Brisbane，澳大利亞，用于檢測(cè)人Hb的產(chǎn)品EN12401-021)的捕獲(抗人Hb)和對(duì)照(抗羊抗體)線的下游。作為公開試劑，這些試驗(yàn)條使用與膠體金結(jié)合的羊抗人Hb結(jié)合物。
干燥第三線以使Hb固定在試驗(yàn)條上。試驗(yàn)條的試驗(yàn)稀釋全血(a)1/100于水中＝高Hb濃度(b)1/20,000-低Hb濃度當(dāng)用試驗(yàn)條測(cè)試這兩種Hb濃度時(shí)，結(jié)果顯示如下(按可見信號(hào)強(qiáng)度記錄)(a)高Hb(b)低Hb線1＝捕獲線(抗Hb) 弱 弱線2＝對(duì)照線(抗羊) 強(qiáng) 強(qiáng)線3＝Hb 弱 強(qiáng)結(jié)論第三線的包括使得可區(qū)別高和低抗原(Hb)濃度引起的弱檢測(cè)(捕獲)信號(hào)。
實(shí)施例4篩檢未形成復(fù)合物的結(jié)合物的抗原區(qū)免疫學(xué)篩檢和非免疫學(xué)篩檢的結(jié)合若將實(shí)施例1和實(shí)施例2公開的特性結(jié)合在一起，沿試驗(yàn)條出現(xiàn)如下檢測(cè)區(qū)線1＝捕獲抗體(抗Hb)線2＝對(duì)照抗體(抗羊抗體)線3＝分析物(Hb)線/區(qū)4＝檢測(cè)血紅素的愈創(chuàng)木脂(或類似物)然后這將可以區(qū)分下列情況條件線1 線2 線3 線4(抗Hb) (抗結(jié)合物) (Hb) (愈創(chuàng)木脂)無血液 -+ + -血液1.上胃腸道 -+ + +2.下胃腸道(a)較低[HB] ++ + +(+/-)(b)很高[HB] -+ - +本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，本文描述的發(fā)明除了那些具體描述的內(nèi)容外可進(jìn)行變化和修改。應(yīng)理解，本發(fā)明包括所有這些變化和修改。本發(fā)明也包括本說明書中單獨(dú)或集中地提及的或指明的所有步驟、特征、組合物和化合物，以及任何兩個(gè)或更多所述步驟或特征的任何和全部組合。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)生物樣品中血液存在的方法，所述方法包含步驟(i)將生物樣品施加至包含多個(gè)區(qū)的試驗(yàn)基質(zhì)的第一區(qū)；(ii)允許所述生物樣品流至所述試驗(yàn)基質(zhì)的第二區(qū)，其中在足以形成珠蛋白-抗珠蛋白復(fù)合物的時(shí)間和條件下，使所述樣品與抗珠蛋白免疫相互作用分子接觸，并檢測(cè)所述珠蛋白-抗珠蛋白復(fù)合物；和(iii)允許所述生物樣品流至所述試驗(yàn)基質(zhì)的第三區(qū)，其中在色素原足以檢測(cè)血紅素的時(shí)間和條件下，使所述樣品與所述色素原或其功能等同物接觸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述色素原是指愈創(chuàng)木脂、四甲基聯(lián)苯胺或正聯(lián)甲苯胺。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述色素原是愈創(chuàng)木脂。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3的方法，其中所述試驗(yàn)基質(zhì)是層析條。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述免疫相互作用分子是抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5之任一項(xiàng)的方法，其中所述生物樣品是胃腸樣品。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述胃腸樣品是大便樣品。
8.一種檢測(cè)下胃腸出血的方法，所述方法包含步驟(i)將胃腸樣品施加至包含多個(gè)區(qū)的試驗(yàn)基質(zhì)的第一區(qū)；(ii)允許所述樣品流至所述試驗(yàn)基質(zhì)的第二區(qū)，其中在足以形成珠蛋白-抗珠蛋白復(fù)合物的時(shí)間和條件下，使所述樣品與抗珠蛋白免疫相互作用分子接觸，并檢測(cè)所述珠蛋白-抗珠蛋白復(fù)合物；和(iii)允許所述樣品流至所述試驗(yàn)基質(zhì)的第三區(qū)，其中在色素原足以檢測(cè)血紅素的時(shí)間和條件下，使所述樣品與所述色素原或其功能等同物接觸；其中陽性血紅素結(jié)果加上陽性珠蛋白結(jié)果指示下胃腸道出血。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述色素原是愈創(chuàng)木脂、四甲基聯(lián)苯胺或正聯(lián)甲苯胺。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述色素原是愈創(chuàng)木脂。
