高效液相色譜法檢測(cè)卷煙煙氣中角鯊烯檢測(cè)的樣品處理方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及卷煙煙氣中成分的檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，設(shè)及一種高效液相色譜 法檢測(cè)卷煙煙氣中角整締檢測(cè)的樣品處理方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 角整締最初是從整魚的肝油中發(fā)現(xiàn)的，1914年被命名為Squalene，其化學(xué)名稱為 2,6,10,15,19,23-六甲基一2,6,10,14,18,22-二十四碳六締，屬開鏈Ξ祗類化合物。
[0003] 角整締具有提高人體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)活性、增強(qiáng)機(jī)體抗氧化性和免疫能 力、改善性功能、抗衰老、抗疲勞、抗腫瘤等多種生理功能，是一種無毒性的具有防病治病作 用的生物活性物質(zhì)。最近研究發(fā)現(xiàn)角整締對(duì)人體還具有解毒作用，可移除組織中的脂溶性 毒素。已有研究表明：在煙絲中添加一定量的角整締，可降低煙氣中幾種有害物質(zhì)和自由基 含量，表明角整締具有獨(dú)特降害作用，目前開發(fā)利用角整締已成為科技界和煙草業(yè)研究的 執(zhí)占。 "、、'、、、〇
[0004] 2014年4月，國(guó)家煙草專賣局下發(fā)關(guān)于加快卷煙降焦減害技術(shù)成果推廣應(yīng)用的通 知（國(guó)煙辦綜[2014]218號(hào)），提出要加大卷煙減害技術(shù)重大專項(xiàng)研究成果的應(yīng)用推廣力度， 要采取針對(duì)性技術(shù)措施加快卷煙降焦減害步伐。為了配合國(guó)家局加快卷煙降焦減害步伐的 重大決策，本申請(qǐng)人在完成中國(guó)煙草總公司2013年度科技面上項(xiàng)目《廣西主流煙氣天然抗 氧化劑角整締的生態(tài)累積與減害研究》（中煙辦[2013]149號(hào))研究基礎(chǔ)上，迫切需要建立一 種可行的適于標(biāo)準(zhǔn)的主流煙氣角整締含量的檢測(cè)方法。
[0005] 但是，目前國(guó)內(nèi)外還沒有可參考的煙氣中尤其是主流煙氣中角整締定性和定量的 檢測(cè)方法，因此，在煙草行業(yè)建立烤煙中角整締定性和定量的檢測(cè)方法具有前瞻性，也是十 分必要的。而在煙氣中角整締的檢測(cè)中，良好的樣品前處理方法對(duì)獲得準(zhǔn)確科學(xué)的檢測(cè)結(jié) 果起到關(guān)鍵性作用。在確定的檢測(cè)條件下，采用不同提取劑提取樣品中角整締，其提取效 率、提取操作用時(shí)等因素都是必須考慮的重要因素，各個(gè)因素之間又是相互影響的關(guān)系，目 前未見基于高效液相色譜法檢測(cè)煙葉中角整締的樣品前處理研究報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是填補(bǔ)現(xiàn)有煙氣中角整締的檢測(cè)技術(shù)不足，尤其是適于 高效液相色譜法檢測(cè)煙氣中角整締的樣品前處理方法的不足，提供一種高效液相色譜法檢 測(cè)煙氣(主流煙氣）中角整締的樣品處理方法。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案通過W下技術(shù)方案予W實(shí)現(xiàn)：
[000引提供一種高效液相色譜法檢測(cè)卷煙煙氣中角整締檢測(cè)的樣品處理方法，其特征在 于，包括W下步驟：
[0009] S11.收集煙氣固粒相物并提取:抽吸卷煙，采用濾片收集煙氣固粒相物；
[0010] S12.提取:將收集了煙氣固粒相物劍橋?yàn)V片放入錐形瓶中，加入提取劑，常溫下振 蕩提取，得提取液；
[0011] S13.凈化:取步驟S12所得提取液，進(jìn)行過柱處理，用正己燒洗脫，收集洗脫液，旋 轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用色譜乙臘定容，過0.22WI1濾膜，所得濾液待測(cè)或4°C保存。
[001^ 其中，步驟S12所述提取劑為正己燒；
[0013] 所述過柱是采用硅膠固相萃取柱。
[0014] 其中，S12步驟所述提取劑為氯仿；
[0015] 優(yōu)選地，步驟S11所述抽吸卷煙是按照GB/T 16450標(biāo)準(zhǔn)。步驟S11所述濾片為Φ 9 2mm的劍橋?yàn)V片。
[0016] 優(yōu)選地，步驟S12所述振蕩提取是用搖床m 30轉(zhuǎn)/min振蕩20min。
[0017] 優(yōu)選地，步驟S13所述洗涂的次數(shù)為3次。
[0018] 優(yōu)選地，所述硅膠固相萃取柱的裝柱方法為稱取0.5g硅膠，用適量洗脫液溶解，進(jìn) 行裝柱，硅膠上方加1. Og無水硫酸鋼。