11.根據(jù)權(quán)利要求8-10的方法，其中所述試驗(yàn)基質(zhì)是層析條。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述免疫相互作用分子是抗體。
13.根據(jù)權(quán)利要求8-12之任一項(xiàng)的方法，其中所述胃腸樣品是大便樣品。
14.一種檢測(cè)上胃腸道出血的方法，所述方法包含步驟(i)將胃腸樣品施加至包含多個(gè)區(qū)的試驗(yàn)基質(zhì)的第一區(qū)；(ii)允許所述樣品流至所述試驗(yàn)基質(zhì)的第二區(qū)，其中在足以形成珠蛋白-抗珠蛋白復(fù)合物的時(shí)間和條件下，使所述樣品與抗珠蛋白免疫相互作用分子接觸，并檢測(cè)所述珠蛋白-抗珠蛋白復(fù)合物；和(iii)允許所述樣品流至所述試驗(yàn)基質(zhì)的第三區(qū)，其中在色素原足以檢測(cè)血紅素的時(shí)間和條件下，使所述樣品與所述色素原或其功能等同物接觸；其中陽性血紅素結(jié)果加上陽性珠蛋白結(jié)果指示下胃腸道出血。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所述色素原是愈創(chuàng)木脂、四甲基聯(lián)苯胺或正聯(lián)甲苯胺。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述色素原是愈創(chuàng)木脂。
17.根據(jù)權(quán)利要求14-16的方法，其中所述試驗(yàn)基質(zhì)是層析條。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述免疫相互作用分子是抗體。
19.根據(jù)權(quán)利要求14-18之任一項(xiàng)的方法，其中所述胃腸樣品是大便樣品。
20.一種診斷其癥狀包括出血的疾病的方法，所述方法包含步驟(i)將生物樣品施加至包含多個(gè)區(qū)的試驗(yàn)基質(zhì)的第一區(qū)；(ii)允許所述生物樣品流至所述試驗(yàn)基質(zhì)的第二區(qū)，其中在足以形成珠蛋白-抗珠蛋白復(fù)合物的時(shí)間和條件下，使所述樣品與抗珠蛋白免疫相互作用分子接觸，并檢測(cè)所述珠蛋白-抗珠蛋白復(fù)合物；和(iii)允許所述生物樣品流至所述試驗(yàn)基質(zhì)的第三區(qū)，其中在色素原足以檢測(cè)血紅素的時(shí)間和條件下，使所述樣品與所述色素原或其功能等同物接觸。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中所述色素原是愈創(chuàng)木脂、四甲基聯(lián)苯胺或正聯(lián)甲苯胺。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中所述色素是愈創(chuàng)木脂。
23.根據(jù)權(quán)利要求20-22的方法，其中所述試驗(yàn)基質(zhì)是層析條。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中所述免疫相互作用分子是抗體。
25.根據(jù)權(quán)利要求20-24之任一項(xiàng)的方法，其中所述疾病是直腸結(jié)腸癌，而且所述生物樣品是胃腸樣品。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中所述胃腸樣品是大便樣品。
27.一種檢測(cè)生物樣品中分析物存在的方法，所述方法包含步驟(i)將生物樣品施加至包含多個(gè)區(qū)的試驗(yàn)基質(zhì)的第一區(qū)；(ii)允許所述生物樣品流至所述試驗(yàn)基質(zhì)的第二區(qū)，其中在足以形成分析物-抗分析物復(fù)合物的時(shí)間和條件下，使所述樣品與抗分析物免疫相互作用分子接觸，固定所述復(fù)合物，并通過用抗分析物免疫相互作用結(jié)合物接觸所述分析物來檢測(cè)所述復(fù)合物；和(iii)允許未形成復(fù)合物的結(jié)合物流至所述試驗(yàn)基質(zhì)的第三區(qū)，其中檢測(cè)所述未形成復(fù)合物的結(jié)合物。
28.一種檢測(cè)生物樣品中分析物存在的方法，所述方法包含步驟(i)將生物樣品施加至包含多個(gè)區(qū)的試驗(yàn)基質(zhì)的第一區(qū)；(ii)允許所述生物樣品流至所述試驗(yàn)基質(zhì)的第二區(qū)，其中在足以形成分析物-抗分析物復(fù)合物的時(shí)間和條件下，使所述樣品與抗分析物免疫相互作用分子接觸，固定所述復(fù)合物，并通過用抗分析物免疫相互作用結(jié)合物接觸所述分析物來檢測(cè)所述復(fù)合物；和(iii)允許未形成復(fù)合物的結(jié)合物流至所述試驗(yàn)基質(zhì)的第三區(qū)，其中在足以形成分析物-結(jié)合物復(fù)合物的時(shí)間和條件下，使所述未形成復(fù)合物的結(jié)合物與固定于所述第三區(qū)的所述分析物接觸，并檢測(cè)所述復(fù)合物。
29.根據(jù)權(quán)利要求27或28的方法，其中將步驟(ii)中所獲得的檢測(cè)結(jié)果相對(duì)于步驟(iii)中所獲得的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中(a)在步驟(ii)和步驟(iii)中均為強(qiáng)陽性檢測(cè)結(jié)果指示高分析物濃度；(b)相對(duì)于步驟(iii)中較強(qiáng)的陽性檢測(cè)結(jié)果，步驟(ii)中為較弱的陽性檢測(cè)結(jié)果，指示低分析物濃度；(c)步驟(ii)和步驟(iii)中均為弱陽性檢測(cè)結(jié)果，指示很高的分析物濃度；和(d)步驟(ii)和步驟(iii)中均無可檢測(cè)的結(jié)果，指示極高的分析物濃度。
31.根據(jù)權(quán)利要求27-30之任一項(xiàng)的方法，其中所述免疫相互作用分子是抗體。
32.根據(jù)權(quán)利要求27-31之任一項(xiàng)的方法，其中所述分析物是血液。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中所述生物樣品是胃腸樣品。
34.根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其中所述胃腸樣品是大便樣品。
35.一種檢測(cè)生物樣品中血液存在的方法，所述方法包含步驟(i)將該生物樣品施加至包含多個(gè)區(qū)的試驗(yàn)基質(zhì)的第一區(qū)；(ii)允許所述生物樣品流至所述試驗(yàn)基質(zhì)的第二區(qū)，其中在足以形成血紅蛋白-抗血紅蛋白復(fù)合物的時(shí)間和條件下，使所述樣品與抗血紅蛋白免疫相互作用分子接觸，并通過用抗血紅蛋白免疫相互作用結(jié)合物接觸所述血紅蛋白來檢測(cè)所述復(fù)合物；(iii)允許所述生物樣品和所述未形成復(fù)合物的結(jié)合物流至所述試驗(yàn)基質(zhì)的第三區(qū)，其中在可以形成血紅蛋白-結(jié)合物復(fù)合物的時(shí)間和條件下，使所述未形成復(fù)合物的結(jié)合物與固定于所述第三區(qū)的所述血紅蛋白接觸，并檢測(cè)所述復(fù)合物；和(iv)允許所述生物樣品流至所述試驗(yàn)基質(zhì)的第四區(qū)，其中在色素原足以檢測(cè)血紅素的時(shí)間和條件下，使所述樣品與所述色素原或其功能等同物接觸。
36.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其中所述生物樣品是胃腸樣品。
37.根據(jù)權(quán)利要求36的方法，其中所述胃腸樣品是大便樣品。
38.根據(jù)權(quán)利要求35-37之任一項(xiàng)的方法，其中所述免疫相互作用分子是抗體，且所述色素原是愈創(chuàng)木脂。
39.根據(jù)權(quán)利要求35-38之任一項(xiàng)的方法，其中將步驟(ii)的檢測(cè)結(jié)果相對(duì)于步驟(iii)的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。
全文摘要
一般地,本發(fā)明涉及一種檢測(cè)生物樣品中分析物存在的方法。第一種檢測(cè)生物樣品中血液的方法涉及將樣品施加至試驗(yàn)基質(zhì)的第一區(qū),在試驗(yàn)基質(zhì)的第二區(qū)用一個(gè)免疫學(xué)試驗(yàn)檢測(cè)珠蛋白或血紅蛋白,在試驗(yàn)基質(zhì)的第三區(qū)用基于色素原的試驗(yàn)檢測(cè)血紅素。該方法能區(qū)分上下胃腸道出血,并可用于診斷胃腸道疾病,特別是下胃腸道疾病如直腸結(jié)腸癌。公開的第二種方法涉及將生物樣品施加到試驗(yàn)基質(zhì)的第一區(qū),允許該樣品流至第二區(qū),在此它接觸抗分析物免疫相互作用分子和標(biāo)記的抗分析物免疫相互作用結(jié)合物。在該第二區(qū),固定和檢測(cè)任何形成的分析物－抗分析物復(fù)合物,允許任何未形成復(fù)合物的標(biāo)記的抗分析物免疫相互作用結(jié)合物流至第三區(qū)并在此被檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N33/52GK1334924SQ99814642
公開日2002年2月6日 申請(qǐng)日期1999年11月17日 優(yōu)先權(quán)日1998年11月17日
發(fā)明者H·M·錢德勒, M·希納特拉 申請(qǐng)人:恩特里克斯公司