[0019] 基于所述樣品前處理方法，本發(fā)明同時(shí)提供一種高效液相色譜法檢測(cè)主流煙氣中 所含角整締的方法，W甲醇和乙臘為流動(dòng)相，采用填有粒徑扣m的高效固定相的柱色譜分離 技術(shù)，精確吸取10化待測(cè)樣品液注入高效液相色譜儀進(jìn)行色譜分離，用紫外吸收檢測(cè)器，于 210nm波長(zhǎng)處檢測(cè)角整締的吸收值，采用外標(biāo)法，根據(jù)吸收峰面積計(jì)算其含量。
[0020] 所述高效液相色譜法檢測(cè)主流煙氣中所含角整締的方法包括W下步驟：
[0021] S1.樣品經(jīng)前處理得到樣品前處理物；
[0022] S2.配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0023] S3.檢測(cè)：取樣品前處理物經(jīng)過柱處理，收集洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用色譜乙臘定 容，過0.22WI1濾膜，取濾液注入高效液相色譜儀檢測(cè)；
[0024] S4.采用外標(biāo)法，根據(jù)吸收峰面積計(jì)算角整締含量。
[0025] 所述檢測(cè)的檢測(cè)條件為：
[0026] (1)高效液相色譜儀HPLC(AgilentllOO)配紫外檢測(cè)器；
[0027] (2)色譜柱:C18 柱，5ym，4.6X250mm;
[0028] (3)柱溫:20°(：;
[0029] (4)流動(dòng)相類型：甲醇：乙臘(V:V = 70:30);
[0030] (5)流動(dòng)相流速:0.8mL/min;
[0031] (6)檢測(cè)波長(zhǎng)為：210nm;
[0032] (7)進(jìn)樣量：10yL。
[0033] 步驟S2所述配制標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法是準(zhǔn)確稱取O.lg角整締標(biāo)準(zhǔn)品，精確至O.OOOlg， 用乙臘(色譜純)溶解后定容至lOOmL配制成lOOOmg/L的角整締標(biāo)準(zhǔn)溶液，充分振蕩搖勻。所 配標(biāo)準(zhǔn)溶液置于4°C保存，待用。
[0034] 步驟S2所述角整締標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立的方法是:采用系列稀釋法，分別配制成濃度 為0.002，0.01，0.05，0.2，0.5mg/mL的角整締標(biāo)準(zhǔn)溶液于高效液相色譜進(jìn)樣檢測(cè)；W進(jìn)樣濃 度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出角整締濃度與相應(yīng)峰面積的線性回歸方 程。
[0035] 本發(fā)明適用于卷煙主流煙氣中角整締的檢測(cè)。
[0036] 本發(fā)明具有W下有益效果：
[0037] 本發(fā)明針對(duì)卷煙煙氣建立了一種適于高效液相色譜法檢測(cè)煙葉中角整締的樣品 前處理方法，采用正己燒作為提取溶劑，科學(xué)過柱處理，保障了目標(biāo)物的分離效果?；谒?述樣品前處理方法，可建立煙氣中角整締的高效液相色譜法檢測(cè)方法，色譜峰分離較好，具 有準(zhǔn)確、快速、高靈敏、重現(xiàn)性好、回收率高等優(yōu)點(diǎn)。
【附圖說明】
[003引圖1角整締標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0039] 圖2角整締標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖（Img/L角整締標(biāo)樣，峰面積= 41.9)。
[0040] 圖3角整締標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖（5mg/L角整締標(biāo)樣，峰面積= 213.3)。
[0041 ]圖4未經(jīng)凈化處理效果色譜圖（空白對(duì)照）。
[0042] 圖5未經(jīng)凈化處理效果色譜圖（添加40mg/kg角整締樣品）。
[0043] 圖6經(jīng)硅膠凈化樣品的色譜圖（空白對(duì)照）。
[0044] 圖7經(jīng)硅膠凈化樣品的色譜圖（添加40mg/kg角整締樣品）。
[0045] 圖8經(jīng)PSA柱凈化后樣品的色譜圖（空白對(duì)照）。
[0046] 圖9經(jīng)PSA柱凈化后樣品的色譜圖（添加40mg/kg角整締樣品）。
[0047] 圖10用PSA和硅膠復(fù)合柱凈化后樣品的色譜圖（空白對(duì)照）。
[004引圖11用PSA和硅膠復(fù)合柱凈化后樣品的色譜圖（添加40mg/kg角整締樣品）。
[0049] 圖12 C8柱檢測(cè)樣品的色譜圖（流動(dòng)相甲醇：乙臘，5mg/kg角整締標(biāo)樣）。
[0050] 圖13 C8柱檢測(cè)樣品的色譜圖（流動(dòng)相甲醇：乙臘誼白對(duì)照）。
[0051] 圖14 C8柱檢測(cè)樣品的色譜圖（流動(dòng)相甲醇：乙臘，添加40mg/kg角整締的樣品）。
[0052] 圖15 C8柱檢測(cè)樣品的色譜圖（流動(dòng)相乙臘:水，5mg/kg角整締標(biāo)樣）。
[0053] 圖16 C8柱檢測(cè)樣品的色譜圖（流動(dòng)相乙臘:水，空白對(duì)照）。
[0054] 圖17 C8柱檢測(cè)樣品的色譜圖（流動(dòng)相乙臘:水，添加40mg/kg角整締的樣品）。
[00對(duì)圖18 C18柱檢測(cè)樣品的色譜圖（流動(dòng)相甲醇：乙臘，75:25，流速1. OmL/min，柱溫30 °C，波長(zhǎng)210nm，5mg/kg角整締標(biāo)樣）。
[0化6] 圖19 C18柱檢測(cè)樣品的色譜圖（流動(dòng)相甲醇：乙臘，75:25，流速1. OmL/min，柱溫30 °(：，波長(zhǎng)21〇11111，空白對(duì)照）。
[0化7] 圖20 C18柱檢測(cè)樣品的色譜圖（流動(dòng)相甲醇：乙臘，75:25，流速1. OmL/min，柱溫30 °C，波長(zhǎng)21 Onm，添加40mg/kg角整締的樣品）。
[0化引圖21 C18柱檢測(cè)樣品的色譜圖（流動(dòng)相甲醇：乙臘，70:30，流速0.8mL/min，柱溫20 °(：，波長(zhǎng)21011111，空白對(duì)照）。
[0059] 圖22 C18柱檢測(cè)樣品的色譜圖（流動(dòng)相流動(dòng)相甲醇：乙臘，70:30，流速0.8mL/min， 柱溫20°C，波長(zhǎng)210nm，添加40mg/kg角整締的樣品）。
【具體實(shí)施方式】
[0060] 下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明方法。下述實(shí)施例和附圖僅用于示 例性說明，不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。除非特別說明，下述實(shí)施例中使用的試劑原料為常 規(guī)市購或商業(yè)途徑獲得的試劑原料，除非特別說明，下述實(shí)施例中使用的方法和設(shè)備為本 領(lǐng)域常規(guī)使用的方法和設(shè)備。為方便說明，本發(fā)明實(shí)施例中使用的儀器和試劑說明如下，但 并不因此限定本發(fā)明。
[006。儀器：
[0062] (1)高效液相色譜儀HPLC(AgilentllOO)，配備:脫氣累、四元累、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫 箱和紫外檢測(cè)器(美國(guó)Agilent公司）
[0063] (2)全溫控?fù)u床(江蘇金壇市榮華儀器有限公司）
[0064] (3)電子天平(BSA 2245，d = 0.1mg，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）
[0065] (4)旋轉(zhuǎn)真空蒸發(fā)器:ZFQ-3型(上海亞榮生化儀器廠）
[0066] (5)真空抽濾累:S監(jiān)-D虹型(鞏義市予華儀器廠）
[0067] (6)lKA?MS3basic滿旋儀(MS3BS25, IKA)
[006引 （7)RM200A吸煙機(jī)(德國(guó)）
[0069] (8)固相萃取柱(varian)
[0070] (9)各種實(shí)驗(yàn)室通用玻璃器皿 [007U 試劑；
[0072] (1) 99.8 %角整締對(duì)照品（中國(guó)藥檢所）
[0073] (2)甲醇(色譜純）
[0074] (3)乙臘(色譜純）
[00巧](4)正己燒(分析純）
[0076] (5)石油酸(分析純）
[0077] (6)0.22皿有機(jī)濾膜
[007引 （7)凈化劑:PSA(Welc虹加 1)，硅膠(200-300目，青島海洋化工廠）
[0079] (8)商品煙(從廣西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司產(chǎn)品中隨機(jī)性抽?。?br>[0080] 實(shí)施例1
[0081 ] 1.角整締標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制
[0082] 準(zhǔn)確稱取O.lg角整締標(biāo)準(zhǔn)品，精確至O.OOOlg，用乙臘（色譜純）溶解后定容至 lOOmL配制成lOOOmg/L角整締標(biāo)準(zhǔn)溶液，充分振蕩搖勻。所配標(biāo)準(zhǔn)溶液置于4°C保存。
[0083] 2.標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
[0084] 采用系列稀釋法，分別配制濃度為0.5，l，2,5，10mg/L的角整締標(biāo)準(zhǔn)溶液于高效液 相色譜上檢測(cè)；W進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1所示。求出角整 締濃度與相應(yīng)峰面積的線性回歸方程，7 = 44.61^-3.2993，護(hù)=0.9996。標(biāo)準(zhǔn)角整締色譜圖 見圖2和圖3所不。
[00化]3.液相色譜條件
[00化](1)高